醇醚硫酸鹽AES降解菌的篩選鑒定及生物降解特性研究

曾典　唐啟玲　龐志宇　杜全能　蘭時(shí)樂

摘要? ? 為了獲得陰離子表面活性劑醇醚硫酸鹽（AES）降解菌并應(yīng)用于AES的降解，從湖南麗臣實(shí)業(yè)股份有限公司污水處理池污泥中分離篩選到1株能以AES為唯一碳源生長(zhǎng)且能高效降解AES的細(xì)菌，命名為Z-8。通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗(yàn)和16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，探討了AES初始濃度、溫度、初始pH值和發(fā)酵時(shí)間對(duì)AES降解率的影響。結(jié)果表明，菌株Z-8被鑒定為Pseudomonas knackmussii Z-8，對(duì)AES的耐受力可達(dá)1 400 mg/L。適宜的降解條件為AES初始濃度400 mg/L、培養(yǎng)溫度32 ℃、初始pH值9.0和發(fā)酵時(shí)間9～12 h，在此條件下，AES降解率達(dá)99.59%。試驗(yàn)結(jié)果顯示了克氏假單胞菌Z-8在處理含AES廢水中具有良好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞? ? 醇醚硫酸鹽（AES）;菌株鑒定;生物降解;16S rDNA序列分析

中圖分類號(hào)? ? X172? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? ? A

文章編號(hào)? ?1007-5739（2019）24-0138-04? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）

Abstract? ? In order to obtain anionic surfactant alcohol ether sulfate（AES）degrading bacteria and apply to AES degradation.A strain named Z-8 was isolated from sludge of sewage treatment pond of Hunan Lichen Industrial Co.，Ltd.，which could grow with AES as the sole carbon source and degrade AES efficiently. The strain Z-8 was identified by morphological observation，physiological and biochemical tests，16S rDNA sequence analysis and phylogenetic tree construction. The effects of AES initial concentration，cultural temperature，initial pH value and fermentation time on AES degradation rate were discussed. The results showed that strain Z-8 was identified as Pseudomonas knackmussii Z-8，and its resistance to AES was up to 1 400 mg/L.The optimum degradation conditions were AES initial concentration 400 mg/L，incubation temperature 32 ℃，initial pH value 9.0 and fermentation time 9-12 h. Under these conditions，the degradation rate of AES reached 99.59%. The experimental results showed that Pseudomonas knackmussii Z-8 had a good application prospect in the treatment of wastewater containing AES.

Key words? ? alcohol ether sulfate（AES）;strain identification;biodegradation;16S rDNA sequence analysis

脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸鈉（AES）是一種性能優(yōu)良的陰離子型表面活性劑，因其具有優(yōu)良的去污能力、乳化發(fā)泡性能、抗硬水性能以及生物降解性[1]而被廣泛用于香波、浴液、餐具洗滌劑、復(fù)合皂等洗滌化妝用品中，其用量?jī)H次于直鏈烷基苯磺酸鹽（LAS）。盡管AES濃度低時(shí)危害并不明顯，但濃度過高，會(huì)使皮膚干燥并破壞保護(hù)皮膚表面的自然油脂、蛋白質(zhì)，以及通過皮膚被身體吸收進(jìn)入肝臟，還可能造成男性精子成活率下降，提高女性患子宮癌和乳腺癌的機(jī)率[2]。AES進(jìn)入土壤和水體后，能在水體中產(chǎn)生大量的持久性泡沫[3]，阻斷水體與空氣的交換，減少水體中的溶解氧，影響水體中魚類和水生無脊椎動(dòng)物的生長(zhǎng)，同時(shí)有研究表明長(zhǎng)期接觸和使用AES可降低小鼠血清中超氧化物歧化酶的含量，使得小鼠體內(nèi)抗氧化能力的降低，從而影響其正常生理功能[4]。

目前已經(jīng)報(bào)道污水中陰離子表面活性劑降解方法主要有振蕩培養(yǎng)法、活性污泥模擬法、開放（密閉）法等[5]。對(duì)于從自然界分離純化微生物并應(yīng)用于非離子表面活性劑的降解主要集中于十二烷基苯磺酸鈉（LAS）的降解研究。國內(nèi)研究工作者分離出了能有效降解LAS的芽孢桿菌（Bacillus sp.）[6]、黃單胞菌（Xanthomonas sp.）[7]、可動(dòng)苯基桿菌（Phenylobacter-ium mobile）[8]等，但對(duì)陰離子表面活性劑中的AES生物降解方面的研究較少，僅有董慶斌等[9]用活性污泥對(duì)AES進(jìn)行了生物降解性的研究，而從自然界分離微生物并對(duì)微生物進(jìn)行鑒定和研究AES微生物降解特性的研究，國內(nèi)外未見文獻(xiàn)報(bào)道。

