易錯(cuò)PCR法提高L-氨基酸脫氨酶全細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-異亮氨酸生產(chǎn)α-酮-β-甲基正戊酸效率

郭濛檬 ， 劉 龍 ， 李江華 ， 堵國(guó)成 *， 陳 堅(jiān)

（1．江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2．江南大學(xué) 生物系統(tǒng)與生物加工工程研究室，江蘇 無錫214122）

α-酮-β-甲基正戊酸（KMV）是一種含有雙官能團(tuán)的支鏈酮酸，是有機(jī)合成、藥物合成以及生物合成中的重要中間體，在醫(yī)藥和化學(xué)合成領(lǐng)域具有廣泛的研究與應(yīng)用[1]。Huang等人研究發(fā)現(xiàn)KMV可以改善神經(jīng)退行性疾病中出現(xiàn)的線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激現(xiàn)象[2]；有研究報(bào)道1～20 mmol/L KMV可以在低氧情況下使細(xì)胞活性增強(qiáng)[3]；α-酮酸還可用于治療氮代謝疾病和慢性尿毒癥，通過降低蛋白食物中氮的攝入量，降低腎過濾壓力[4]。

有氧條件下，L-氨基酸脫氨酶催化L-Ile發(fā)生氧化脫氨基反應(yīng)，生成KMV和氨。L-氨基酸氧化酶也可以催化L-氨基酸生成相應(yīng)酮酸，但大部分L-氨基酸氧化酶催化反應(yīng)過程中生成雙氧水，而雙氧水會(huì)降低酶的活性，同時(shí)會(huì)對(duì)酮酸的穩(wěn)定性造成影響[5]，因此本研究選擇L-氨基酸脫氨酶作為研究對(duì)象。Proteus[6-9]、Providencia[10]和 Morganella[11]這 3 種屬的L-氨基酸脫氨酶均位于細(xì)胞膜上。在變形桿菌屬（Proteus） 中 ，Proteus mirabilis[6-7]、Proteus vulgaris[9]、Proteus rettgeri[12]、Proteus myxofaciens[8]來源的 L-氨基酸脫氨酶均成功在大腸桿菌中表達(dá)。

與純酶轉(zhuǎn)化相比，全細(xì)胞轉(zhuǎn)化有很多優(yōu)勢(shì)：易制備，成本低；更穩(wěn)定，不易受環(huán)境溫度、pH等因素影響，使用方便；無污染，副產(chǎn)物少。目前已有多個(gè)以全細(xì)胞轉(zhuǎn)化氨基酸方式生產(chǎn)相應(yīng)酮酸的研究報(bào)道。Hossain等人在枯草芽孢桿菌和大腸桿菌中分別異源表達(dá)來自Proteus mirabilis的脫氨酶和Proteus vulgaris的L-氨基酸脫氨酶，并用構(gòu)建的重組菌分別全細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-谷氨酸、L-蛋氨酸生成α-酮戊二酸、α-酮-γ-甲硫基丁[13-14]；Hou 等人在大腸桿菌中表達(dá)來自Proteus mirabilis的脫氨酶，并用重組菌株全細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生成苯丙酮酸[15]；Song等人在大腸桿菌中異源表達(dá)來自Proteus vulgaris的脫氨酶，并全細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-亮氨酸生成α-酮異己酸[16]。

本研究將來自Proteus mirabilis中的L-氨基酸脫氨酶作為研究對(duì)象。為了提高該酶對(duì)L-異亮氨酸（L-Ile）的催化能力，獲得更高的KMV產(chǎn)量，利用易錯(cuò)PCR方法對(duì)該L-氨基酸脫氨酶進(jìn)行定向進(jìn)化，構(gòu)建L-氨基酸脫氨酶突變庫，并結(jié)合高通量篩選方法得到催化能力提高的突變株。

1 材料與方法

1.1 相關(guān)試劑

SanPrep柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒、Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、DNA純化試劑盒、限制性內(nèi)切酶Nde I和Xho I、T4-DNA連接酶均購自TAKARA 公司（大連、中國(guó)）；GeneMorph II Random Mutagenesis試劑盒購自安捷倫公司；α-酮-β-甲基正戊酸（KMV）標(biāo)樣購買于Sigma-Aldrich有限公司（MO，美國(guó)）；氨芐青霉素和IPTG購買于上海生工。

