影響金花茶組織培養(yǎng)芽增殖生長的幾種因素

龍 敏，沈 遐，劉 芳，俞建妹，包 晗

(南寧樹木園，廣西 南寧 530031)

1 引言

金花茶(CamellianitidissimaC. W. Chi)，屬于山茶科山茶屬，是目前為止發(fā)現(xiàn)的唯一一種開金黃色的山茶花，是世界珍稀觀賞樹種和種質(zhì)資源，與銀杉、桫欏、珙桐等珍貴“植物活化石”齊名，被譽(yù)為“植物界的大熊貓”，“茶族皇后”。金花茶除了有觀賞價(jià)值外，藥用和保健價(jià)值也被人們廣泛認(rèn)可，此外，還含有特殊的色澤遺傳基因，具有較高的科研價(jià)值[1]。隨著金花茶價(jià)值不斷被開發(fā)利用，市場上對金花茶苗木的需求不斷增加，而其傳統(tǒng)的種子和扦插繁殖育苗材料有限、育苗周期長[2]，因此金花茶組織培養(yǎng)技術(shù)研究就成了其發(fā)展的新風(fēng)向。國內(nèi)對金花茶組織培養(yǎng)相關(guān)研究已有一些報(bào)道。莊承紀(jì)和程金水等從金花茶子葉誘導(dǎo)胚狀體再生成完整植株；廖漢刃等以莖段為外植體成功培育出試管無根苗并與油茶苗砧嫁接形成完整植株，繼代增殖率2.8～6.2；顏慕勤等研究了廣西7種金花茶組織培養(yǎng)技術(shù)，驗(yàn)證了適合大多數(shù)茶科的基本培養(yǎng)基為改良ER培養(yǎng)基，并成功應(yīng)用于雜交金花茶幼胚的早期培養(yǎng)；黃昌艷等以防城港金花茶種胚誘導(dǎo)成功培育出組培苗，增殖系數(shù)3.79，并進(jìn)行壯苗培養(yǎng)后直接移栽；李桂娥等建立了金花茶組培快繁體系，增殖系數(shù)4.2，生根率達(dá)86%?？梢?，金花茶組織培養(yǎng)研究已取得一定進(jìn)展，但仍有待完善。本試驗(yàn)旨在研究影響金花茶組織培養(yǎng)芽增殖生長的幾種因素，為金花茶組培苗產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

2 材料與試驗(yàn)方法

2.1 材料

供試材料來源于廣西南寧樹木園金花茶基因庫中優(yōu)選的生長健壯、花朵繁多,花產(chǎn)量較高的金花茶植株當(dāng)年生嫩枝，通過莖段消毒滅菌、初代培養(yǎng)獲得的組培繼代芽。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 不同生長調(diào)節(jié)劑及濃度配比對芽的增殖

在Q (MS+50 mg/L Na2SO4)的基本培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，采用雙因素正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，添加不同濃度6-BA(2.0 mg/L 、3.0 mg/L、 4.0 mg/L)配以IAA和NAA，后兩者濃度梯度均為0 mg/L，0.5 mg/L，1.0 mg/L。每處理接種10瓶(500 mL三角瓶，以下試驗(yàn)相同)，每瓶接種6叢叢芽(5～7顆芽/叢，以下試驗(yàn)同)，重復(fù)3次，接種40 d統(tǒng)計(jì)芽增殖情況。

2.2.2 不同濃度水解酪蛋白對不定芽的增殖

在Q+6-BA3.0 mg/L+NAA1.0 mg/L培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加水解酪蛋白，濃度梯度為0 mg/L ，100 mg/L,300 mg/L,500 mg/L,700 mg/L,900 mg/L。每處理接種10瓶，每瓶接種6叢叢芽，重復(fù)3次，接種40 d觀察記錄芽增殖數(shù)量和質(zhì)量的情況。

