富含蘆丁的苦蕎啤酒的糖化工藝優(yōu)化

卞小穩(wěn) ， 孫軍勇 ， 陸 健 *，4

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122；2.糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江南大學(xué)，江蘇 無錫214122；3.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122；4.宿遷市江南大學(xué)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，江蘇 宿遷223800）

我國是啤酒產(chǎn)銷大國，但是啤酒市場同質(zhì)化問題嚴重，急需開發(fā)具有典型特征的新型啤酒。蕎麥，作為一種營養(yǎng)豐富的粗糧作物，富含各種蛋白質(zhì)、脂肪酸、維生素、礦物質(zhì)、碳水化合物等營養(yǎng)成分。因此，它也有著“五谷之王”的美譽[1]，有廣闊的開發(fā)前景，作為釀酒原料也越來越受歡迎[2-3]。

苦蕎中富含獨特的生物活性成分——黃酮類化合物[4]，其中70%～90%為蘆丁[5]，蘆丁具有多種生理功能，如降血糖、防治糖尿病；降血脂，預(yù)防心血管疾??；清除自由基，抗氧化等[6-7]。但苦蕎中含有高活性、高耐受性的蘆丁降解酶，最適作用pH值為5.0，最適作用溫度為50℃[8]，濕熱條件下容易失活[9]，該酶能夠?qū)Ｒ恍缘亟到馓J丁[10]。張燕莉[2]研究發(fā)現(xiàn)，麥汁制備過程中蘆丁含量大幅減少，以致成品啤酒中蘆丁含量甚微，添加50%苦蕎麥芽釀造的混合啤酒以及100%苦蕎麥芽釀造的全蕎麥啤酒中蘆丁質(zhì)量濃度為0.02 mg/L。本文通過預(yù)實驗，研究發(fā)現(xiàn)采用優(yōu)化前的工藝，以30%的苦蕎添加量制備的苦蕎麥汁中蘆丁含量僅為15 mg/L，釀造的苦蕎啤酒中蘆丁質(zhì)量濃度僅為0.2 mg/L，與張燕莉的研究結(jié)論一致。由預(yù)實驗研究發(fā)現(xiàn)，糖化階段是造成蘆丁大量損失的過程。因此，本文以苦蕎為研究對象，采用反相高效液相色譜法（HPLC）定量檢測蘆丁質(zhì)量濃度，重點研究糖化工藝對蘆丁降解酶的影響，優(yōu)化糖化工藝，提高麥汁中蘆丁的質(zhì)量濃度，同時，確保采用高添加量的苦蕎制備的麥汁能夠正常發(fā)酵，最終釀造出富含蘆丁的苦蕎啤酒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

澳麥麥芽由中糧麥芽（江陰）有限公司提供；苦蕎（tartary buckwheat） 2014 年收獲于甘肅；蘆丁、槲皮素標準品（純度≥98%）購自艾科公司；耐高溫α-淀粉酶購自廣州裕立寶公司。

麥芽標準粉碎機，北京德之杰啤酒技術(shù)有限責(zé)任公司；自動糖化儀，輕工部西安輕機所光電公司；WGZ-2-PJ型濁度計，上海昕瑞儀器儀表有限公司；KjeItec2300凱氏定氮儀，瑞典FOSS分析儀器有限公司；KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山課桌超聲儀器有限公司 （舒美牌）；Thermo Hypersil ODS C18 色譜柱（250 mm×4.0 mm，5 μm），上海安譜實驗科技股份有限公司；日立高效液相色譜儀，日立公司；Haake落球式黏度計，Thermo公司；UV-2100型紫外可見分光光度計，尤尼柯儀器有限公司；H1850R臺式高速冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 蘆丁檢測方法 蘆丁檢測方法參考文獻[11]。

1.2.2 蘆丁含量的測定 準確稱取100 mg蘆丁標準品，用甲醇定容至10 mL作為母液，然后分別配制成 25、50、100、200、400、800 mg/L 的標準溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，4℃避光保存，待測。

苦蕎預(yù)處理：使用麥芽標準粉碎機，將苦蕎原料細粉，準確稱取2 g苦蕎粉，置具塞錐形瓶中，加入50 mL體積分數(shù)為65%的乙醇溶液，72℃浸提4 h，取上清，用0.45 μm微孔濾膜過濾，室溫避光放置，待測。

麥汁預(yù)處理：取1 mL麥汁加入4 mL甲醇，充分混勻，10 000 r/min離心10 min，取上清，采用0.45 μm微孔濾膜過濾，室溫避光放置，待測。

麥糟預(yù)處理：麥糟于50℃下烘至恒重，準確稱取1.00 g干麥糟，加入10 mL甲醇，72℃浸提4 h，取上清，采用0.45 μm微孔濾膜過濾，室溫避光放置，待測。

