干酪中抗氧化肽的研究進(jìn)展

宋雪梅，梁琪，張炎，吳晗

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730070；2.甘肅省功能乳品工程實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730070）

0 引 言

食品中活性氧自由基將削弱食品的感官性狀，導(dǎo)致食品品質(zhì)下降、貨架期縮短。雖然通過加入人工合成的抗氧化劑能夠改善食品的感官性狀，但是對人體存在潛在危害。在這情況下，食源性抗氧化劑由于具有低毒等特點(diǎn)，受到關(guān)注?？寡趸氖且环N小分子量短肽，含有豐富的必需氨基酸，活性較高，易于被機(jī)體吸收，具有阻止自由基形成、清除自由基和活性氧等作用。大量研究表明：提高抗氧化肽攝入量可以降低疾病發(fā)生率[1-2]。

干酪是全球貿(mào)易量最大的乳制品之一，營養(yǎng)價值高，富含蛋白質(zhì)、短鏈脂肪酸、礦物質(zhì)和維生素等，因此，也是許多生物活性物質(zhì)的重要來源。干酪中發(fā)現(xiàn)的生物活性物質(zhì)有功能性多肽、脂肪酸、有機(jī)酸、共軛亞油酸等。其中，具有抗氧化活性的多肽已在Cheddar[3]、Parmigiano-R eggiano[4]、農(nóng)家干酪[5]中發(fā)現(xiàn)。干酪抗氧化肽不但能阻止其貯藏過程中氧化反應(yīng)的發(fā)生，增加干酪營養(yǎng)價值[6]，且在減少機(jī)體心血管疾病發(fā)生，抑制腹部脂肪積累，阻止代謝綜合證產(chǎn)生等方面也具有作用[7]。因此，本文主要就干酪抗氧化肽的形成機(jī)理、提取方法、形成的影響因素及特征等進(jìn)行綜合闡述，以期為提高干酪抗氧化性，開發(fā)功能性干酪提供參考。

1 干酪抗氧化肽的形成機(jī)理

大多數(shù)生物活性肽在原蛋白或沒有被激活時無活性，只有通過胃腸系統(tǒng)被胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶酶解后或者被乳酸菌的蛋白酶和肽酶所降解后，才能顯示生物活性。αs-酪蛋白，β-酪蛋白、κ-酪蛋白經(jīng)胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶降解后，所有蛋白降解產(chǎn)物的抗氧化性呈增加趨勢，且κ-酪蛋白降解的肽的抗氧化性增加了3倍[6]。Stracchino軟質(zhì)干酪經(jīng)胃腸系統(tǒng)消化發(fā)現(xiàn)，源自β-酪蛋白的六肽EAMAPK和AVPYPQ含量高，且抗氧化活性強(qiáng)[8]。不同菌種Mozzarella干酪的蒸餾水、p H 4.6醋酸緩沖液和12%三氯乙酸可溶性肽在模擬胃腸液環(huán)境下均具有一定抗氧化活性[9]。

除此之外，干酪本身在生產(chǎn)過程中也產(chǎn)生抗氧化肽。酶凝干酪，需經(jīng)歷2周（如Mozzarella干酪）甚至2年（如Parmigiano-Reggiano干酪和Cheddar干酪）以上成熟。干酪成熟對干酪特有風(fēng)味和品質(zhì)的形成具有重要影響。在此過程中，酪蛋白在纖溶酶、殘余凝乳酶等作用下降解為中等分子量的寡肽，再在乳酸菌所含有的蛋白酶和肽酶作用下不斷生成小分子多肽。多肽不斷被降解，而另一些多肽又不斷形成和積累[10-11]。源自乳酸菌參與蛋白質(zhì)降解的物質(zhì)有3類，分別是降解酪蛋白的細(xì)胞壁蛋白酶、運(yùn)送多肽到細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和降解寡肽為小分子多肽和游離氨基酸的細(xì)胞內(nèi)肽酶[12]。已發(fā)現(xiàn)5種細(xì)胞壁蛋白酶，對疏水性酪蛋白具有強(qiáng)烈的傾向性。伴隨著干酪成熟過程中的蛋白質(zhì)降解，特異性生物活性多肽如抑菌肽、降血壓肽、抗氧化肽等被釋放。一些生物活性肽能夠抵制肽酶消化，被機(jī)體吸收后，進(jìn)入血管，對機(jī)體產(chǎn)生有益作用[13]。相關(guān)研究表明已在Cheddar[3]、Coalho[14]、Quesofresco[15]、Parmigiano-Reggiano[4]等干酪中發(fā)現(xiàn)了具有抗氧化作用的生物活性肽。