1.2 菌種和培養(yǎng)基

本實(shí)驗(yàn)所用到的菌株和質(zhì)粒如表1所示。用10 mL LB培養(yǎng)基培養(yǎng)種子液，用TB培養(yǎng)基對(duì)菌體進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。LB液體培養(yǎng)基：10 g/L胰蛋白胨，5 g/L 酵母提取物，10 g/L NaCl，100 μg/mL 氨芐青霉素；TB液體培養(yǎng)基：12 g/L胰蛋白胨，24 g/L酵母提取物，4 g/L 甘油，17 mmol/L KH2PO4，72 mmol/L K2HPO4和 100 μg/mL 氨芐青霉素（Amp）。

表1 本研究中所用到的菌株、質(zhì)粒和引物Table 1 Strains，plasmids and oligonucleotides used in the reseach

1.3 全細(xì)胞催化劑制備

重組菌株接種10 mL LB培養(yǎng)基培養(yǎng)10 h（37℃，220 r/min），1%接種量接種 50 mL TB 培養(yǎng)基中，37℃條件下培養(yǎng)至菌液OD600為1.0左右，添加終濃度為0.21 mmol/L的IPTG，37℃條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)4.5 h。誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后，4℃下離心 （1 200 r/min，5 min），并收集菌體。

1.4 全細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-Ile生成KMV

菌體用pH 8.5 Tris-HCl緩沖液洗滌一次，重懸至適當(dāng)濃度。用UVmini-1240分光光度計(jì)（日本島津）測(cè)定細(xì)胞懸浮液OD600，用公式（1）計(jì)算細(xì)胞質(zhì)量濃度（DCW，g/L）[13]

DCW=0.444 2×OD600－0.021 （1）

測(cè)定反應(yīng)速率的反應(yīng)體系為：18 g/L Ile（pH 8.5 Tris-HCl），1 g/L 細(xì)胞量（DCW），220 r/min，30 ℃，體積1 mL，反應(yīng)時(shí)間20 min。反應(yīng)結(jié)束后12 000 r/min離心5 min，取上清，HPLC測(cè)定反應(yīng)液中KMV濃度。

1.5 用易錯(cuò)PCR法對(duì)pma進(jìn)行隨機(jī)突變以及突變庫構(gòu)建

使用GeneMorph II Random Mutagenesis試劑盒對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行隨機(jī)突變。易錯(cuò)PCR體系（50 μL）：重組質(zhì)粒（pET-20b（+）-pma）作為模板，EP/pma-1和EP/pma-2作為上下游引物，各1 μL，Mutazyme II DNA 聚合酶 1 μL，dNTPs 1 μL，10× Mutazyme II反應(yīng)緩沖液5 μL，用ddH2O補(bǔ)足反應(yīng)體系。易錯(cuò)PCR條件為：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃1.5 min（20～30個(gè)循環(huán)）；72℃ 5 min。將柱回收產(chǎn)物作為引物，進(jìn)行下一輪Megaprimer PCR反應(yīng)[17]。Megaprimer PCR反應(yīng)體系為50 μL：質(zhì)粒模板50 ng，引物500 ng，聚合酶PrimeSTAR HS預(yù)混物 25 μL，用ddH2O補(bǔ)足反應(yīng)體系。Megaprimer PCR反應(yīng)條件為：98 ℃ 3 min；98 ℃ 10 s，62 ℃ 15 s，72 ℃ 3 min 42 s（30個(gè)循環(huán)）；72℃ 5 min。用 Dpn I限制性內(nèi)切酶消化Megaprimer PCR反應(yīng)產(chǎn)物，37℃下酶切2 h。消化后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3）感受態(tài)，進(jìn)行LB抗性平板篩選。平板上所有轉(zhuǎn)化子挑到含有 1 mL LB培養(yǎng)基/孔 （100 μg/mL氨芐青霉和0.21 mmol/L IPTG）的96深孔板中，37℃培養(yǎng)。

1.6 高通量篩選方法

高通量篩選流程圖如圖1所示。將接種有突變子的96深孔板于37℃培養(yǎng)10 h，從中取100 μL菌液于96淺孔板中，添加50 μL 28 g/L L-Ile，混勻后于30°C轉(zhuǎn)化1 h，反應(yīng)結(jié)束后，添加50 μL 60 g/L FeCl3溶液，并混勻。依照96淺孔板上顯深墨綠色孔的位置，在96深孔板中找到相應(yīng)的突變株，并在5 mL離心管中分別測(cè)定全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)速率和全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)進(jìn)行3 h后1 mL轉(zhuǎn)化體系中KMV的質(zhì)量濃度。然后選擇反應(yīng)速率較高或者KMV生成量較高的突變子，在250 mL三角瓶中測(cè)定它們?cè)?00 mmol/L L-Ile條件下的最大KMV產(chǎn)量：轉(zhuǎn)化體系為 20 mL，1 g/L 細(xì)胞量 （DCW），220 r/min，30℃下反應(yīng)20～24 h。

