低溫和短光周期對(duì)篤斯越橘葉綠素?zé)晒馓匦院凸夂献饔孟嚓P(guān)蛋白的影響

烏鳳章

（大連大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究院，遼寧 大連 116622）

溫度和光周期是控制北方多年生植物生長(zhǎng)及抗性反應(yīng)的主要環(huán)境因子[1]。秋季低溫和短光周期引起植物生理生化和分子改變，增強(qiáng)對(duì)不利環(huán)境的適應(yīng)性[2]。低溫引起光合作用相關(guān)膜蛋白、電子傳遞和卡爾文循環(huán)有關(guān)蛋白豐度和活性發(fā)生變化，或使冷敏感蛋白活性喪失，但光合作用的生物物理反應(yīng)（光子捕獲和激發(fā)能量傳遞）受溫度影響較小，光化學(xué)、電子傳輸和代謝間能量不平衡，增加PSⅡ激發(fā)壓力[3]，降低以PSⅡ水平為主的光合器官光吸收能力[4]。光周期調(diào)節(jié)葉片活動(dòng)，單獨(dú)誘導(dǎo)植物停止生長(zhǎng)和休眠[5]，或與低溫共同作用誘導(dǎo)植物休眠，進(jìn)入低溫鍛煉狀態(tài)，提高低溫鍛煉效果[6]。Bauerle等研究表明，在恒溫和長(zhǎng)光周期下北方落葉樹保持較高光合能力，但恒溫和自然縮短的光周期下光合活性下降[7]。使植物暴露在低溫鍛煉條件下，引發(fā)部分光合機(jī)構(gòu)蛋白重構(gòu)，碳固定相關(guān)蛋白重調(diào)，光合能力發(fā)生變化，使植物適應(yīng)環(huán)境變化[8]。Renaut等研究發(fā)現(xiàn)，低溫下消失或下調(diào)表達(dá)的蛋白與光合能量代謝相關(guān)[9]。劉慧民等在不同低溫和縮短的光周期下分別鑒定繡線菊（Spiraea）葉片中涉及能量代謝與運(yùn)輸?shù)?7種顯著變化的光合作用相關(guān)蛋白[10]。

篤斯越橘（Vacciniumuligiuosum L.）主要分布在我國(guó)長(zhǎng)白山及大小興安嶺，果實(shí)比栽培的高叢越橘抗氧化成分更高，抗凍性極強(qiáng)，可耐受-35℃低溫。因此作為重要的野生經(jīng)濟(jì)植物資源和越橘屬植物遺傳改良親本材料受關(guān)注。烏鳳章研究表明，在低溫鍛煉期間篤斯越橘葉片可溶性糖和可溶性蛋白含量受低溫影響明顯增加，低溫環(huán)境的適應(yīng)能力提高[11]，但低溫和短光周期對(duì)篤斯越橘葉綠素?zé)晒鈪?shù)和光合蛋白豐度影響情況尚不清楚。因此，本文以3年生篤斯越橘苗木為試驗(yàn)材料，利用iTRQ蛋白質(zhì)組技術(shù)研究低溫下不同光周期對(duì)葉片光合蛋白表達(dá)的影響，結(jié)合葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定結(jié)果，以期從蛋白質(zhì)水平揭示篤斯越橘光合作用對(duì)低溫和光周期的響應(yīng)機(jī)制，為相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及試驗(yàn)處理

試驗(yàn)材料來源于黑龍江省黑河市嫩江縣多寶山鎮(zhèn)，為3年生盆栽（高16 cm、上口徑16 cm）扦插苗，平均高40 cm，栽培基質(zhì)為草炭土。

預(yù)處理：選取生長(zhǎng)良好且規(guī)格相對(duì)一致的100株露地生長(zhǎng)篤斯越橘盆栽苗。2017年9月10日將苗木置于人工氣候室（PQX-1000 C，寧波東南儀器制造廠）中預(yù)處理。處理溫度23℃，使用LED光源，光照強(qiáng)度14 400 lx，光周期10 h/14 h（晝/夜），空氣濕度為75%/65%（晝/夜）。