2.2.3 芽褐化現(xiàn)象的遏制

在Q+6-BA3.0 mg/L+NAA1.0 mg/L+CH 300 mg/L培養(yǎng)基基礎(chǔ)上分別添加核黃素15 mg/L、抗壞血酸10 mg/L和活性炭500 mg/L，每處理接種10瓶，每瓶接種6叢叢芽，重復(fù)3次，接種40d觀察記錄芽增殖過程中的褐化情況。

2.2.4 溫度條件對不定芽的增殖

在Q+6-BA3.0 mg/L+NAA1.0 mg/L+CH 300 mg/L+抗壞血酸10 mg/L培養(yǎng)基上接種健壯繼代芽，置于不同培養(yǎng)溫度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，試驗(yàn)的溫度梯度為15～20℃、21～25℃、26～30℃，每處理接種10瓶，每瓶接種6叢叢芽，重復(fù)3次，接種后不斷觀察繼代芽生長情況。

2.3 培養(yǎng)條件

上述所有培養(yǎng)基添加蔗糖30 g/L，瓊脂4.5 g/L，pH值5.8，培養(yǎng)基經(jīng)高溫高壓( 121 ℃，0.14 MPa) 滅菌15 min。除試驗(yàn)外，繼代芽在光照強(qiáng)度800～2000 Lx的條件下培養(yǎng)7～10d,再置于4000～6000Lx的光照條件下培養(yǎng)，光照時(shí)間12～14 h/d，培養(yǎng)室溫度21～25 ℃。光照主要來源于太陽散射光。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Microsoft Office Excel 2007，SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。公式如下：

芽增殖系數(shù)=新增芽數(shù)/接種芽總數(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同生長調(diào)節(jié)劑及濃度配比對金花茶組培芽增殖的影響

在組織培養(yǎng)中，人工添加不同生長調(diào)節(jié)劑種類及濃度配比，會共同影響芽增殖的數(shù)量和生長情況。正交試驗(yàn)結(jié)果見表1、2。

表1生長調(diào)節(jié)劑正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

序號生長調(diào)節(jié)劑6-BA(A)IAA(B)NAA(C)芽增殖系數(shù)12002.25221.004.37320.50.55.524301.010.52530.50.59.32631.00.59.89740.51.07.588401.06.81941.005.09K112.1419.5811.71K229.7322.4224.73K319.4819.3524.91k14.056.533.90k29.917.478.24k36.496.458.30極差5.861.024.40最佳組合A2B1C3

表2主體間效應(yīng)的檢驗(yàn)因變量y

源III 型平方和自由度均方F值P值校正模型61.180a610.19761.3150.016截距418.2021418.2022514.7470.0006-BA(A)14.29527.14842.9800.023IAA(B)2.60521.3027.8310.113NAA(C)7.19223.59621.6250.044誤差0.33320.166總計(jì)479.7159校正的總計(jì)61.5138

由表1和表2的檢驗(yàn)結(jié)果綜合分析表明，因素A和因素C的P值為0.023和0.044，都小于0.05，說明6-BA和NAA對芽增殖的作用顯著，其中起主導(dǎo)作用的是6-BA，其次是NAA，兩者協(xié)同作用，是影響金花茶芽增殖的重要因素。因素B的P值為0.113，大于0.05，顯示IAA在試驗(yàn)各水平中對金花茶芽增殖作用不顯著，這可能是由于IAA在植物體內(nèi)運(yùn)輸緩慢導(dǎo)致。試驗(yàn)結(jié)果顯示最佳的組合為A2 +C3+B1即6-BA3.0 mg/L+NAA1.0 mg/L+IAA0 mg/L，其平均增殖系數(shù)最高為10.52。

由表3多重比較可知，6-BA的水平2和1、3水平差異顯著，1、3水平間差異不顯著，6-BA濃度以3.0 mg/L芽增殖效果最好，芽平均增殖系數(shù)達(dá)9.910，試驗(yàn)中最高芽增殖系數(shù)達(dá)13。NAA水平2、3和水平1差異顯著，2、3水平之間差異不顯著，NAA的水平3與6-BA的水平2濃度配比增殖效果最好。