綜上所述，除了干酪經(jīng)人體消化后產(chǎn)生抗氧化肽外，干酪中抗氧化肽主要源自其成熟過程中的蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物，影響蛋白質(zhì)降解的因素如發(fā)酵劑、凝乳酶、干酪的理化性質(zhì)如pH、鹽含量、成熟溫度等均影響到干酪中抗氧化肽的形成與積累。

2 干酪抗氧化肽的提取

多肽濃度越高,對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（簡稱DPPH）自由基的清除能力越強(qiáng)[16]。干酪抗氧化性與其抗氧化肽有關(guān)。目前，干酪抗氧化肽的提取主要采用以下方法：直接蒸餾水提取，或蒸餾水提取后再將pH調(diào)整到4.6的提取法；pH 4.6醋酸緩沖液提取法；12%三氯乙酸提取法；乙醇提取法；磷酸緩沖溶液提取后再用鹽酸將p H調(diào)到4.6的提取法。

研究發(fā)現(xiàn)，Blue、Danablue、Pont-l'Eveque、Munster、Camembert和Brie等干酪水溶性肽和70%乙醇可溶性肽均具有顯著抗氧化活性[17]。巴西Coalho干酪水溶多肽提取物具有抗氧化活性[14]。馬玲等研究了不同菌種Mozzarella干酪蒸餾水、p H 4.6醋酸緩沖液和12%三氯乙酸提取物的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)12%三氯乙酸提取物中多肽含量最高，其抗氧化活性最強(qiáng)[18]。

MEISTER MEIRA等通過對Roquefort干酪p H 7.0磷酸鹽提取，1 mol/L鹽酸沉淀后的上清液質(zhì)譜鑒定，發(fā)現(xiàn)源自β-酪蛋白的HKEMPFPKYPVQPF具有抗氧化活性，YQEPVLGP對3-乙基苯并噻唑-6-磺酸（簡稱ABTS）自由基具有清除作用[19]。MUSHTAQ等采用類似方法提取的不同溫度儲藏的Himalayan干酪中含有水溶性多肽的提取物對DPPH、ABTS自由基均具有清除作用[20]。目前，在干酪抗氧化作用研究中，較多采用了以蒸餾水或者磷酸緩沖溶液作為提取溶劑，再將p H調(diào)整到4.6的提取方法獲得提取物，水溶性提取物中含有具有抗氧化作用的多肽，即抗氧化肽粗品。

3 影響干酪抗氧化肽形成的因素

3.1 發(fā)酵劑

生產(chǎn)發(fā)酵乳制品所用的發(fā)酵劑有嗜熱鏈球菌、乳酸乳球菌、保加利亞乳桿菌等。在干酪生產(chǎn)中，發(fā)酵劑除了參與凝乳外，還參與干酪成熟。發(fā)酵劑含有的細(xì)胞壁蛋白酶、肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、胞內(nèi)肽酶等參與蛋白質(zhì)降解，使之產(chǎn)生一些具有抗氧化作用的多肽。發(fā)酵劑是影響干酪抗氧化肽產(chǎn)生的主要因素之一。

不同種屬微生物對抗氧化肽形成產(chǎn)生具有較大影響，抗氧化肽的形成具有菌株特異性[21]，L.delbrueckii subsp.Bulgaricus發(fā)酵的酸奶中發(fā)現(xiàn)了源自κ-酪蛋白（f96-106）的抗氧化肽Ala-Arg-His-Pro-His-Pro-His-Leu-Ser-Phe-Met[22]，L.helveticus和Sac.Cerevisiae發(fā)酵的乳飲料中發(fā)現(xiàn)了抗氧化肽SKVLPVPQ[23]，不同菌種Mozzarella干酪成熟過程中水溶性肽提取物的抗氧化活性存在差異[9]。分別添加了Lactobacillus casei ssp.casei 30和Lactobacillus paracasei ssp.paracasei 22的Cheddar干酪中的抗氧化肽活性較強(qiáng)[24]。