低溫鍛煉期不同日照處理：預(yù)處理21 d后，分別將50株苗木置于兩個(gè)人工氣候室中，人工氣候室溫度4℃，光照強(qiáng)度14 400 lx，空氣濕度75%/65%（晝/夜），日照處理分別為短日照10 h/14 h（晝/夜）和長(zhǎng)日照14 h/10 h（晝/夜）。對(duì)于低溫處理，以每小時(shí)下降2℃速率從預(yù)處理溫度降至處理溫度。處理期間，適時(shí)澆水，使栽培基質(zhì)保持濕潤(rùn)。分別在低溫下不同日照處理0、7、14和21 d時(shí)測(cè)定葉綠素?zé)晒鈪?shù)。經(jīng)低溫鍛煉0 d（對(duì)照組）和不同日照處理21 d試驗(yàn)材料中隨機(jī)選取15個(gè)單株，按照對(duì)角線法隨機(jī)采集位于中上部的當(dāng)年生枝條第2～8片生長(zhǎng)最佳葉片，分別采集2～5 g葉片，液氮快速處理后保存于-80℃冰箱，用于蛋白質(zhì)提取和鑒定。

1.2 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定

分別在每個(gè)處理中選擇生長(zhǎng)良好的5個(gè)植株作為待測(cè)植株。待測(cè)植株測(cè)量前在人工氣候室中經(jīng)2 h暗適應(yīng)后，使用LI-6400-XT光合測(cè)定系統(tǒng)儀（LCF熒光探頭，LI-6400-40）分別測(cè)定不同處理時(shí)期初始熒光（Fo）、最大熒光（Fm）、可變熒光（Fv）、PSⅡ潛在活性（Fv/Fo）和PSⅡ最大光化學(xué)效率（Fv/Fm），隨后打開LI-6400-40活化光對(duì)同一葉片光活化，根據(jù)測(cè)定葉片平行高度上的平均光強(qiáng)設(shè)定活化光強(qiáng)度為14 400 lx。每個(gè)處理共重復(fù)15次。測(cè)定指標(biāo)包括PSⅡ光量子產(chǎn)量（ΦPSⅡ）、電子傳遞速率（ETR）、光化學(xué)猝滅系數(shù)（qP）和非光化學(xué)猝滅系數(shù)（NPQ）。其中ETR=活化光強(qiáng)度×ΦPSⅡ×0.5×0.84；NPQ=Fm/Fm′-1。其余參數(shù)由儀器測(cè)定，取平均值。

1.3 篤斯越橘葉片蛋白組分析

1.3.1 iTRAQ標(biāo)記

采用丙酮沉淀法提取篤斯越橘幼苗葉片蛋白質(zhì)。提取后蛋白樣品作還原烷基化處理，用考馬斯亮蘭法測(cè)定蛋白濃度，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)后，將樣品取等量蛋白用Trypsin酶酶解。iTRAQ 119和121標(biāo)記未經(jīng)低溫處理的葉片蛋白，iTRAQ 113、114和115標(biāo)記4℃和短日照10 h/14 h（晝/夜）處理的葉片蛋白，iTRAQ116、117、118標(biāo)記4℃和長(zhǎng)日照14 h/10 h（晝/夜）處理的葉片蛋白，即2個(gè)處理分別為3次重復(fù)，對(duì)照為2次重復(fù)。最后將標(biāo)記的8組樣品室溫靜止2 h后等量混合。應(yīng)用強(qiáng)陽離子交換色譜方法預(yù)分離混合后的肽段，再作液相分離和質(zhì)譜分析。

1.3.2 差異蛋白選擇

如果某個(gè)蛋白差異倍數(shù)（Fold change）≥1.20或≤0.83，同時(shí)經(jīng)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)P＜0.05，則認(rèn)為是差異蛋白。