目前，國內(nèi)外對(duì)AES的研究主要側(cè)重于其生產(chǎn)工藝[10]、貯存條件[10-13]、應(yīng)用性能[3，14-15]，但未發(fā)現(xiàn)研究AES的微生物降解菌種的篩選、生物降解工藝和生物降解特性。筆者從湖南麗臣實(shí)業(yè)股份有限公司污水處理池污泥中分離到1株能高效降解脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸鈉（AES）的細(xì)菌菌株Z-8，初步研究了AES濃度、發(fā)酵溫度、培養(yǎng)基初始pH值和發(fā)酵時(shí)間等對(duì)AES降解的影響，以期為菌株Z-8對(duì)AES污染進(jìn)行生物修復(fù)和拓寬其應(yīng)用范圍提供參考。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 試驗(yàn)材料

1.1.1? ? 菌株分離樣品。取自湖南麗臣實(shí)業(yè)股份有限公司污水處理池中的污泥，置于無菌廣口玻璃瓶中，立即帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行AES降解菌的富集和分離。

1.1.2? ? 培養(yǎng)基。①富集培養(yǎng)基：AES 0.4 g，NH4Cl 3 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，KCl 0.25 g，K2HPO4 1 g，F(xiàn)eSO4 0.001 g，H2O 1 000 mL，pH值7.2～7.4。②篩選培養(yǎng)基：培養(yǎng)基成分與富集培養(yǎng)基相同，另加2%的瓊脂。③斜面培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂20.0 g，H2O 1 000 mL，pH值7.0～7.2。④液體種子培養(yǎng)基：培養(yǎng)基成分與斜面培養(yǎng)基成分相同，但不加瓊脂粉。⑤發(fā)酵培養(yǎng)基：AES 0.04%，NH4Cl 0.3%，MgSO4·7H2O 0.02%，KCl 0.02%，K2HPO4 0.1%，pH值7.0。

以上培養(yǎng)基均在121 ℃條件下滅菌25 min。

1.1.3? ? 主要儀器與藥品。主要儀器設(shè)備：電子天平（TMP-510，湘儀天平儀器設(shè)備有限公司）;分析天平（AL204，梅特勒—托利多儀器有限公司）;恒溫培養(yǎng)箱（MJ-160C，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）;高溫高壓滅菌鍋（SS-325，TOMY.KOGYO.CO.，LTD）;單人單面超凈工作臺(tái)（SW-CJ-1B（U），蘇州設(shè)備凈化有限公司）;DNA電泳槽（DYCP-31DN，北京六一儀器廠）;穩(wěn)壓電泳儀（DYY-5，北京六一儀器廠）;凝膠成像儀（FR980，上海復(fù)日科技儀器有限公司）;PCR儀（2720 thermal cycler，Applied Biosystems）;冷凍高速離心機(jī)（HC-2518R，BBI）。

主要藥品：AES（70%，山東優(yōu)索化工科技有限公司）;NH4Cl、KCl、FeSO4、MgSO4·7H2O、K2HPO4（AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;瓊脂（BP，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司）;牛肉膏、蛋白胨（BP，上海盛思生化科技有限公司）。

1.2? ? 試驗(yàn)方法

1.2.1? ? 培養(yǎng)。斜面培養(yǎng)：將保存于4 ℃冰箱中的菌種接種于斜面培養(yǎng)基表面，37 ℃恒溫培養(yǎng)24～36 h，備用。液體種子培養(yǎng)：將活化后的斜面菌種接種于液體培養(yǎng)基中，37 ℃，170 r/min條件下恒溫培養(yǎng)24 h。發(fā)酵培養(yǎng)：按2%（V/V）的接種量將培養(yǎng)好的液體種子接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基100 mL/300 mL三角瓶中，37 ℃，170 r/min條件下恒溫培養(yǎng)48 h，測(cè)定培養(yǎng)液中AES含量，并計(jì)算AES降解率。3次重復(fù)。

1.2.2? ? 菌種的篩選與鑒定。

（1）菌種初篩與復(fù)篩。稱取5.00 g污泥樣品接入100 mL富集培養(yǎng)基中，于37 ℃、170 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)箱中富集培養(yǎng)3 d后，按照10倍稀釋法[16]將富集液進(jìn)行稀釋，取最后3個(gè)不同稀釋度的稀釋液0.1 mL涂布于篩選培養(yǎng)基平板上，涂布均勻，于37 ℃細(xì)菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落。挑取單菌落于選擇培養(yǎng)基平板表面劃線純化，直至顯微鏡鏡檢時(shí)菌體形態(tài)一致為止，保存并編號(hào)。將保存于斜面的菌株分別接入液體種子培養(yǎng)基中，37 ℃，170 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h后，按2%（V/V）的接種量接入含400 mg/L AES的發(fā)酵培養(yǎng)基中，同樣條件下恒溫振蕩培養(yǎng)48 h，分別測(cè)定培養(yǎng)液中AES的含量，并計(jì)算AES的降解率。