干酪中添加益生菌能夠進(jìn)一步增加抗氧化肽。分別添加了干酪乳桿菌、植物乳桿菌、短乳桿菌等益生菌的Himalayan干酪（Kalari）的水溶性多肽提取物都顯示具有較強(qiáng)的抗氧化活性[20]。益生菌發(fā)酵乳桿菌ME-3 Pikantne干酪的水溶性多肽提取物具有較強(qiáng)抗氧化活性[25]。益生菌鼠李糖乳桿菌Cheddar干酪在成熟末，其水溶性多肽提取物對DPPH自由基清除力和還原力分別增加了7.46%和17.58%[26]。加入干酪乳桿菌后，農(nóng)家干酪中水溶性多肽的抗氧化活性顯著提高[27]。加入了植物乳桿菌和干酪乳桿菌Cheddar干酪的水溶性多肽提取物抗氧化活性也顯著提高[28]。所以，在干酪生產(chǎn)過程中，通過合理優(yōu)化發(fā)酵劑或添加不同特性的益生菌，能夠生產(chǎn)出抗氧化肽含量高和活性強(qiáng)的干酪。

3.2 凝乳酶

酪蛋白的胃蛋白酶產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了具有清除自由基的活性多肽[29]。比較酪蛋白被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶降解后多肽對羥基自由基的清除能力，發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶降解酪蛋白的多肽具有最強(qiáng)抗氧化活性[30]。在添加了凝乳酶、無發(fā)酵劑的新鮮山羊乳干酪中也發(fā)現(xiàn)了抗氧化肽[31]。動物性凝乳酶（95%凝乳酶和5%牛胃蛋白酶）、植物性凝乳酶（Cynara cardunculus）和微生物性凝乳酶（Mucor miehei）制作的Burgos干酪進(jìn)行DPPH自由基清除和金屬離子螯合試驗(yàn)時發(fā)現(xiàn)，不同凝乳酶干酪水溶性多肽提取物均具有抗氧化作用，但動物性凝乳酶干酪中抗氧化肽的含量較低[32]。酪蛋白經(jīng)過不同蛋白酶降解后，能夠單獨(dú)產(chǎn)生抗氧化肽。同時，由于不同凝乳酶對酪蛋白酶切位點(diǎn)不同，不同凝乳酶對干酪抗氧化肽積累有較大影響。

3.3 乳源種類

比較不同品種牛乳制作的Caciocavallo干酪的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)兩種干酪的水溶性多肽均具有抗氧化性，且意大利黑白花牛乳制作的Caciocavallo干酪的水溶性多肽的抗氧化作用強(qiáng)于意大利棕色牛乳制作的干酪[33]。水牛乳和普通牛乳Cheddar干酪中提取的多肽均具有抗氧化性，且水牛乳Cheddar干酪中多肽的抗氧化性較強(qiáng),兩者對結(jié)腸癌細(xì)胞產(chǎn)生的自由基均具有抑制作用[34]。駱駝乳發(fā)酵產(chǎn)物比荷斯坦牛乳發(fā)酵產(chǎn)物具有更強(qiáng)的抗氧化活性[35]。雖然源自不同畜種的乳蛋白具有高度同源性，但是山羊乳、綿羊乳和牛乳間的物化特性不同,導(dǎo)致干酪抗氧化肽的活性出現(xiàn)差異。另外，不同畜種間的乳蛋白基因變化也顯示將會釋放不同結(jié)構(gòu)和功能的生物活性肽[36]。

3.4 成熟條件

干酪生物活性肽的生成，是酶和微生物在適宜溫度下持續(xù)作用的結(jié)果，因此，成熟條件作為干酪生產(chǎn)中重要的操作單元，對干酪生物活動肽的形成也具有重要影響。4℃、25℃儲藏的H imalayan干酪的水溶性多肽的抗氧化性增強(qiáng)，而冷凍儲藏的干酪抗氧性不受影響[37]。對不同成熟階段Cheddar干酪抗氧化性研究發(fā)現(xiàn)，成熟4個月之前，干酪抗氧化作用增強(qiáng)，5個月后，干酪抗氧化降低，且在7-9個月的成熟期間，保持不變[24]。但是Songisepp等發(fā)現(xiàn)益生菌干酪中抗氧化活性隨成熟時間的延長呈現(xiàn)增加趨勢[25]。

