食品微生物檢驗中菌落總數(shù)測定的注意事項

李立華

（洛陽市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗測試中心，河南 洛陽 471009）

相關(guān)實驗人員在對細菌總數(shù)進行檢測的情況下，采取的國標法通常是采取以下兩種方式一起結(jié)合形成的：一種是計數(shù)瓊脂傾注皿培養(yǎng)計數(shù)法；另一種是測試紙片法。然而在具體工作的過程中，樣品里面經(jīng)常會存在顆粒、殘留物質(zhì)等不容易發(fā)生乳化的物質(zhì)，這是因為這些物質(zhì)沒有較大的顆粒狀，倒入到平皿中，這個時候就會摻雜著類似于瓊脂深層的相關(guān)菌落中，經(jīng)常會和細菌菌落區(qū)別而認識錯誤，這樣也在某種程度上對細菌計數(shù)的精準性帶來不利影響。

一、大腸菌群測定的一些要點

大腸菌群的發(fā)酵試驗中要用到小倒管，主要用來觀察氣泡的出現(xiàn)。但是實驗中經(jīng)常會出現(xiàn)還未接種樣液，小倒管內(nèi)就出現(xiàn)氣泡，這樣會影響結(jié)果的判斷?，F(xiàn)列舉出出現(xiàn)這種現(xiàn)象的幾種原因及對策：

（一）小倒管的口太小

在滅菌過程中，高壓會將培養(yǎng)基壓進小倒管，使空氣排出，但如果小倒管開口過小，空氣不容易出來，培養(yǎng)基也不容易進去，容易導致氣泡殘留在管內(nèi)影響觀察，若是這種情況，可以改用開口較大的V形管代替。

（二）小倒管里面殘留有水珠

因為小倒管開口很小，清洗后內(nèi)部的水不容易干燥完全。這樣會導致滅菌過程中培養(yǎng)基無法進去，使用時要注意放置小倒管前要將其內(nèi)部的水甩干。

（三）硅膠塞將試管口塞得過緊

硅膠塞將試管口塞得過緊，會使在滅菌過程中試管內(nèi)外的壓力不一致，滅菌鍋升溫升壓時，鍋內(nèi)壓力大于試管內(nèi)壓力，壓力不夠?qū)⑴囵B(yǎng)基完全壓進小倒管，于是就會殘留氣泡。塞子過緊還易導致滅菌鍋降溫時，鍋內(nèi)壓力小于試管內(nèi)壓力，容易使試管內(nèi)培養(yǎng)基噴出，培養(yǎng)基報廢。解決的辦法是，硅膠塞不要塞得過緊或者選用更透氣的棉塞。

（四）滅菌完畢后太快打開滅菌鍋

當滅菌鍋壓力表示數(shù)為0而溫度表示數(shù)還高與室溫時，不要打開滅菌鍋。因為打開鍋蓋瞬間，鍋內(nèi)大量熱量散出，溫度突然降低，試管內(nèi)溫度也隨著降低，導致管內(nèi)氣壓減小，沸點降低，部分培養(yǎng)基會汽化留在小倒管內(nèi)。解決的辦法是，等滅菌鍋內(nèi)氣壓和溫度都降到與室溫一致或相差不大時再打開滅菌鍋，或者等試管冷卻后放在4℃冰箱內(nèi)，利用溫度差，將小倒管中氣泡排出。另外，滅菌完畢后過早打開滅菌鍋還有可能造成培養(yǎng)基或者其他液體試劑噴濺出來，導致滅菌失敗。

（五）滅菌鍋壓力達不到要求

滅菌鍋壓力達不到標準要求，就不能強行將空氣從小倒管中排出，導致氣泡殘留，而壓力達不到，滅菌溫度也相應的會降低，會導致滅菌不徹底。解決的辦法是檢查修理滅菌鍋。

（六）培養(yǎng)基質(zhì)量也會引起小倒管中殘留氣泡

用裝有水的試管與裝有培養(yǎng)基的試管作對照，若裝有水的試管內(nèi)小倒管正常排氣，則可考慮培養(yǎng)基中含有高溫高壓產(chǎn)氣成分，導致小倒管中殘留氣泡。解決的辦法是更換培養(yǎng)基。遇到小倒管產(chǎn)氣時要仔細分析原因，切不可將試管大角度傾斜或者顛倒排氣，這樣會導致試管口和試管塞污染及培養(yǎng)基流出。

二、菌落總數(shù)測定的一些要點

（一）稀釋液的選用

國標上列出的稀釋液有生理鹽水和磷酸鹽緩沖液兩種可選用，生理鹽水能維持細胞良好的滲透壓，有利于菌的生長，磷酸鹽緩沖液具有較強的緩沖能力，因此也可為細胞維持一個較為穩(wěn)定的pH環(huán)境，避免細胞受損害。對于一般的樣品可以使用生理鹽水，對于偏酸偏堿的樣品用磷酸鹽緩沖液能防止培養(yǎng)基受樣品酸堿影響從而引起不良的性能。