試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中單純添加細(xì)胞分裂素6-BA2.0 mg/L繼代芽有一定的增殖，但是芽密集粗短，玻璃化嚴(yán)重。這說明一定濃度的細(xì)胞分裂素可以促進(jìn)細(xì)胞分裂和芽的分化，但欲使芽生長良好，在繼代培養(yǎng)過程中必須要有生長素協(xié)同作用。

表3 金花茶芽增殖單因素方差分析結(jié)果

3.2 水解酪蛋白對芽增殖的影響

水解酪蛋白含有氨基酸、多肽和蛋白質(zhì)等豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，其作為一種有機(jī)添加物被廣泛應(yīng)用于組織培養(yǎng)中[3]，對不定芽的分化有良好的促進(jìn)作用。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)芽增殖系數(shù)較高的培養(yǎng)基培養(yǎng)的芽高生長緩慢，活性不強(qiáng)，為了促進(jìn)芽健康生長，本試驗(yàn)在上述Q+6-BA3.0mg/L+NAA1.0 mg/L組合的基礎(chǔ)上添加不同濃度的CH,培養(yǎng)40d芽形態(tài)變化、新芽增殖和芽的生長狀況詳見表4。

表4 不同濃度水解酪蛋白對芽增殖影響

表4結(jié)果顯示，不同濃度的CH對芽增殖和生長效果不一致，增殖系數(shù)大小排序?yàn)镃H-4>CH-3>CH-2>CH-1>CK>CH-5，其中CH-2、CH-3、CH-4的芽增殖系數(shù)較高，分別為12、13、15，當(dāng)濃度低為CH-1時(shí)，芽的長勢差，增殖系數(shù)偏低；CH-4芽增殖系數(shù)雖然最大，但芽粗短密集，容易出現(xiàn)玻璃化，CH-3芽增殖系數(shù)也較高，但繼代芽連續(xù)培養(yǎng)3代后，同樣也出現(xiàn)玻璃化芽；當(dāng)濃度達(dá)到CH-5時(shí)，芽粗短且玻璃化嚴(yán)重最后褐化死亡。因此試驗(yàn)結(jié)果表明較為適宜的水解酪蛋白添加濃度為CH-2(即300 mg/L)，其增殖芽生長健康，扦插生根率高。

3.3 不同添加物對芽褐化現(xiàn)象遏制的效果

金花茶組培芽在繼代培養(yǎng)過程中，芽體褐化現(xiàn)象比較明顯。褐化是完整組織和細(xì)胞受到物理傷害，酚類化合物外溢，在酶作用下迅速氧化，形成褐色醌類物質(zhì)，進(jìn)一步與組織中的蛋白質(zhì)發(fā)生聚合，導(dǎo)致組織代謝紊亂，甚至死亡的現(xiàn)象[4]。褐化是植物組織培養(yǎng)中常見的問題，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，添加適當(dāng)?shù)目寡趸瘎┗蛭絼┛梢赃_(dá)到降低或抑制褐化的作用。

本試驗(yàn)在上述試驗(yàn)優(yōu)選的培養(yǎng)基基礎(chǔ)上分別添加核黃素15 mg/L、抗壞血酸10 mg/L以及活性炭500 mg/L，并在接種后每天觀察記錄芽體褐化的程度和芽的生長情況，接種40 d各添加物對芽褐化遏制的效果見圖1。