1.7 α-酮-β-甲基正戊酸（KMV）測(cè)定方法

采用高效液相色譜法測(cè)定樣品中的α-酮-β-甲基正戊酸質(zhì)量濃度。取0.6 mL離心后的轉(zhuǎn)化液上清，用0.45 μm孔徑濾膜過濾，所得濾液即為待測(cè)試樣。色譜條件為：Agilent 1260型高效液相色譜儀，伯樂 Aminex HPX-87H色譜柱（300×7.8 mm，9 μm），流動(dòng)相為 5 mmol/L 稀 H2SO4，進(jìn)樣量 10 μL，流速為0.6 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，柱溫為40℃，進(jìn)樣時(shí)間為30 min。

圖1 高通量篩選流程Fig.1 Process of high throughput screening

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量篩選結(jié)果

經(jīng)過多輪易錯(cuò)PCR，得到了兩株正向突變株5/13-26和7/23-6。突變株5/13-26全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)速率要高于對(duì)照菌13.8%（圖2（a））；用它們?nèi)?xì)胞轉(zhuǎn)化900 mmol/L L-Ile，KMV產(chǎn)量分別要高于對(duì)照菌 8%，13%（圖 2（b））。 對(duì)突變株 5/13-26、7/23-6的外源L-氨基酸脫氨酶基因測(cè)序后，分析其氨基酸序列，并與親本脫氨酶的氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果如表2所示，可以發(fā)現(xiàn)突變酶7/23-6比5/13-26僅多了一個(gè)氨基酸突變位點(diǎn)A209E。

圖2 突變株初始全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)速率及全細(xì)胞轉(zhuǎn)化900 mmol/L L-Ile KMV產(chǎn)量比較Fig.2 comparison of the original whole-cell biocatalyst reaction rates between mutantstrains and comparison of KMV production between mutant strains under 900 mmol/L L-Ile

表2 正向突變株外源氨基酸脫氨酶氨基酸突變位點(diǎn)Table 2 Amino acid mutation sites of exogenous amino acid deaminases from mutant strains

2.2 突變株全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件優(yōu)化

2.2.1 突變株全細(xì)胞催化劑最適pH 如圖3（a）所示，突變株5/13-26和7/23-6最適反應(yīng)pH均為8.5，且在pH 8.0～9.0范圍內(nèi)，突變株5/13-26全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)速率高于對(duì)照菌。不同pH下突變株全細(xì)胞催化劑的相對(duì)活性變化情況如圖3（b）所示，可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH為7.5時(shí)突變株5/13-26活性下降幅度最大，約34%。而在實(shí)際的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中，由于大量KMV生成，緩沖液pH值會(huì)由最初的8.5逐步下降為7.3左右。所以，突變株5/13-26的L-氨基酸脫氨酶可能對(duì)反應(yīng)pH值變化較為敏感，酶活性也因此受到影響。

圖3 反應(yīng)pH對(duì)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of pH on whole-cell biocatalyst

2.2.2 突變株全細(xì)胞催化劑最適反應(yīng)溫度 在20～37℃范圍內(nèi)，設(shè)置4個(gè)溫度梯度，測(cè)定全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)進(jìn)行24 h后的KMV產(chǎn)量，結(jié)果如圖4所示?？梢园l(fā)現(xiàn)，突變株5/13-26和7/23-6全細(xì)胞催化劑最適反應(yīng)溫度為30℃。當(dāng)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化溫度為37℃時(shí)，突變株5/13-26全細(xì)胞催化劑的KMV產(chǎn)量下降幅度最大，這可能與突變株5/13-26的外源L-氨基酸脫氨酶熱穩(wěn)定性有關(guān)。

2.2.3 突變株全細(xì)胞催化劑最適反應(yīng)時(shí)間 以900 mmol/L L-Ile為底物，以pH 8.5 Tris-HCl為緩沖液，使用1 g/L細(xì)胞量（DCW），在30°C下進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)，測(cè)定12～24 h內(nèi)不同菌株全細(xì)胞催化反應(yīng)中KMV產(chǎn)量隨時(shí)間的變化情況，結(jié)果如圖5所示，可以發(fā)現(xiàn)，突變株5/13-26和7/23-6全細(xì)胞催化反應(yīng)在轉(zhuǎn)化反應(yīng)進(jìn)行24 h后KMV達(dá)到最大值，對(duì)照株在21 h時(shí)達(dá)到最大值。在轉(zhuǎn)化反應(yīng)進(jìn)行至21 h之后，KMV產(chǎn)量增加幅度在逐步降低，這說明在轉(zhuǎn)化反應(yīng)后期，全細(xì)胞催化劑的酶催化活性已經(jīng)大幅度降低。