（二）移液管的使用

接種時使用移液管要注意，從吸管筒內(nèi)取出滅菌吸管時，不要將吸管尖端碰著其他仍留在容器內(nèi)的吸管的外露部分；而且吸管在進出裝有稀釋液的玻璃瓶和試管時，也不要觸及瓶口及試管口的外側(cè)部分；因為這些部分都可能接觸過手或其他沾污物。而接種后的廢棄移液管尖端及外壁還有殘留樣品溶液，要立即將尖端插入裝有消毒液的桶內(nèi)，以防止微生物氣溶膠產(chǎn)生，消毒液可選用0.1%的新潔爾滅溶液。

（三）空白對照的接種

空白對照分為幾種做法，一種是空白平板，直接加20ml的瓊脂，另一種是先在平板里面加1ml滅菌后稀釋液再加20ml的瓊脂，這樣才能檢驗出平板和稀釋液是否滅菌徹底，直接加瓊脂的是為了監(jiān)測瓊脂是否有污染，先加入1mL稀釋液的是為了監(jiān)測稀釋液有沒有污染。此外還有在操作臺上放置瓊脂平板，將一只裝有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿蓋打開，直到操作結(jié)束，為檢驗操作過程及環(huán)境中是否污染。還有一種是樣品的空白，樣品空白只針對某些接種后有顆粒狀物質(zhì)的樣品，可以接種樣品后將此平板放置于4℃冰箱內(nèi)，等樣品正常培養(yǎng)后同時取出觀察，計數(shù)時作為空白對照，以區(qū)分菌落和顆粒。另外還有一種區(qū)分食品顆粒與菌落的方法是，在已熔化而保溫在45℃水浴內(nèi)的平板計數(shù)瓊脂中，按100ml加1ml0.5%氯化三苯四氮唑（TTC）水溶液，培養(yǎng)后食品顆粒不變色，細菌為紅色。

（四）培養(yǎng)基的傾注

在加入樣液后，應在15min內(nèi)傾注培養(yǎng)基，這樣做的原因是，若時間過長，有可能使樣液干燥貼在平板上，傾注培養(yǎng)基后不易搖開，樣液在培養(yǎng)基內(nèi)分布不均，易產(chǎn)生片狀菌落，不易計數(shù)。檢樣與培養(yǎng)基混勻時，可先向一個方向旋轉(zhuǎn)，然后再向相反方向旋轉(zhuǎn)。旋轉(zhuǎn)中應防止混合物濺到皿邊的上方。培養(yǎng)基凝固后，應盡快將平皿翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)，保持瓊脂表面干燥，以避免菌落蔓延生長，影響計數(shù)。2.5菌落總數(shù)的計算

計算菌落總數(shù)時，如果遇到高稀釋度的平板上菌落比低稀釋度平板上菌落少，則說明檢驗過程存在失誤或是樣品中含有抑菌物質(zhì)，這樣的結(jié)果不可用于報告，應綜合判斷后再行檢驗。如果三個稀釋度上菌落數(shù)都超過300，不能以多不可計作為報告，應在最高稀釋度的平板上任意選取單位面積，計算菌落數(shù)，然后再乘以平板面積得出平板上的總菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)報告結(jié)果。

依據(jù)當前新國標法的有關(guān)政策下，相關(guān)實驗人員利用平板計數(shù)瓊脂的方法將原來的營養(yǎng)瓊脂加以替代，并且在相關(guān)標準的條件下指出：倘若食品里面存在已經(jīng)受損的微生物細胞，相關(guān)實驗人員還需要對培養(yǎng)基在受損微生物進行恢復內(nèi)容具有的適用性引起必要的重視。在這里筆者認為，主要因素可能是由于在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基里面預防損傷細菌生長有存在較多的因素，比如PH值等，這樣也會在某種程度上對損傷細菌的生長情況帶來直接的影響。

三、結(jié)語

相關(guān)實驗人員通過檢驗可以得知：樣品在菌落不多的情況下，菌落總數(shù)計數(shù)沒有較大的差異性。對于比較嚴重的樣品來說，在平皿計數(shù)超過200的情況下，就無法保證可以精準的檢測。而就TTC平板而言，盡管每平皿都已經(jīng)超過300，但是依然可以做好準確的計數(shù)，和相關(guān)調(diào)查基本相似。筆者建議相關(guān)部門在對國標進行修訂的時候，就容易出現(xiàn)顆粒的樣品亦或是受到嚴重污染的樣品，在計數(shù)平板添加0.1%TTC，這樣可以將檢驗的檢出水平加以提升。依據(jù)關(guān)于菌落總數(shù)測定的要求來看，主要原理是相關(guān)實驗人員把營養(yǎng)瓊脂、凝膠等有關(guān)物質(zhì)加載到試紙片上面，通過一系列環(huán)節(jié)以后，細菌菌落在測試片表面上就會出現(xiàn)紅色菌斑的情況，并依據(jù)有關(guān)報告結(jié)果可以得到諸多優(yōu)勢，例如快速、較強的可行性。缺點就是會花費較多的資金。