植物精油對(duì)植物病原菌的抑菌活性研究進(jìn)展

，，, ，， ，*

(1.南京師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京210023；2.南京野生植物綜合利用研究院，江蘇 南京211111)

植物精油(essential oils)是存在于植物不同組織如果實(shí)、葉片、花和根中的一類重要的次生物質(zhì)，由分子量較小的簡(jiǎn)單化合物組成，常溫下多為油狀液體，易揮發(fā)，具有強(qiáng)烈的香味和氣味[1]。植物精油具有生物活性，不僅廣泛用于醫(yī)藥、食品、化工等方面，而且在植物源農(nóng)藥領(lǐng)域得到廣泛研究[2-4]。近年來(lái)化學(xué)農(nóng)藥的廣泛使用使得環(huán)境保護(hù)和抗藥性問(wèn)題日益嚴(yán)重，發(fā)展植物源農(nóng)藥是新農(nóng)藥開(kāi)發(fā)的一條重要途徑。與傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥相比，植物源農(nóng)藥由于其有效成分是天然產(chǎn)物，使用后較容易分解為無(wú)毒物質(zhì)，對(duì)環(huán)境無(wú)污染[5]。本文從植物精油抑菌活性及活性成分、植物精油抑菌作用機(jī)理等方面進(jìn)行了綜述，以期對(duì)植物精油在農(nóng)用抑菌活性方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 植物精油的概述

精油在植物界分布很廣。在我國(guó)，野生與栽培的芳香植物就有56科，136屬，約300 種。尤其是在菊科、蕓香科、桃金娘科、傘形科、唇形科、禾本科、姜科、樟科、木蘭科、馬兜鈴科、馬鞭草科等科的多種植物中含有豐富的精油[6]。

當(dāng)植物進(jìn)行光合作用時(shí)，細(xì)胞分泌出芬香的分子會(huì)聚集成香囊散落于花瓣、葉子、果實(shí)或樹(shù)干等部位上，將其蒸餾、萃取后即為植物精油，又稱揮發(fā)油、芳香油和香精油，具有一定的芳香氣味。植物精袖在植物體內(nèi)的相對(duì)含量較少，一般均在1%以下。精油在植物體內(nèi)的分布隨種類不同而有所差異，有的全株都有，有的在花、果、葉、根等器官中含量較多，甚至有些植物采集時(shí)間不同，同一部位的精油成分也不完全一樣[7]。一般植物精油具有以下理化性質(zhì)：常溫下多為液體、少數(shù)在常溫下可析出固體成分，易揮發(fā)、有特殊而強(qiáng)烈的氣味；一般比水輕，比重在0.85～1.065 g/mL之間，易溶于石油醚等極性小的有機(jī)溶劑中，也能溶于高濃度乙醇中；對(duì)空氣、日光及溫度較敏感，易分解變質(zhì)，大多具有較高的折光率和一定的旋光度[8-9]。

大多數(shù)植物精油是由一百多種以上的成分所構(gòu)成，當(dāng)然有些更高達(dá)數(shù)百種至上千種成分，一般而言，植物精油主要含有醇類、醛類、酸類、酚類、丙酮類、單萜、倍半萜及某些芳香族化合物類[10]。按其化學(xué)成分和含量的多少可將植物精油分為四大類。第一類是萜烯類衍生物，是精油的主要成分，其中包括單萜衍生物，如熏衣草類、月桂烯、茴香醇類；倍半萜衍生物，如金合歡烯、廣藿香酮等，二萜衍生物，如油杉醇等；第二類是芳香族化合物，在精油中僅次于萜烯類化合物，其中包括萜源衍生物，如百里草等，另一類是苯丙烷類衍生物，如玫瑰油中的苯乙醇等；第三類是脂肪族化合物，如橘子、香茅等精油中的異戊醛；第四類是含氮、含硫類化合物，如大蒜素、洋蔥中的三硫化物，黑芥子中的異硫氰酸酯等[11-12]。精油的提取方法有很多，隨著精油的需求量逐年增加，植物精油提取分離技術(shù)從單一到多元，從耗時(shí)長(zhǎng)、得率低到快速、高產(chǎn)，使得植物精油越來(lái)越易被人們所利用。目前，植物精油提取分離技術(shù)分為兩大類：傳統(tǒng)和現(xiàn)代的提取分離技術(shù)。傳統(tǒng)的提取方法有蒸餾法、溶劑提取法、壓榨法、吸收法?，F(xiàn)代的提取方法主要有二氧化碳超臨界萃取技術(shù)、亞臨界水提取技術(shù)、分子蒸餾技術(shù)等。此外，還有一些輔助提取方法，如微波輔助水蒸氣蒸餾法、超聲波輔助萃取法以及生物酶制劑輔助提取法[13-15]。由此可見(jiàn)，植物精油成分復(fù)雜，采用常規(guī)柱層析、分餾等方法很難全面得到其成分組成情況。隨著儀器在成分分析中的應(yīng)用，植物精油的成分分析目前主要借助氣相色譜-質(zhì)譜-數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)聯(lián)用(GC/MS/DS)技術(shù)進(jìn)行研究。