（2）形態(tài)學(xué)及生理生化特征。將分離得到的AES降解菌涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基表面，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察菌落形狀、大小、顏色、表面特征及革蘭氏染色。菌株的生理生化試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[17]中方法進(jìn)行。

（3）16S rDNA基因序列及系統(tǒng)發(fā)育分析。用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株Z-8 24 h后，采用上海生工生物工程Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒進(jìn)行DNA提取。以提取的基因組DNA為模板，擴(kuò)增16S rDNA基因片段。正向引物序列：27F：5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，反向引物序列：1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL，包括Template（基因組DNA 20～50 ng/μL）0.5 μL，10×Buffer（含Mg2+）2.5 μL、dNTP（2.5 mmol/L）1 μL、Taq酶0.2 μL、正向引物（10 μmol/L）0.5 μL、反向引物（10 μmol/L）0.5 μL，加雙蒸水定容至25 μL。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性45 s;55 ℃退火45 s;72 ℃延伸1 min;30個(gè)循環(huán);72 ℃修復(fù)延伸10 min;4 ℃保存。測(cè)序由上海生工生物工程有限公司完成。通過BLAST程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi）將16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對(duì)，并提交給GenBank。采用NJ法，用MEGA7.0.26構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3? ? 菌株Z-8降解AES特性研究。

（1）AES濃度對(duì)菌株Z-8降解AES的影響。在培養(yǎng)基中分別添加400、600、800、1 000、1 200、1 400 mg/L的AES，于37 ℃、170 r/min條件下培養(yǎng)48 h，其他條件不變，測(cè)定培養(yǎng)液中AES含量，并計(jì)算AES的降解率。

（2）培養(yǎng)溫度對(duì)菌株Z-8降解AES的影響。在上述試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，將三角瓶分別置于28、30、32、35、37 ℃條件下，170 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)培養(yǎng)48 h，其他條件不變，測(cè)定培養(yǎng)液中AES含量，并計(jì)算AES的降解率。

（3）培養(yǎng)基初始pH值對(duì)菌株Z-8降解AES的影響。在上述試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，用稀酸或稀堿調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH值分別為3、5、7、9和11，其他條件不變，測(cè)定培養(yǎng)液中AES含量，并計(jì)算AES的降解率。

（4）培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株Z-8降解AES的影響。在上述試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，將三角瓶在適宜的條件下培養(yǎng)，每隔3 h取樣測(cè)定發(fā)酵液中AES含量，并計(jì)算AES的降解率，直至培養(yǎng)48 h為止。

1.2.4? ? AES含量測(cè)定。

（1）發(fā)酵液預(yù)處理。將培養(yǎng)好的發(fā)酵液于4 ℃，10 000 r/min條件下離心15 min，取上清液，測(cè)定AES的含量。以不接種為對(duì)照。

（2）AES含量測(cè)定。參照文獻(xiàn)[18]提供的亞甲藍(lán)比色法（美藍(lán)法）進(jìn)行測(cè)定。AES降解率計(jì)算公式如下：

D（%）=（m0-mn）/m0×100

式中：D為第n小時(shí)后AES的降解率（%）;m0為初始表面活性劑質(zhì)量（mg）;mn為第n小時(shí)后表面活性劑質(zhì)量（mg）。

2? ? 結(jié)果與分析

2.1? ? AES降解菌的篩選與鑒定

2.1.1? ? AES降解菌的初篩與復(fù)篩。通過富集、篩選培養(yǎng)后，共得到8株能以AES為唯一碳源生長(zhǎng)的細(xì)菌菌株，分別命名為Z-1、Z-2、Z-3、Z-4、Z-5、Z-6、Z-7、Z-8。將8株菌株分別接入含400 mg/L AES的發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、170 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)48 h后，分別測(cè)定培養(yǎng)液中AES的含量，并計(jì)算AES的降解率。結(jié)果見圖1?？梢钥闯?，不同菌株在上述條件下對(duì)AES的降解率不同。所分離的菌株中，菌株Z-8對(duì)AES的降解率最強(qiáng)，達(dá)到99.67%。其他7個(gè)菌株對(duì)AES的降解率均<60%。因而選擇菌株Z-8為試驗(yàn)菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.2? ? 菌株Z-8形態(tài)學(xué)觀察。菌株Z-8在以AES為唯一碳源的篩選培養(yǎng)基上菌落灰白色、圓形、表面潮濕、邊緣整齊、不透明。在光學(xué)顯微鏡下菌體為短桿狀、無芽孢、革蘭氏染色為陰性。