3.5 其它影響因素

干酪是生物學(xué)和生物化學(xué)動態(tài)變化的產(chǎn)品。生產(chǎn)過程中采用的技術(shù)如高壓等能影響乳成分，促進(jìn)生物活性物質(zhì)的形成和釋放。Quesofresco干酪經(jīng)真空包裝后，采用高壓處理，發(fā)現(xiàn)高壓對干酪水溶性提取物的抗氧化作用有影響，且在壓力400 M Pa，中心溫度40℃，處理20 min時，干酪抗氧化作用最強(qiáng)[15]。Cynara cardunculus蛋白酶制作的未殺菌和殺菌山羊乳和綿羊乳干酪中均發(fā)現(xiàn)了抗氧化肽[38]。因此，通過改變生產(chǎn)中的一些工藝條件，能夠增加干酪的抗氧化活性。

4 干酪抗氧化肽特征

乳源性活性肽主要源自αs1-酪蛋白，其次為β-酪蛋白和αS2-酪蛋白，少部分來自κ-酪蛋白[39]。乳酸菌發(fā)酵的酸奶中發(fā)現(xiàn)了抗氧化肽[40]。抗氧化肽一般由5～16個氨基酸殘基組成[41]。肽的抗氧化性主要與其組成、結(jié)構(gòu)和疏水性有關(guān)[42],Tyr、T rp、M et、Lys、Cys和H is是引起多肽具有抗氧化活性的氨基酸[43]，酸奶中抗氧化肽至少含有一個Pro殘基，部分肽N端為疏水性氨基酸如Val、Leu，且肽段序列中含有Pro、H is或Tyr[7]。Parmigiano-Reggiano干酪水溶性肽的抗氧化活性主要與其肽段中的Tyr、M et和T ry有關(guān)[4]。

Cheddar干酪中分子量超過10 ku的多肽對DPPH具有較好清除作用[16]，不同凝乳酶干酪中分子量小于3 ku的多肽都具有抗氧化作用，且主要源自αs1-酪蛋白[32]。比較了4℃成熟120 d C rem a de Chiapas干酪中分子量在3～10 ku和小于3 ku的水溶性多肽的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)分子量3～10 ku的肽的抗氧性是分子量小于3 ku的多肽的2.5倍[44]。

肽的連接方式和特殊結(jié)構(gòu)特征也影響肽的抗氧化性。Saito曾報道三肽中氨基酸位置的任何改變將導(dǎo)致肽呈現(xiàn)不同抗氧化性[45]。綿羊和山羊乳干酪中發(fā)現(xiàn)了源自β-酪蛋白的Tyr-G ln-G lu-Pro-*肽段具有抗氧化活性[38]。添加了附屬發(fā)酵劑干酪乳桿菌（Lactobacillus casei ssp.casei 300）的Cheddar干酪中發(fā)現(xiàn)了抗氧化作用較強(qiáng)的肽，分別源自β-酪蛋白的VKEAM APK和αs1-酪蛋白的H IQKEDVPSER，其中VKEAM APK的抗氧化作用與商業(yè)抗氧化劑BHA相當(dāng)[3]。Gouda干酪HPIKHQGLPQ水溶性肽分解為HPIL和HGGLPG后抗氧化能力與同劑量的兒茶總素相同[7]。

5 展 望

干酪種類繁多，富含蛋白質(zhì)，是營養(yǎng)價值高的多功能性食品。由于干酪成熟過程中乳酸菌的存在，干酪為抗氧化肽的產(chǎn)生提供了良好基質(zhì)。近年來,隨著消費(fèi)者持續(xù)對生活質(zhì)量提高的關(guān)注和高端乳制品的發(fā)展趨勢，應(yīng)進(jìn)一步探索干酪抗氧化肽的形成機(jī)理，分離、鑒定干酪中抗氧化肽，開發(fā)出具有抗氧化肽含量高和抗氧化活性強(qiáng)的干酪產(chǎn)品，這對于延緩機(jī)體衰老，提高機(jī)體抗氧化能力，促進(jìn)乳制品的換代升級、提升乳品行業(yè)的發(fā)展水平具有重要積極作用。