1.4 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS22統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)作差異顯著性分析與多重比較；應(yīng)用Excel 2010繪制數(shù)據(jù)圖表。采用Mascot 2.3.02軟件與選定蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，得到最終蛋白鑒定結(jié)果。數(shù)據(jù)庫(kù)來源為篤斯越橘轉(zhuǎn)錄組、NCBInr和Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)。使用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)分析光合作用及碳固定相關(guān)差異蛋白富集途徑（http：//www.genome.jp/kegg/）。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫下不同日照長(zhǎng)度對(duì)葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

由圖1A可知，當(dāng)?shù)蜏劐憻? d時(shí)，長(zhǎng)日照處理下Fo與對(duì)照相比顯著升高，而短日照處理下與對(duì)照差異不顯著，之后兩種處理下緩慢升高，至21 d時(shí)短日照和長(zhǎng)日照處理Fo值分別比對(duì)照顯著提高18.57%和21.46%，但二者間差異不顯著，表明低溫鍛煉后PSⅡ反應(yīng)中心受損傷，主要由低溫誘導(dǎo)引起。低溫鍛煉7 d時(shí)，兩種處理下植株葉片F(xiàn)m降低不顯著，隨低溫鍛煉時(shí)間延長(zhǎng)，F(xiàn)m均逐步下降，顯著低于對(duì)照（見圖1B），表明低溫鍛煉減弱植株P(guān)SⅡ反應(yīng)中心電子傳遞能力，產(chǎn)生光抑制。隨低溫鍛煉時(shí)間延長(zhǎng)，兩種日照處理下Fv/Fo均呈快速下降趨勢(shì)，顯著低于對(duì)照，但二者間差異不顯著（見圖1C）；Fv/Fm均呈緩慢下降趨勢(shì)（見圖1D），低溫鍛煉7 d時(shí)與對(duì)照差異較小，之后顯著低于對(duì)照，上述結(jié)果表明低溫鍛煉期間PSⅡ受損，PSⅡ潛在活性比最大光化學(xué)效率對(duì)環(huán)境變化響應(yīng)快，且減弱程度較大。

由圖1E和F可知，與對(duì)照相比，低溫鍛煉7 d時(shí)植株葉片ΦPSⅡ和ETR顯著降低，之后緩慢降低或保持穩(wěn)定，但不同光周期處理間無顯著差異，說明表觀光合量子傳遞效率和光合效率降低主要由低溫引起。低溫鍛煉期間qP變化趨勢(shì)與ΦPSⅡ相似，但在低溫長(zhǎng)日照處理下降幅更大（見圖1G），說明qP主要受低溫影響，PSⅡ受體側(cè)電子傳遞受損，PSⅡ光合活性降低。本試驗(yàn)低溫長(zhǎng)日照處理7 d時(shí)，NPQ降低不明顯，而低溫短日照處理下顯著低于對(duì)照；處理21 d時(shí)，兩種光周期處理下葉片NPQ均顯著低于對(duì)照（見圖1H），表明低溫下不同日照處理均未表現(xiàn)自我保護(hù)機(jī)制。

2.2 篤斯越橘葉片響應(yīng)低溫和短日照的蛋白質(zhì)定量鑒定

2.2.1 蛋白質(zhì)定量鑒定

為確定差異蛋白，將iTRAQ分析結(jié)果分為3種不同比率（比較組），包括SD/CHU（低溫短日照條件與對(duì)照相比），LD/CHU（低溫長(zhǎng)日照條件與對(duì)照相比）和SD/LD（低溫短日照與低溫長(zhǎng)日照相比）。SD/CHU和LD/CHU表示低溫與日照組合對(duì)蛋白表達(dá)的影響，SD/LD表示低溫下短日照效果。共鑒定出50個(gè)差異表達(dá)的光合作用相關(guān)蛋白，包括PSⅡ反應(yīng)中心蛋白、PSⅠ反應(yīng)中心蛋白、捕光葉綠素蛋白復(fù)合物、卡爾文循環(huán)和C4循環(huán)相關(guān)蛋白（見表1～4）。