2 植物精油的抑菌活性研究

芳香植物很早就在民間藥方及食品防腐中使用，并在實(shí)踐中逐漸發(fā)現(xiàn)植物精油中含有抗菌活性化合物。近年來(lái)，植物精油對(duì)植物病原菌的抑菌活性得到了廣泛的研究[16-19]。至今，已有桃金娘科、姜科、禾本科、菊科、唇形科、傘形科、馬兜鈴科、牻牛兒苗科、蕓香科、樟科、木蘭科、十字花科、胡椒科、連香樹(shù)科、松科十五個(gè)科三十余種植物精油的農(nóng)用殺菌活性得到了研究(見(jiàn)表1)。由表1可以看出，精油具有農(nóng)用殺菌活性的植物主要分布于唇形科、樟科和菊科，同科植物根據(jù)物種不同，精油的主要抑菌成分也有所不同。不同植物精油均可以通過(guò)水蒸氣蒸餾法獲得。同種植物精油由不同方法提取得到的精油化學(xué)成分也有變化。如使用超臨界CO2萃取法萃取九里香精油與水蒸氣蒸餾法提取的九里香揮發(fā)油的化學(xué)成分存在一定的差異[20-21]。通過(guò)九里香精油的GC-MS分析，超臨界CO2萃取法萃取九里香精油，首次發(fā)現(xiàn)了N-苯基-3-丁烯酰胺、1-(1,5-二甲基-4-己烯基)-4-甲苯、N -(1-甲基-3-氧-亞丁基)-4-甲氧基苯胺、5-氮雜苯并咪唑、紫堇酮等化學(xué)成分，其中1-(1,5-二甲基-4-己烯基)-4-甲苯、N -(1-甲基-3-氧-亞丁基)-4-甲氧基苯胺的含量較高，據(jù)推測(cè)為九里香精油抑菌活性的主要成分。針對(duì)此種情況，可以根據(jù)活性測(cè)定及成分分析等相關(guān)結(jié)果選取合適的提取方法進(jìn)行植物精油殺菌活性研究。另外，精油中一些主要化學(xué)成分的農(nóng)用抑菌活性也得到了相應(yīng)的研究。這些活性成分包括醇、醛、酮以及酚類化合物?；钚曰衔镏饕獮槿?、酚和酮類化合物。如肉桂精油主要抑菌成分是肉桂醛，丁香酚是丁香精油的主要活性成分，百里香精油主要抑菌成分為百里香酚，黃蒿酮為黃蒿精油的主要抑菌成分等，它們均具有廣譜的抑菌效果。

活性測(cè)定表明精油具有較好的殺菌活性和廣泛的殺菌譜。大部分精油的EC50為0.1～1 mg/mL。部分精油在盆栽測(cè)定中也表現(xiàn)較強(qiáng)的殺菌活性。如孜然精油主成分之一枯茗醛，其在1mg/mL濃度下對(duì)小麥白粉病的保護(hù)防效與對(duì)照藥劑三唑酮(150 mg/L)相當(dāng)，達(dá)到51.98%[22]。樟油和肉桂油對(duì)番茄灰霉病具有較好的保護(hù)效果，在2 000 mg/L 時(shí)，對(duì)番茄灰霉病的防效分別為59.65%和61.40%[23]。此外，精油還具有一定的殺菌廣譜性。如在供試濃度下，勝紅薊精油對(duì)10種病原菌[24]，山蒼子精油對(duì)8種病原菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌效果[25]。