1.2.3 蘆丁降解酶熱穩(wěn)定性 粗酶液的制備參照文獻[12]。

蘆丁的酶解：參照徐寶才等人[13]的方法，并略作修改。準確稱取100 mg蘆丁，溶于20 mL甲醇，混勻溶解，用水稀釋5倍后作為底物使用。移取1 mL經(jīng)適當(dāng)稀釋的粗酶液于 50、60、70、80、90、95 ℃保溫1 h，分別加入4 mL底物液于50℃酶解3 min，加20 mL甲醇終止反應(yīng)，采用0.45 μm微孔濾膜過濾，HPLC測定蘆丁含量，將1 min內(nèi)降解1 μmol蘆丁所需要的蘆丁降解酶的酶量定義為一個酶活力單位（U），計算蘆丁降解酶酶活，并根據(jù)式（1）測定蘆丁保留率。

式中，R為蘆丁保留率；m1為蘆丁保留量；m2為蘆丁總量。

1.2.4 糖化工藝的優(yōu)化 （1）糖化過程中蘆丁降解酶滅酶工藝。優(yōu)化前糖化工藝曲線如圖1所示。

圖1 優(yōu)化前糖化工藝曲線Fig.1 Profiles of mashing process before optimization

糖化過程中蘆丁降解酶的滅酶工藝：將苦蕎與大麥麥芽分開投料，以蘆丁保留率為考察對象，選取滅酶溫度和滅酶時間為單因素實驗。首先，苦蕎分別于45、70、80、90℃在糊化鍋投料，并加入8 U/g的耐高溫α-淀粉酶，保溫1 h，而后與糖化醪并醪，進行后續(xù)的糖化程序；蕎麥于80、90℃投料，分別保溫 10、20、30、40、50、60 min，而后與糖化醪并醪，進行后續(xù)的糖化程序。分別測定麥汁和麥糟中的蘆丁含量，計算蘆丁保留率。

（2）常規(guī)糖化參數(shù)的確定。以蘆丁及α-氨基氮濃度為考察對象，選取常規(guī)糖化參數(shù)苦蕎料水比、苦蕎添加量和中性蛋白酶的添加量為單因素設(shè)計實驗。 首先，分別選取料水比為 1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8，固定苦蕎作為輔料的添加量為 30%，糊化鍋加入8 U/g的耐高溫α-淀粉酶，大麥麥芽料水比為 1∶4； 選取苦蕎添加量為 10%、20%、30%、40%、50%、60%，控制苦蕎料水比和大麥麥芽料水比均為1∶4，糊化鍋加入8 U/g的耐高溫α-淀粉酶；確定苦蕎料水比及添加量之后，選取糖化鍋中性蛋白酶的添加量為0、0.01%、0.02%、0.03%，研究中性蛋白酶的添加量對α-氨基氮含量的影響。

（3）常規(guī)麥汁理化指標。采用優(yōu)化后的糖化工藝制備苦蕎麥汁，以全大麥麥芽制備的麥汁為對照樣組，分析麥汁的常規(guī)指標：麥汁濃度、濁度、色度、pH、黏度、α-氨基氮、總酸、總可溶性氮、高分子氮、中分子氮、低分子氮按照文獻[14]的方法進行檢測、總黃酮按照文獻[11]的方法進行檢測。

1.2.5 發(fā)酵 發(fā)酵實驗參照文獻[15]，釀造10°P啤酒，以全大麥芽麥汁釀造的啤酒為對照組，測定啤酒中的蘆丁和總黃酮含量。

2 結(jié)果與討論

由于苦蕎中存在高活性、高耐受性的蘆丁降解酶，能夠?qū)Ｒ恍缘亟到馓J丁，導(dǎo)致蘆丁含量大幅降低，且在糖化過程中蘆丁降解酶以粗酶液的形式存在。因此，從苦蕎中提取蘆丁降解酶粗酶液并進行酶解實驗，研究其熱穩(wěn)定性。

2.1 蘆丁降解酶熱穩(wěn)定性

按照1.2.3節(jié)的方法，提取蘆丁降解酶并進行酶解實驗，結(jié)果如圖2所示：隨著溫度的升高，蘆丁降解酶的活力降低，使得部分蘆丁未被降解，得以保留下來，蘆丁保留率呈上升趨勢。當(dāng)溫度超過60℃時，蘆丁降解酶快速失活，蘆丁保留率增加，溫度達到70℃時，蘆丁降解酶酶活為2.27 U/mL，蘆丁保留率達到87%，隨后緩慢上升，溫度達到80℃以上時，蘆丁保留率為100%，達到穩(wěn)定，此時蘆丁降解酶酶活為0.008 U/mL，被完全滅活。王改玲等人[10]研究表明，溫度大于60℃時，蘆丁降解酶開始失活，蘆丁得以較好保存，高于70℃時蘆丁保留率更高，該結(jié)論與本文的研究結(jié)果基本一致。