2.2.2 葉片中光合作用蛋白表達(dá)變化

本試驗(yàn)結(jié)果表明，PsbE的α亞基DL/CHU和LL/CHU均顯著下調(diào)，SD/LD顯著上調(diào)，說明PSⅡ核心復(fù)合體受低溫和光周期影響，其中受低溫短日照影響程度顯著小于低溫長(zhǎng)日照；放氧增強(qiáng)蛋白1（PsbO）、放氧增強(qiáng)蛋白2（PsbP）和放氧增強(qiáng)蛋白3（PsbQ）在低溫短日照下顯著下調(diào)表達(dá)，在低溫長(zhǎng)日照下PsbO和PsbP豐度穩(wěn)定，PsbQ下調(diào)，表明低溫短日照對(duì)放氧增強(qiáng)蛋白的不利影響大于低溫長(zhǎng)日照；推測(cè)光系統(tǒng)Ⅱ修復(fù)蛋白PSB27-H1和PsbH受低溫影響顯著下調(diào)。上述結(jié)果說明低溫和光周期對(duì)PSⅡ復(fù)合體不同種類蛋白豐度影響不同，但多數(shù)蛋白受低溫短日照影響較大。捕光復(fù)合物Ⅱ葉綠素a/b結(jié)合蛋白21（LHCb1）、捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白151（LHCb2）、捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白13（LHCb3）、捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白CP29.1（LHCb4）、捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白CP26（LHCb5）和捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白CP24 10A（LHCb6）的SD/CHU和LD/CHU均顯著下調(diào)，其中LHCb2、LHCb3、LHCb4、LHCb5和LHCb6的SD/LD顯著上調(diào)（見表1），捕光天線蛋白豐度受低溫短日照影響程度小于低溫長(zhǎng)日照。LHCII下調(diào)降低光能吸收能力，影響光合作用。

圖1 光周期對(duì)低溫鍛煉期篤斯越橘葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響Fig.1 Effect of photoperiod on chlorophyll fluorescenceparameters in bog bilberriesduring cold acclimation stage

表1 鑒定的篤斯越橘葉片響應(yīng)低溫和不同光周期差異表達(dá)的PSⅡ反應(yīng)中心蛋白和PSⅡ光捕光復(fù)合物Table1 Identified differential expression of photosystem IIreaction center protein and PSⅡlight harvesting complexⅡin leaves of bog bilberry in response to low temperature and different photoperiod

本研究中，PsaE在低溫長(zhǎng)日照下與對(duì)照無差異，而P700葉綠素a脫輔基蛋白A2（PsaB）、PSⅠ反應(yīng)中心亞基Ⅲ（PsaF）、PsaK和Ⅺ（PsaL）、Ⅳ（PsaE）、V（PsaG）、O 亞基（PsaO）、N 亞基（PsaN）在低溫短日照和長(zhǎng)日照處理后均顯著下調(diào)，其中PsaK和PsaN下調(diào)僅受低溫影響，其余亞基在低溫短日照下降幅顯著小于低溫長(zhǎng)日照（見表2），說明不同種類PSⅠ復(fù)合體亞基豐度受低溫和光周期影響程度不同，多數(shù)亞基受低溫長(zhǎng)日照影響較大。PSⅠ復(fù)合體重構(gòu)，影響光合電子傳遞，降低光合速率。在低溫短日照下質(zhì)體藍(lán)素（PC）和鐵氧還原蛋白（Pd）豐度下調(diào)，低溫長(zhǎng)日照下豐度未發(fā)生變化或上調(diào)，說明低溫短日照嚴(yán)重影響光合電子傳遞和光合作用。

本研究中兩種低溫鍛煉條件下ATP合酶β、γ、δ、ε和b亞基豐度均下調(diào)，其中δ亞基的SD/LD下調(diào)，b亞基的SD/LD上調(diào)，其余亞基SD/LD無顯著差異（見表3），上述結(jié)果說明ATP合酶大多數(shù)亞基受低溫影響豐度下調(diào)，而δ亞基和b亞基受光周期影響較大。ATP合酶亞基豐度降低，影響ATP合成，進(jìn)一步影響光合作用卡爾文循環(huán)，降低光合速率。