除了對(duì)單種植物精油的殺菌活性進(jìn)行研究外，人們還對(duì)多種植物精油復(fù)配物的殺菌活性進(jìn)行了研究。劉歡等[26]研究了肉桂醛與檸檬醛、肉桂醛與丁香酚以及檸檬醛與丁香酚3種復(fù)配植物精油對(duì)葡萄灰霉菌的協(xié)同抑菌效果。研究發(fā)現(xiàn)3種復(fù)配植物精油處理對(duì)采后葡萄灰霉菌的抑制活性顯著(p<0.05)，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到第8天時(shí)，對(duì)照組平板全部長(zhǎng)滿葡萄灰霉菌絲，而處理組平板在菌碟周圍2～15 mm 以內(nèi)有葡萄灰霉菌絲生長(zhǎng)。以500 μL/L肉桂醛/檸檬醛協(xié)同抑制效果最明顯，肉桂醛/檸檬醛的EC50值為67.46～101.31μL/L，抑菌效果最穩(wěn)定，抑菌率達(dá)93.75%。許倩等[19]研究了以肉桂精油與紫蘇精油的復(fù)配物對(duì)冬棗中常見(jiàn)致病菌青霉(Penicilliumsp.)和黑曲霉(Aspergillusniger)的抑菌效果，在濃度為0.42 μL/mL，復(fù)配比為3∶1時(shí)，對(duì)青霉和黑曲霉的抑菌效果最好，最大抑菌圈直徑可高達(dá)24 mm 和22.7 mm。由此可見(jiàn)，對(duì)植物精油進(jìn)行復(fù)配可能開(kāi)發(fā)出對(duì)植物病害具有良好防治效果的殺菌劑。

表1 植物精油的農(nóng)用抑菌活性資源

續(xù)表1

3 植物精油抑菌作用機(jī)制

植物精油及其主要成分對(duì)微生物的影響方式主要有兩種。一是改變微生物細(xì)胞和菌絲體的形態(tài)結(jié)構(gòu)和組成，如細(xì)胞膜、細(xì)胞壁和細(xì)胞器等結(jié)構(gòu)，造成細(xì)胞不可逆的損傷，誘發(fā)菌絲體溶解，最終導(dǎo)致微生物死亡；二是降低或抑制分生孢子的產(chǎn)生和萌發(fā)，降低或阻斷病菌后代繼續(xù)危害的可能[27-28]。

3.1 對(duì)微生物細(xì)胞壁的作用

微生物細(xì)胞壁的屏障作用可以降低微生物對(duì)抑菌劑的敏感性，細(xì)胞壁的主要成分和與細(xì)胞壁有關(guān)的酶成為精油分子的重要作用點(diǎn)。精油中的α-松油烯能控制釀酒酵母細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和功能等基因，從而發(fā)揮它的抑菌作用[29]。肉桂醛可透過(guò)真菌的細(xì)胞壁，特異性地阻止細(xì)胞壁中葡聚糖和幾丁質(zhì)的合成，細(xì)胞壁受損，最終細(xì)胞因缺少保護(hù)性組織而衰亡[30]。遼細(xì)辛精油[28]對(duì)灰葡萄孢菌細(xì)胞壁降解酶(胞內(nèi)果膠甲基反式消除酶(pectin methyltranseliminase，PMTE酶)、果膠總酶、胞外羧甲基纖維素酶)活性的影響，結(jié)果表明Cx酶可能是遼細(xì)辛精油的作用位點(diǎn)之一，對(duì)Cx酶的抑制作用可能是遼細(xì)辛精油對(duì)灰葡萄孢菌的抑菌機(jī)制之一。丁香羅勒精油可以使白假絲酵母菌的細(xì)胞壁增厚、分離，干擾細(xì)胞壁的完整性進(jìn)而降低白假絲酵母菌的出芽率[31]。