圖4 反應(yīng)溫度對(duì)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of reaction tempreture on whole-cell biocatalyst

圖5 轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)間對(duì)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響Fig.5 Effect of reaction time on whole-cell biocatalyst

2.2.4 突變株全細(xì)胞催化劑最適底物濃度 在600～1 200 mmol/L L-Ile范圍內(nèi)設(shè)置了5個(gè)濃度梯度，測(cè)定全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)進(jìn)行21～24 h后的最大的KMV產(chǎn)量，可以發(fā)現(xiàn)突變株5/13-26和7/23-6最適底物濃度均為900 mmol/L L-Ile，而初始菌最適底物濃度為 800 mmol/L L-Ile（圖 6（a）），這說明該兩株突變株全細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-Ile的能力要強(qiáng)于對(duì)照菌。當(dāng)繼續(xù)增加底物濃度，KMV產(chǎn)量反而出現(xiàn)了下降（圖6(a)），這說明當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間暴露于高濃度的L-Ile飽和溶液中時(shí)全細(xì)胞催化劑受底物抑制的現(xiàn)象才顯現(xiàn)出來。此外，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?00～800 mmol/L時(shí)，這三株菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)底物轉(zhuǎn)化率均在90%以上，繼續(xù)增加底物濃度時(shí)，底物轉(zhuǎn)化率均急劇下降（圖6(b)）。盡管如此，在900 mmol/L L-Ile下，突變株7/23-6的KMV產(chǎn)量可以達(dá)到102 g/L，底物轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到87%，與對(duì)照菌相比，底物轉(zhuǎn)化率提高了13%。

圖6 比較突變株5/13-26、7/23-6與初始菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化不同濃度L-IleFig.6 Comparison of whole-cell biocatalysts between 5/13-26，7/23-6 and the original strain under different L-Ile concentration

綜上所述，1 g/L突變株全細(xì)胞催化劑（DCW）全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)最適轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件為：以pH 8.5 Tris-HCl為緩沖液，用900 mmol/L L-Ile作為底物，并在30℃下進(jìn)行全細(xì)胞催化反應(yīng)，最適反應(yīng)時(shí)間為21～24 h。在此反應(yīng)條件下，突變株7/23-6全細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-Ile可生成102 g/L KMV。

2.3 產(chǎn)物KMV以及反應(yīng)時(shí)間對(duì)突變株全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響

2.3.1 產(chǎn)物KMV對(duì)突變株全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)速率的影響 向轉(zhuǎn)化體系中添加100 mmol/L KMV，研究KMV對(duì)不同突變株全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)速率的影響，并與不添加KMV時(shí)的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)速率進(jìn)行比較（圖7（a）），可以發(fā)現(xiàn)，所有菌株的轉(zhuǎn)化反應(yīng)速率在添加KMV后均出現(xiàn)了不同程度的降低，產(chǎn)物KMV對(duì)酶活性產(chǎn)生了比較明顯的抑制作用。添加KMV后速率下降百分比如圖7（b）所示，突變株5/13-26速率下降幅度最大，約32%，高于對(duì)照菌的27%。

圖7 產(chǎn)物KMV對(duì)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)速率的影響Fig.7 Effect of KMV on whole-cell biocatalyst reaction rate

2.3.2 轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)間對(duì)突變株全細(xì)胞催化劑熱穩(wěn)定性的影響 將正向突變株在30℃下熱處理不同時(shí)間，測(cè)定其全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)速率，結(jié)果如圖8（a）所示，熱處理24 h內(nèi)，突變株5/13-26的反應(yīng)速率均高于對(duì)照菌，然而其相對(duì)活性下降幅度最大（圖8（b）），約 25%；雖然熱處理 24 h 內(nèi)，突變株 7/23-6反應(yīng)速率一直低于對(duì)照菌，但其相對(duì)活性下降幅度最小，約 14%（圖 8（b）），低于對(duì)照菌 36.7%。由此可見，除了產(chǎn)物KMV對(duì)酶活性有明顯的抑制作用外，氨基酸脫氨酶的熱穩(wěn)定性是另外一個(gè)不可忽略的影響因素。