參與卡爾文循環(huán)的核酮糖二磷酸羧化酶小鏈、3-磷酸甘油醛脫氫酶（胞質(zhì)）、果糖1，6-二磷酸醛縮酶、果糖1，6-二磷酸酶和轉(zhuǎn)酮醇酶豐度均受低溫短日照影響而顯著增加；其中3-磷酸甘油醛脫氫酶（胞質(zhì)樣）、果糖1，6二磷酸酶（葉綠體）增加幅度大于低溫長(zhǎng)日照；葉綠體3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPCP1）和核酮糖二磷酸羧化酶小鏈增加幅度小于低溫長(zhǎng)日照，其余兩種酶僅受低溫影響而上調(diào)?？栁难h(huán)相關(guān)酶3-磷酸甘油酸激酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶A亞基和B亞基、丙糖磷酸異構(gòu)酶和核糖5-磷酸異構(gòu)酶豐度均受低溫短日照影響而顯著降低，其中與低溫長(zhǎng)日照相比，3-磷酸甘油醛脫氫酶A亞基降幅較小，丙糖磷酸異構(gòu)酶降幅較大，其余3種酶僅受低溫影響（見表4）。

由表4可知，低溫短日照下NAD-依賴的蘋果酸酶59 ku同工型和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨基酶豐度上調(diào)（前者與低溫長(zhǎng)日照無顯著差異，后者顯著高于低溫長(zhǎng)日照），利于CO2和丙酮酸形成，而NADP依賴性蘋果酸酶和丙酮酸磷酸二激酶在低溫短日照下調(diào)（下調(diào)程度接近或低于低溫長(zhǎng)日照），影響CO2形成和磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）生成改變C4循環(huán)。結(jié)果說明篤斯越橘存在的C4循環(huán)受低溫鍛煉環(huán)境的影響，其中低溫短日照下影響較??；推測(cè)NAD-依賴的蘋果酸酶和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨基酶上調(diào)，說明其在低溫抗性反應(yīng)中發(fā)揮作用。

表2 鑒定的篤斯越橘葉片響應(yīng)低溫和不同光周期差異表達(dá)的PSⅠ反應(yīng)中心蛋白Table 2 Identified differential expression of photosystem I reaction center proteins in leaves of bog bilberry in response to low temperature and different photoperiod

表3 鑒定的篤斯越橘葉片響應(yīng)低溫和不同光周期差異表達(dá)的光合電子傳遞蛋白和ATP合成酶亞基Table 3 Identified differential expression proteins involved to photosynthetic electron transpor and subunit of ATPsynthasein leaves of bog bilberry in response to low temperature and different photoperiod

表4 鑒定的篤斯越橘葉片響應(yīng)低溫和不同光周期的光合生物碳固定相關(guān)差異表達(dá)蛋白Table4 Identified differential expression proteinsrelated to carbon fixation in photosynthetic organisms in leaves of bog bilberry in response to low temperature and different photoperiod

3 討論與結(jié)論

3.1 低溫和短日照對(duì)篤斯越橘葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

秋季低溫和縮短光周期是樹木停止生長(zhǎng)和（或）降低光合作用的信號(hào)，不同物種對(duì)環(huán)境信號(hào)反應(yīng)不同[12]。低溫可引起植物葉片光合機(jī)構(gòu)損傷，影響PSⅡ反應(yīng)中心光合電子傳遞和光合磷酸化過程，引起碳反應(yīng)相關(guān)酶變化[13]。光周期也是引起木本植物秋季光合作用下降的重要信號(hào)。本研究中兩種低溫鍛煉條件均使篤斯越橘葉片F(xiàn)o顯著上升，F(xiàn)v/Fm和Fv/Fo顯著下降，ΦPSⅡ、有效電子傳遞效率ETR和qP顯著降低，說明低溫導(dǎo)致PSⅡ反應(yīng)中心發(fā)生部分失活或傷害，降低反應(yīng)中心對(duì)激發(fā)能捕獲能力和光合電子由PSⅡ反應(yīng)中心向質(zhì)體醌（QA、QB、PQ）庫(kù)傳遞效率，影響光合速率。