圖2 滅酶溫度對蘆丁降解酶酶活及蘆丁保留率的影響Fig.2 Effect of temperature on the activity of rutin hydrolase and the ratio of residual rutin

2.2 糖化工藝優(yōu)化

2.2.1 糖化過程中蘆丁降解酶滅酶工藝 按照優(yōu)化前糖化工藝制備苦蕎麥汁，麥汁中蘆丁質(zhì)量濃度僅為15 mg/L。這是由于苦蕎與大麥麥芽于45℃共同投料，糖化用水pH為5.2，該工藝條件接近蘆丁降解酶的最適pH值5.0，最適溫度50℃[8]，導(dǎo)致蘆丁大幅減少。故將蘆丁降解酶的滅酶工藝與糖化工藝結(jié)合起來，將苦蕎與大麥麥芽分開投料，苦蕎在高溫下投料，邊糊化邊滅酶?；谇捌谔J丁降解酶的熱穩(wěn)定性的研究，研究苦蕎的投料溫度以及保溫時間，確定蘆丁降解酶滅酶工藝。由圖3可以看出，投料溫度為80℃及以上時，蘆丁保留率接近100%，說明溫度高于80℃，保溫1 h，即可完全滅酶，與前期研究蘆丁降解酶的熱穩(wěn)定性的結(jié)論一致。

圖3 苦蕎投料溫度對蘆丁保留率的影響Fig.3 Effect of mashing-in temperature of tartary buckwheat on the ratio of residual rutin

在確定80、90℃投料保溫1 h即可將苦蕎內(nèi)的蘆丁降解酶完全滅活后，進一步分別研究80、90℃時，將蘆丁降解酶完全滅活的最短時間。圖4為80℃投料，保溫時間對蘆丁保留率的影響結(jié)果，發(fā)現(xiàn)保溫時間為30 min時，蘆丁保留率接近100%，說明80℃投料，保溫30 min，蘆丁降解酶即可被完全滅活。

圖4 80℃條件下保溫時間對蘆丁保留率的影響Fig.4 Effect of incubation time on the ratio of residual rutin at 80℃

苦蕎于90℃在糊化鍋投料，保溫時間對蘆丁保留率的影響結(jié)果如圖5所示。當(dāng)保溫時間為10 min時，蘆丁保留率即為100%，表明蘆丁降解酶被完全滅活?？紤]到實際生產(chǎn)中的設(shè)備周轉(zhuǎn)問題，綜合考慮采用高溫短時的滅酶方式，最終確定苦蕎于90℃投料，保溫10 min，進行滅酶。糖化過程中蘆丁降解酶的滅酶工藝為：苦蕎與大麥麥芽分開投料，苦蕎于90℃在糊化鍋投料，保溫10 min，加入8 U/g的耐高溫α-淀粉酶，大麥麥芽于45℃在糖化鍋投料，保溫30 min后并醪，進行后續(xù)的糖化程序。

圖5 90℃保溫時間對蘆丁保留率的影響Fig.5 Effect of incubation time on the ratio of residual rutin at 90℃

2.2.2 常規(guī)糖化參數(shù)的確定 確定蘆丁降解酶的滅酶工藝之后，對常規(guī)糖化參數(shù)進行研究。單因素實驗結(jié)果（圖6）顯示當(dāng)料水比為1∶6時，蘆丁質(zhì)量濃度達到峰值608 mg/L，故選取苦蕎料水比為1∶6，此時12°P麥汁苦蕎麥汁中α-氨基氮的質(zhì)量濃度為179 mg/L，基本滿足發(fā)酵需求[16]，為了使數(shù)據(jù)具有可比性，本文蘆丁、α-氨基氮質(zhì)量濃度均歸一化為12°P麥汁濃度時的含量；隨著苦蕎添加量的增加，蘆丁質(zhì)量濃度逐漸增加，α-氨基氮逐漸下降，兼顧蘆丁質(zhì)量濃度以及啤酒發(fā)酵所需氮源的要求，最終確定苦蕎添加量為40%，料水比為1∶6。

圖6 苦蕎料水比及添加量對麥汁中蘆丁及α-氨基氮質(zhì)量濃度的影響Fig.6 Effect of the ratio of tartary buckwheat to water and the added ratio of tartary buckwheat on the contents of rutin and α-amino acid nitrogen in wort