圖1 不同添加物對芽褐化的遏制效果

圖1中，輕度褐化表示接種后單顆芽頂芽褐化，褐化部分小于1/3；中度褐化表示單顆芽的1/3～1/2褐化；重度褐化表示單顆芽的1/2以上褐化。

圖1顯示培養(yǎng)基中添加15 mg/L核黃素對抑制芽的褐化效果不明顯，全部出現(xiàn)不同程度的褐化，其中輕度褐化的芽僅占瓶內(nèi)芽數(shù)的5%，而中度、重度褐化共占95%，以中度褐化為主；添加抗壞血酸，無褐化和輕度褐化占97%，表明10 mg/L抗壞血酸對金花茶繼代芽的增殖過程中出現(xiàn)的褐化現(xiàn)象抑制效果較好；添加活性炭可在一定程度上抑制褐化，無褐化占25%，輕度褐化占26%，中度、重度褐化占49%，其對褐化的抑制作用仍低于抗壞血酸，且活性炭雖然能夠吸附芽體釋放的褐化物質(zhì)，但也會吸附培養(yǎng)基的有效成分。由此可見，添加抗壞血酸10 mg/L遏制芽褐化的效果比較理想。

3.4 溫度對金花茶芽生長的影響

適宜的溫度是保障植物正常生長的重要條件。金花茶性喜溫涼但懼炎熱的環(huán)境。本試驗(yàn)將接種的繼代芽置于不同溫度條件下培養(yǎng)40d芽增殖和生長結(jié)果見表5。

表5顯示，T1溫度15～20℃條件下繼代芽增殖系數(shù)偏低，芽生長緩慢，原因可能是因長時(shí)間培養(yǎng)室溫度偏低導(dǎo)致植株的生理活性降低；T2溫度21～25℃條件下芽的增殖系數(shù)最高達(dá)12.3，芽生機(jī)勃勃，平均株高3.8 cm，是最適合金花茶組培芽的增殖和生長的溫度范圍；當(dāng)溫度提高到26～30 ℃時(shí)，繼代芽接種第3 d即有葉片發(fā)黃現(xiàn)象，第7 d后逐漸出現(xiàn)枯葉落葉，甚至整株芽的葉片全部落光至死，大部分的繼代芽無新芽增殖，因此，芽的增殖系數(shù)最低，分析其原因主要是培養(yǎng)溫度過高導(dǎo)致植株體內(nèi)代謝紊亂，生長失衡。

3 結(jié)論與討論

隨著6-BA濃度提高，芽增殖系數(shù)先上升后下降，試驗(yàn)中6-BA濃度3.0 mg/L的增殖系數(shù)最高，這與黃昌艷(2016)在金花茶種子萌發(fā)與快速繁殖技術(shù)研究結(jié)果相類似，本試驗(yàn)還研究了6-BA與生長素協(xié)同作用于金花茶組培芽的增殖，增殖系數(shù)10以上，就增殖系數(shù)而言，較優(yōu)于國內(nèi)有關(guān)的金花茶組織培養(yǎng)研究結(jié)果。

表5 不同培養(yǎng)溫度對金花茶組培芽增殖和生長

對于金花茶組培芽褐化的遏制，抗壞血酸的作用優(yōu)于核黃素和活性炭，因?yàn)榭箟难崾且环N普遍存在于植物組織的抗氧化物質(zhì)，其作為自由基消除劑，可以成為初級抗氧化物直接清除單線態(tài)氧、超氧化物和羥自由基[5]，而植株體產(chǎn)生的酚類化合物正是由羥自由基與芳烴核(苯環(huán)或稠苯環(huán))直接相連形成的有機(jī)化合物，因此添加抗壞血酸能較好的與酚類化合物結(jié)合，阻止醌類褐化物質(zhì)產(chǎn)生，因而起到調(diào)節(jié)金花茶組培芽體內(nèi)的氧化還原代謝的作用，同時(shí)基本上對培養(yǎng)基的有效成分無影響，因此選擇抗壞血酸作為添加物以抑制芽體的褐化效果良好。

金花茶喜歡溫涼環(huán)境，本試驗(yàn)最適溫度范圍21～25 ℃，在實(shí)際生產(chǎn)中要同時(shí)考慮到成本問題，尤其是高溫季節(jié)室外溫度一般在28～35 ℃，培養(yǎng)室溫度長期控制在21～25 ℃耗電大成本高，因此是否可以將溫度基本控制在25 ℃±2 ℃，在此溫度區(qū)間內(nèi)金花茶組培芽能否正常生長，有待進(jìn)一步研究。