3.2 低溫短日照對(duì)篤斯越橘光合相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

光合作用是植物體內(nèi)復(fù)雜的生理生化代謝過程，包括光能捕獲與轉(zhuǎn)化、水光解、電子傳遞、光合磷酸化、碳同化及同化物轉(zhuǎn)化與運(yùn)輸?shù)?。本研究發(fā)現(xiàn)受低溫和短日照影響，篤斯越橘光合電子傳遞相關(guān)蛋白豐度顯著下調(diào)，大量參與卡爾文循環(huán)的蛋白上調(diào)，這可能是對(duì)低溫脅迫的特殊反應(yīng)，保護(hù)植物免受光抑制。

3.2.1 低溫和短日照對(duì)篤斯越橘光合機(jī)構(gòu)及光合電子傳遞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

通過KEGG分析得知，經(jīng)低溫鍛煉后植株光合作用PSⅡ反應(yīng)中心和LHCⅡ、PSⅠ反應(yīng)中心蛋白及光合電子傳遞相關(guān)蛋白顯著下調(diào)，說明低溫可能導(dǎo)致ROS積累，破壞光合機(jī)構(gòu)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，放氧增強(qiáng)蛋白1（PsbO）、放氧增強(qiáng)蛋白2（PsbP）和放氧增強(qiáng)蛋白3（PsbQ）在低溫短日照下豐度顯著下調(diào)表達(dá)，在低溫長(zhǎng)日照下PsbO和PsbP穩(wěn)定，PsbQ下調(diào)；此外低溫鍛煉環(huán)境導(dǎo)致篤斯越橘葉片PSⅡ復(fù)合體反應(yīng)中心Cytb559α亞基和捕光葉綠素蛋白復(fù)合物L(fēng)HCb1、LHCb2、LHCb3、LHCb4、LHCb5和LHCb6蛋白均下調(diào)表達(dá)，其中低溫短日照下蛋白下降幅度小于低溫長(zhǎng)日照。本試驗(yàn)結(jié)果表明，低溫和短日照組合環(huán)境嚴(yán)重破壞PSⅡ反應(yīng)中心和捕光葉綠素蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)，使類囊體膜受損，光捕獲能力和光合電子傳遞能力降低，與前文通過篤斯越橘葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化測(cè)定結(jié)果一致。低溫鍛煉引起1個(gè)PSⅠ葉綠素脫輔基蛋白和8個(gè)PSⅠ反應(yīng)中心亞基下調(diào)表達(dá)，表明低溫導(dǎo)致篤斯越橘PSⅠ發(fā)生光抑制，降低光合能量生成能力，間接導(dǎo)致其后續(xù)光合產(chǎn)物合成量減少，影響其低溫適應(yīng)能力[14]。與低溫長(zhǎng)日照相比，PSⅠ反應(yīng)中心對(duì)低溫短日照適應(yīng)能力較強(qiáng)。ATP合酶參與光合磷酸化和氧化磷酸化反應(yīng)，利用與電子傳遞耦聯(lián)的跨膜質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)將ADP和無機(jī)磷合成ATP。低溫短日照下白樺（Betula platyphylla Suk）ATP合酶β亞基表達(dá)顯著下調(diào)[15]。本研究篤斯越橘ATP合酶β、γ和ε亞基受低溫影響下調(diào)表達(dá)；與低溫長(zhǎng)日照相比，δ亞基受低溫短日照影響下調(diào)程度較大，而b亞基受低溫短日照影響下調(diào)程度較小。ATP合酶不同亞基下調(diào)表達(dá)可能影響光合磷酸化產(chǎn)生ATP，間接影響卡爾文循環(huán)，減少抗寒保護(hù)物質(zhì)可溶性糖合成量，降低篤斯越橘葉片低溫適應(yīng)能力。

3.2.2 低溫和短光周期對(duì)篤斯越橘碳固定途徑相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