苦蕎在90℃下投料，因不經(jīng)過蛋白質(zhì)休止階段，麥汁中的α-氨基氮質(zhì)量濃度可能會偏低。由圖6可知，采用40%的苦蕎添加量制備的12°P麥汁中α-氨基氮為170 mg/L，略低于180 mg/L。所以，在確定蕎麥料水比及輔料比之后，研究中性蛋白酶的添加量對α-氨基氮含量的影響。由圖7可以看出，當(dāng)中性蛋白酶添加量質(zhì)量分數(shù)為0.01%時，麥汁中α-氨基氮質(zhì)量濃度為183 mg/L，滿足發(fā)酵需求，所以確定中性蛋白酶的添加量為0.01%。

綜上所述，優(yōu)化后的糖化工藝曲線如圖8所示。

圖8 優(yōu)化后的糖化工藝曲線Fig.8 Profiles of mashing process after optimization

2.2.3 麥汁理化指標分析 采用優(yōu)化后的糖化工藝制備苦蕎麥汁，并以全大麥麥芽汁為對照樣品，對常規(guī)理化指標的分析結(jié)果如表1所示。加入40%的苦蕎使得麥汁濃度、濁度、總酸及α-氨基氮降低，黏度增加，pH幾乎相同。與對照組相比，由于苦蕎是在90℃下投料，不經(jīng)過蛋白質(zhì)休止階段，苦蕎麥汁中的總可溶性氮質(zhì)量濃度大幅降低，不同分子量的可溶性氮的比例有所變化，中分子可溶性氮大幅減少，高分子、低分子可溶性氮增加。但是與對照組相比，添加苦蕎的12°P麥汁中蘆丁質(zhì)量濃度大幅提高，從0 mg/L增加到611 mg/L，總黃酮的質(zhì)量濃度變化較大，從16 mg/L增加到650 mg/L，增加30倍。與優(yōu)化前的糖化工藝制備的苦蕎麥汁相比，蘆丁的質(zhì)量濃度從15 mg/L增加到611 mg/L，增加約41倍。

表1 麥汁理化指標分析表Table 1 Physical and chemical indexes of wort

2.3 啤酒中蘆丁和總黃酮的檢測

檢測實驗室條件下釀造的2種啤酒中蘆丁和總黃酮的質(zhì)量濃度（見圖9）。由圖9可知，添加40%苦蕎釀造的10°P苦蕎啤酒中，蘆丁和總黃酮的質(zhì)量濃度均大幅提高。隨著后酵降溫，啤酒發(fā)酵液中逐漸有蘆丁結(jié)晶析出，最終使得苦蕎麥汁中約40%的蘆丁隨著發(fā)酵進入苦蕎啤酒中，10°P苦蕎啤酒中蘆丁總量達220 mg/L，約為對照組的52倍；總黃酮的質(zhì)量濃度為363 mg/L，約為對照組的10倍。與優(yōu)化前的工藝釀造的苦蕎啤酒相比，蘆丁的質(zhì)量濃度從0.2 mg/L增加到220 mg/L。研究表明，蘆丁的分子結(jié)構(gòu)，決定了其具有清除自由基，抗氧化的功效[17]，據(jù)報道具有明顯藥理作用的蘆丁攝入量為180～350 mg/d[18]。因此，富含蘆丁的苦蕎啤酒是一種較好的攝入蘆丁的飲品。

圖9 啤酒中蘆丁和總黃酮的含量Fig.9 Contents of rutin and flavonoids in beers

3 結(jié) 語

苦蕎中含有的高活性的蘆丁降解酶在糖化過程中能夠?qū)Ｒ恍缘亟到馓J丁，導(dǎo)致麥汁中蘆丁含量降低。采用HPLC對苦蕎麥汁中的蘆丁進行定量檢測，研究蘆丁降解酶的熱穩(wěn)定性，最終確定糖化過程中蘆丁降解酶的滅酶工藝，苦蕎的投料方式由45℃共同投料調(diào)整為90℃在糊化鍋進行投料，在糊化的同時，將蘆丁降解酶完全滅活。確定釀造苦蕎啤酒的最優(yōu)糖化工藝：糊化鍋苦蕎投料溫度90℃，苦蕎添加量40%，料水比1∶6，耐高溫α-淀粉酶添加量8 U/g，保溫10 min；糖化鍋大麥麥芽投料溫度45℃，料水比1∶4，中性蛋白酶添加量 0.01%，保溫30 min后，并醪，進行后續(xù)糖化程序。通過對苦蕎啤酒生產(chǎn)工藝的優(yōu)化，使得12°P麥汁中蘆丁的質(zhì)量濃度從15 mg/L增加到611 mg/L，增加約41倍，其他麥汁常規(guī)理化指標與大麥麥芽麥汁差異不大，且實驗室釀造的10°P苦蕎啤酒中蘆丁質(zhì)量濃度由0.2 mg/L上升到220 mg/L?？嗍w啤酒中的蘆丁及總黃酮的質(zhì)量濃度大幅提高，能夠提高苦蕎啤酒的抗氧化性，下一步需要對這方面進行深入分析。