黃皮葉總黃酮的提取及鑒別

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(1.右江民族醫(yī)學院 臨床醫(yī)學院，廣西 百色533000；2. 右江民族醫(yī)學院 藥學院，百色533000；3.右江民族醫(yī)學院 廣西高校右江流域特色民族藥研究重點實驗室，廣西 百色533000)

黃皮葉，別名油皮、油梅，來源于蕓香科黃皮屬植物黃皮[Clausenalansium(Lour.) Skeels]。黃皮是中國南方果品之一，盛產(chǎn)于廣西、廣東、云南、海南、福建、臺灣等地[1]，在中國已有一千五百多年的歷史，含豐富的果膠、維生素C、糖、有機酸及黃酮等成分[2]，以根、葉、果及種子入藥[2-3]。黃皮葉味屬苦、辛、平，有“解穢除垢，退黃腫”之功效，可用于治療咳嗽哮喘、氣脹腹痛、瘧疾、溫病身熱、黃腫、熱毒疥癩、小便不利等疾病，民間常用其煮水治療感冒、胃痛、疝氣、急性黃疸型肝炎、高血脂、牛臌脹、豬哮喘等病癥[2-6]。黃皮葉中含有多種化合物，包括揮發(fā)油、香豆素、卡巴唑、黃皮酰胺及萜類等，其中，黃皮酰胺生物堿類物質(zhì)能對抗衰老、提高記憶力、延緩老年癡呆，還具有解毒功能[2]。

目前針對黃皮葉的化學成分研究仍比較少，且較多集中在揮發(fā)油，其藥理活性研究方面的文獻報道也不多，生物活性作用物質(zhì)基礎不明確，導致其在臨床上的應用受到限制。國內(nèi)外對黃皮葉只是進行了一些基礎的研究，對于其藥理成分以及單一結(jié)構(gòu)的藥效分析文獻報道較少，缺乏黃皮葉總黃酮提取工藝及鑒別的研究，限制了黃皮葉的進一步開發(fā)利用尤其總黃酮提取的工業(yè)化生產(chǎn)等問題，因此需要進一步探討黃皮葉總黃酮的提取及鑒別，為新藥的開發(fā)提供理論依據(jù)。黃皮葉作為中國南方的地道藥材和優(yōu)勢資源，具有巨大的醫(yī)藥應用開發(fā)價值，本實驗旨在探究黃皮葉總黃酮的提取及鑒別方法，為進一步開發(fā)和利用黃皮葉植物資源提供基礎的科學依據(jù)，從而減少資源浪費。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮黃皮葉。 95%乙醇、亞硝酸鈉AR、硝酸鋁AR、氫氧化鈉AR、正丁醇AR、氨水AR、氯化鋁AR、乙酸鎂AR、甲醇AR、鎂粉AR、鹽酸AR、冰醋酸AR、蘆丁標準品(中國食品藥品測定研究院)。DHG-9070A電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司、太倉精宏儀器設備有限公司)，TGL-15B高速離心器(上海安亭科學儀器廠)，N4S紫外可見分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司)，ZF-2暗箱式紫外分析儀(北京凱蒂萊特儀器設備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

黃皮葉總黃酮提取工藝流程見圖1。

圖1 黃皮葉總黃酮提取工藝流程

1.2.2 操作步驟

新鮮黃皮葉，曬干，切碎，取250 g置于T鍋中，加蒸餾水煮沸3 h。冷卻后進行粗濾，用上述方法對濾渣進行再次浸取，將兩次濾液合并，離心(5 min，13 000 r·min-1)。然后進行蒸發(fā)濃縮(溫度為85 ℃)。濃縮冷卻后加入等體積95%乙醇，放入冰箱內(nèi)2 h。再次離心(5 min，13 000 r·min-1)。過濾得濾液，棄去濾渣。對濾液進行蒸發(fā)濃縮(溫度為85 ℃)。待乙醇蒸發(fā)完，將濃液置于電熱恒溫鼓風干燥箱中干燥成糖漿狀，得到終成品。

1.3 定量實驗─總黃酮的含量測定

1.3.1 標準曲線的制備

標準溶液的制備：精密稱取蘆丁對照品20 mg，置于50 mL容量瓶中，加入95%乙醇溶液并稀釋至刻度，搖勻。精密量取25 mL置于50 ml容量瓶中，加入95%乙醇稀釋至刻度，搖勻即得(每1 mL含有無水蘆丁0.2 mg)。

標準曲線的制備：精密吸取對照溶液0.0，2.0，4.0，6.0，8.0，12.0 mL置于50 mL容量瓶中，各加95%乙醇12 mL，加5%亞硝酸鈉溶液2.0 mL，混勻，放置6 min，再加10%硝酸鋁溶液2.0 mL，混勻，放置6 min，加5%氫氧化鈉溶液20 mL，最后用95%乙醇稀釋至刻度，搖勻。以第1瓶為空白溶液，用N4S紫外可見分光光度計，在500 nm上測定吸光度。結(jié)果見表1。