光合作用關(guān)鍵酶R ubisco小亞基參與CO2與Mg2+對(duì)酶的活化，維持和穩(wěn)定酶的活化構(gòu)象，影響Rubisco催化活性和專一性[16]。低溫脅迫下兩種繡線菊Rubisco小鏈含量顯著增加[10]；果糖-1，6-二磷酸醛縮酶參與糖酵解、卡爾文循環(huán)等代謝過程，是植物體糖代謝、可溶性糖積累關(guān)鍵酶之一；植物轉(zhuǎn)酮醇酶（TK）也是植物卡爾文循環(huán)中起關(guān)鍵作用的酶類，參與1，5-二磷酸核酮糖再生及光合過程糖類轉(zhuǎn)化與運(yùn)輸。本研究中Rubisco小鏈、果糖-1，6-二磷酸醛縮酶和酮醇酶受低溫短日照影響上調(diào)，此外參與卡爾文循環(huán)的3-磷酸甘油醛脫氫酶、果糖1，6二磷酸酶與上述3種酶呈相同變化趨勢(shì)，酶豐度上調(diào)可增加細(xì)胞可溶性糖濃度，有利于提高低溫抗性；而3-磷酸甘油酸激酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶A亞基和B亞基、丙糖磷酸異構(gòu)酶和核糖5-磷酸異構(gòu)酶豐度則受低溫短日照影響顯著降低。說明低溫短日照下篤斯越橘通過調(diào)整卡爾文循環(huán)相關(guān)酶水平以應(yīng)對(duì)低溫對(duì)能量代謝的不利影響，可能是低溫適應(yīng)機(jī)制的一部分。

C3植物中存在C4循環(huán)[17]，標(biāo)志細(xì)胞有可能通過“CO2泵”的方式提高光合碳循環(huán)CO2濃度，使1，5-二磷酸核酮糖羧化酶催化方向朝有利于形成碳水化合物的方向運(yùn)轉(zhuǎn)。丙酮酸磷酸雙激酶（PPDK）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨基酶和NAD（P）-蘋果酸酶是C4循環(huán)關(guān)鍵酶。在C4循環(huán)中，線粒體NAD-蘋果酸酶（NAD-ME）和NADP-蘋果酸酶（NADP-ME）是催化L-蘋果酸脫羧的酶，其底物和產(chǎn)物參與光合作用[18]；PPDK是C4途徑限速酶，對(duì)光合功能具有重要調(diào)節(jié)作用。本研究中，低溫短日照下NADP-蘋果酸酶和PPDK顯著下調(diào)表達(dá)，表明環(huán)境變化已嚴(yán)重影響篤斯越橘C4循環(huán)，而天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和NAD依賴性蘋果酸酶59 ku上調(diào)表達(dá)降低上述不利影響，維持C4循環(huán)。

綜上所述，在低溫短日照處理后，篤斯越橘葉片中PSⅡ復(fù)合體反應(yīng)中心Cytb559α亞基、放氧增強(qiáng)蛋白、光捕獲復(fù)合體Ⅱ蛋白及PSⅠ反應(yīng)中心亞基、質(zhì)體藍(lán)素、鐵氧還蛋白3和ATP合酶亞基β、γ、δ、ε和b亞基含量均顯著降低，導(dǎo)致光合機(jī)構(gòu)受損及光合電子傳遞功能降低；篤斯越橘通過顯著上調(diào)參與卡爾文循環(huán)核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小鏈、3-磷酸甘油醛脫氫酶、果糖1，6-二磷酸醛縮酶、果糖1，6-二磷酸酶和轉(zhuǎn)酮醇酶的表達(dá)，顯著下調(diào)3-磷酸甘油酸激（葉綠體）、3-磷酸甘油醛脫氫酶A亞基和B亞基、丙糖磷酸異構(gòu)酶和核糖5-磷酸異構(gòu)酶的表達(dá)以適應(yīng)低溫環(huán)境。低溫短日照下與C4循環(huán)有關(guān)的酶上調(diào)或下調(diào)表達(dá)間接影響光合碳同化。