3 結(jié) 語

L-氨基酸脫氨酶活性的測(cè)定，可以通過對(duì)酶催化產(chǎn)物組分如氨氣[18]、α-酮酸[19]進(jìn)行測(cè)定，也可以用經(jīng)典瓦氏呼吸器或者氧電極測(cè)定氧氣的消耗[20]，或者測(cè)定底物氨基酸的消耗量來進(jìn)行酶活性測(cè)定[21]，但這些測(cè)量方式各有自己的優(yōu)勢(shì)和弊端。本研究使用氯化鐵檢測(cè)酮酸，氯化鐵可以與α-酮-β-甲基正戊酸生成墨綠色絡(luò)合物，操作簡(jiǎn)便，可以作為初篩中檢測(cè)L-氨基酸脫氨酶的檢測(cè)劑，但是由于生成的絡(luò)合物不穩(wěn)定，無法在絡(luò)合物紫外吸光值和KMV濃度之間獲得較好的線性關(guān)系，所以只能采用HPLC方法對(duì)KMV進(jìn)行定量檢測(cè)。盡管用定向進(jìn)化等突變方法對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行突變十分普遍，但是高效篩選目標(biāo)酶的方法并沒有得到改善。本研究中使用的高通量篩選方法具有概率低、工作強(qiáng)度大、消耗時(shí)間長(zhǎng)的缺點(diǎn)，需要對(duì)每個(gè)克隆子進(jìn)行重復(fù)操作，先后要經(jīng)過96孔板培養(yǎng)、轉(zhuǎn)移部分菌液至另一塊96微孔板以及活性測(cè)定這些過程，面對(duì)突變子數(shù)量龐大的突變庫卻無法針對(duì)耐產(chǎn)物抑制突變子直接進(jìn)行篩選。此外，較低濃度的KMV即可與氯化鐵絡(luò)合反應(yīng)產(chǎn)生顏色較深的墨綠色現(xiàn)象，降低了篩選的靈敏度。建立一個(gè)適合在培養(yǎng)液中快速、靈敏檢測(cè)L-氨基酸脫氨酶的高通量篩選方法仍舊是一項(xiàng)挑戰(zhàn)[22]。

由于L-Ile在室溫下最大溶解度為30 g/L左右，一定量的固體L-Ile在轉(zhuǎn)化反應(yīng)開始前被一次性加入到20 mL轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系中，然后一邊被轉(zhuǎn)化生成KMV一邊溶解。因此在實(shí)際的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化底物過程中，底物抑制作用并不是很明顯，只有在細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間暴露于L-Ile飽和溶液中時(shí)，底物的抑制作用才顯現(xiàn)出來。此外，產(chǎn)物抑制在本研究中表現(xiàn)得較為明顯，高濃度的KMV會(huì)抑制底物進(jìn)一步被轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。由于L-氨基酸脫氨酶的活性在實(shí)際轉(zhuǎn)化反應(yīng)過程中同時(shí)受產(chǎn)物抑制和底物抑制、環(huán)境pH值的變化和酶的熱穩(wěn)定性的影響，全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)速率不能作為唯一的檢測(cè)指標(biāo)來進(jìn)行突變子篩選，所以本研究通過逐步增加底物濃度，對(duì)不同突變株全細(xì)胞轉(zhuǎn)化底物的最高KMV產(chǎn)量進(jìn)行對(duì)比，來篩選出綜合性能提高的突變株。

雖然可以通過隨機(jī)突變的方式對(duì)L-氨基酸脫氨酶進(jìn)行分子改造，但該方法具有一定盲目性。來源于蛇毒（Calloselasma rhodostoma）和不透明紅球菌（Rhodococcus opacus）中的氨基酸氧化酶的晶體結(jié)構(gòu)均被報(bào)道[23-24]，并且這些酶的催化活性以及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)均被詳細(xì)地研究。但是L-氨基酸脫氨酶的氨基酸序列與它們的同源性不高，與其他有晶體結(jié)構(gòu)報(bào)道的蛋白的氨基酸序列相似性也較低，無法開展可靠性較高的蛋白結(jié)構(gòu)同源模擬。

易錯(cuò)PCR具有操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，其應(yīng)用也比較廣泛。本研究利用易錯(cuò)PCR定向進(jìn)化來自于Proteus mirabilis的L-氨基酸脫氨酶，獲得了全細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-Ile生成KMV產(chǎn)量略有提高的突變株7/23-6，與突變株5/13-26相比，其目標(biāo)基因的氨基酸序列僅多了一個(gè)突變位點(diǎn)A209E，而突變株7/23-6在熱穩(wěn)定性上表現(xiàn)出一定程度的提高，所以后期將會(huì)對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行飽和突變來分析該位點(diǎn)對(duì)酶活性的影響。同時(shí)，也可以在此基礎(chǔ)上針對(duì)該突變株的其他氨基酸突變位點(diǎn)進(jìn)行分析來提高L-氨基酸脫氨酶轉(zhuǎn)化L-Ile的效率。