表1 分光光度法測定吸光度結(jié)果

根據(jù)上表得一個回歸方程：A=10.238 2C-0.021 3，r=0.999，n=5，其中截距-0.021 3,斜率10.238 2。

1.3.2 提取物含量的測定

精密稱定提取物5.000 0 g，置于圓底燒瓶中，加95%乙醇回流萃取3 h，將提取液置于燒杯中，水浴加熱濃縮至干，再用熱水洗滌3次，將洗液移至分液漏斗中，并加入正丁醇液萃取3到5次，10 mL/次，合并萃取液于燒杯中，水浴蒸干，再加95%乙醇使其溶解，并移于50 mL容量瓶中，再加95%乙醇至刻度，搖勻，按標準曲線的制備操作測定吸光度，A=0.371。

1.3.3 顏色反應

紫外光下呈色反應：取該樣品溶液滴在濾紙上，在可見光下呈淡黃色，在紫外光下呈淡藍色并有熒光斑點。

濃氨水反應：取該樣品溶液滴在濾紙上，將濾紙在氨水上方熏0.5 min，立即在紫外光下觀察，呈黃褐色熒光斑點。

三氯化鋁反應：取樣品溶液滴在濾紙上，滴加1%氯化鋁乙醇溶液，晾干，在可見光下呈灰黃色，在紫外光下呈黃色熒光斑點。

乙酸鎂反應：取樣品溶液滴在濾紙上，滴加1%乙酸鎂甲醇溶液，晾干，在紫外光下呈黃色斑點。

鹽酸-鎂粉反應：取乙醇提取液1 mL于試管中加鎂粉，再連續(xù)加入數(shù)滴濃鹽酸，在泡沫處呈紫紅色。

1.3.4 紙層析取

用毛細吸管吸取樣品溶液在層析紙上畫一條細線，用體積比正丁醇∶醋酸∶水=4∶1∶5為展開劑，上行展開1 h，取出晾干。噴1%氯化鋁乙醇溶液。晾干后在紫外光下呈熒光斑點。

2 結(jié) 果

A=0.371，根據(jù)回歸方程：A=10.238 2C-0.0213，計算樣品中總黃酮的含量C=3.83%?；厥諏嶒灒壕芊Q提取物5.000 0 g，加入對照蘆丁對照品40 mg，同前樣品測定方法操作測定吸光度，求出回收率為89.98%。

3 結(jié) 論

黃酮類化合物(flavonoids compounds)，別名類黃酮，是一類存在于自然界中，由植物光合作用產(chǎn)生的、具有2-苯基色原酮(flavone)結(jié)構(gòu)的化合物。它的藥用價值很高，不僅可以促進植物生長發(fā)育，而且還具有鎮(zhèn)痛、抗菌、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗癌、抗心腦血管疾病、抗輻射、抗氧化自由基、抗衰老、保肝以及免疫調(diào)節(jié)等方面的藥理活性，可用于治療骨質(zhì)疏松癥和糖尿病[7-9]。迄今為止，被鑒定出來的黃酮類化合物已有8 000多種[10]。目前，黃酮類化合物常作為風味劑、天然抗氧化劑、飼料添加劑、生長調(diào)節(jié)劑廣泛地運用于食品工業(yè)和畜牧業(yè)，在醫(yī)藥工業(yè)中則被用來開發(fā)抗病毒、抗腫瘤、抗紫外劑以及治療心腦血管疾病等功能性藥物[11]。

1956年英國學者Denham Harman提出自由基學說，揭示自由基參與多種疾病的病理過程，細胞正常代謝產(chǎn)生的自由基攻擊生命大分子，造成組織損傷和機體退行性變，加速細胞衰老，誘發(fā)腫瘤等惡性疾病[12]。而黃酮類化合物是自然界中抗氧化作用最強的一類天然化合物，由于它具有很強的抑制活性氧、清除自由基作用，同時毒副作用相對小于化學合成藥，因此黃酮類化合物一直是人們致力于尋找新藥的重要研究領域。

針對黃皮葉中黃酮類成分的研究還不夠深入，缺乏對黃皮葉總黃酮的提取及鑒別這一問題，本實驗采用純物理的工藝流程提取黃皮葉總黃酮，為進一步研究黃皮葉總黃酮的工業(yè)化生產(chǎn)以及黃皮葉的質(zhì)量控制和藥理作用研究及其深入開發(fā)奠定基礎。此外，本實驗方法操作簡單，回收率以及純度較高，采用全物理過程,無任何化學變化及污染,且該方法操作簡單方便,是一條理想的提取黃酮類物質(zhì)的途徑。