2.1.3? ? 生理生化試驗(yàn)結(jié)果。菌株Z-8生理生化指標(biāo)見表1。

2.1.4? ? 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。菌株Z-8的16S rDNA測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行Blast比對(duì)分析，其序列全長(zhǎng)為1 404 bp，與假單胞菌屬的16S rDNA基因序列相似度最高。選擇Pseud-omonas aeruginosa（GQ926936.1）作為外類群，采用NJ法，用MEGA7.0.26構(gòu)建與假單胞菌屬部分模式種16S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果見圖2。

由圖2可知，菌株Z-8與Pseudomonas knackmussii（HG322950.1）的親緣關(guān)系最近，同處一個(gè)進(jìn)化分支。綜合菌落形態(tài)特征、生理生化特征和16S rDNA基因序列分析以及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建結(jié)果，將菌株Z-8初步鑒定為Pseudomonas knackmussii Z-8。

2.2? ? 菌株Z-8降解AES特性研究

2.2.1? ? 初始濃度對(duì)菌株Z-8降解AES能力的影響。從圖3可以看出，菌株Z-8在AES初始濃度400～1 400 mg/L均具有降解AES的能力。當(dāng)AES濃度在400～800 mg/L范圍內(nèi)，其降解率均>90%，而在培養(yǎng)基中AES初始濃度為400 mg/L時(shí)，AES降解率最大，達(dá)到了99.38%。但隨著培養(yǎng)基中AES濃度的增加，AES降解率下降。當(dāng)培養(yǎng)基中AES初始濃度達(dá)到1 400 mg/L時(shí)，AES的降解率僅為2.87%，表明高濃度的AES對(duì)菌株Z-8具有顯著的生長(zhǎng)抑制作用，從而影響其降解效率。因此，選擇培養(yǎng)基中AES初始濃度為400 mg/L進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2.2? ? 培養(yǎng)溫度對(duì)AES降解率的影響。培養(yǎng)溫度主要影響細(xì)胞內(nèi)代謝酶的活性、細(xì)胞膜的流動(dòng)性和通透性以及影響物質(zhì)的溶解度，從而影響微生物的生長(zhǎng)和代謝。培養(yǎng)溫度低，代謝酶活性低;培養(yǎng)溫度高，代謝酶容易變性失活，均會(huì)造成細(xì)胞內(nèi)酶促反應(yīng)的下降，影響細(xì)胞內(nèi)生物物質(zhì)的合成。溫度對(duì)AES降解率的影響結(jié)果見圖4。可以看出，當(dāng)培養(yǎng)溫度為32 ℃時(shí)，AES的降解率最高，達(dá)99.54%;隨著培養(yǎng)溫度的升高，AES的降解率緩慢下降。在30～37 ℃培養(yǎng)溫度范圍內(nèi)，AES降解率均>99%，但彼此之間差異不顯著。因此，選擇培養(yǎng)溫度為32 ℃進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2.3? ? pH值對(duì)AES降解率的影響。由圖5可知，培養(yǎng)基pH值對(duì)菌株Z-8降解AES的影響較大，在一定的pH值范圍內(nèi)，隨著培養(yǎng)基pH值的升高，AES的降解率也隨之提高。當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值為9.0時(shí)，AES降解率達(dá)到99.47%，但當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值>9.0，AES降解率顯著下降。主要原因?yàn)榄h(huán)境的酸堿度能引起細(xì)胞膜電荷的變化和細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)的平衡以及細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變，影響細(xì)胞對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝酶系的活性，從而降低細(xì)胞對(duì)AES的利用率。

2.2.4? ? 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)AES降解率的影響。由圖6可知，AES降解率隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而提高。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為9 h時(shí)，AES降解率達(dá)到98.78%，繼續(xù)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，雖然在12～48 h內(nèi)，AES降解率均>99%，但各處理之間差異并不顯著。因此，選擇培養(yǎng)時(shí)間為9～12 h。

3? ? 結(jié)論

從湖南麗臣實(shí)業(yè)股份有限公司污水處理池污泥中篩選到1株能以AES為唯一碳源的AES高效降解菌株Z-8，根據(jù)16S rDNA基因序列分析比對(duì)及形態(tài)學(xué)觀察和生理生化特征，將其鑒定為Pseudomonas knackmussii Z-8。AES生物降解特性試驗(yàn)表明，菌株Z-8能適應(yīng)高濃度醇醚硫酸鹽，其濃度可達(dá)1 400 mg/L。AES濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始pH值和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)AES降解率影響結(jié)果表明，在AES初始濃度為400 mg/L，培養(yǎng)溫度32 ℃，培養(yǎng)基初始pH值9.0和培養(yǎng)時(shí)間9～12 h條件下，AES降解率可達(dá)99.59%，表明該菌在處理含較高濃度AES廢水中具有極好的應(yīng)用前景。

4? ? 參考文獻(xiàn)

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