3.2 對(duì)微生物細(xì)胞膜的作用

細(xì)胞膜在維持微生物的正常生命活動(dòng)中具有非常重要的地位。精油能夠直接作用于微生物細(xì)胞膜，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、增加細(xì)胞膜的通透性，使細(xì)胞內(nèi)部的重要離子和內(nèi)溶物會(huì)滲出，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[32-33]。丁香酚可通過(guò)使細(xì)胞膜中的蛋白質(zhì)變性，與細(xì)胞膜中的磷脂反應(yīng)破壞細(xì)胞膜的透性，從而抑制微生物的生長(zhǎng)[34]。劉海燕等[35]采用電導(dǎo)法，測(cè)定細(xì)辛揮發(fā)油對(duì)Alternariahumicola細(xì)胞膜通透性的影響，表明細(xì)辛揮發(fā)油可以破壞供試菌株細(xì)胞膜的選擇通透性，導(dǎo)致內(nèi)容物的外滲，細(xì)胞膜是細(xì)辛揮發(fā)油抗菌作用靶點(diǎn)之一。

3.3 對(duì)呼吸作用和能量代謝的作用

呼吸代謝是生物體生存的方式和產(chǎn)生能量的動(dòng)力，其實(shí)質(zhì)是機(jī)體中糖類物質(zhì)的氧化分解。生物體通過(guò)磷酸戊糖途徑、糖酵解途徑、三羧酸循環(huán)途徑等多種呼吸代謝通路為其自身提供生命活動(dòng)所必需的能量。當(dāng)糖的氧化分解過(guò)程遭到抑制，會(huì)阻礙生物體的正常新陳代謝進(jìn)程，甚至導(dǎo)致生物體死亡。肉桂精油使病原菌膜內(nèi)外ATP 濃度改變，影響菌體正常代謝，抑制其生長(zhǎng)；精油也能抑制線粒體的有氧代謝來(lái)發(fā)揮作用。檸檬醛(檸檬精油主成分之一)可通過(guò)其α, β-不飽和鍵與某些酶結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致微生物的代謝系統(tǒng)紊亂[6]。生姜、桂皮、百里香、牛至和丁香精油，能夠損傷酵母菌的呼吸系統(tǒng)，延遲乙醇生產(chǎn)出現(xiàn)。蒔蘿精油可以抑制黃曲霉細(xì)胞麥角甾醇的合成，誘導(dǎo)產(chǎn)生氧自由基，損傷線粒體結(jié)構(gòu)，使線粒體膜電位升高，ATP酶和脫氫酶活性下降，最終抑制黃曲霉生長(zhǎng)[28]。

3.4 對(duì)菌體生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)的影響

孢子是微生物產(chǎn)生的一種有繁殖或休眠作用的生殖細(xì)胞，能直接發(fā)育為新個(gè)體。精油的有效成分可通過(guò)抑制病原菌菌體的生長(zhǎng)、分生孢子的形成和萌發(fā)起作用。肉桂精油在1 000 μL/L的濃度以上時(shí)可有效殺死鏈格孢孢子，同時(shí)顯著影響鏈格孢菌絲的生長(zhǎng)，對(duì)番茄灰霉病菌、蘋(píng)果青霉病菌、番茄莖枯病菌和黃瓜鐮刀菌4種病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制中濃度(EC50)分別為272.17、324.78、316.24、326.95 mg/L[36]。天竺葵精油在濃度為2.0 μL/mL時(shí)完全抑制米曲霉、黑曲霉、鏈格孢菌絲的生長(zhǎng)[37]。百里香酚能夠有效抑制西瓜枯萎病菌分生孢子的萌發(fā)，濃度為25 mg/L時(shí)，菌絲生長(zhǎng)受到抑制，分生孢子的產(chǎn)生受到抑制，培養(yǎng)液中分生孢子的數(shù)量顯著減少；隨著藥劑濃度的升高，菌絲生長(zhǎng)緩慢，細(xì)弱，分支減少；藥劑濃度為100 mg /L時(shí)，菌絲生長(zhǎng)幾乎停滯，部分菌絲發(fā)生斷裂[5]。

此外，植物精油對(duì)菌體DNA、RNA以及DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性具有一定的影響[30]。植物精油對(duì)植物病原菌是否還存在其它影響還有待于進(jìn)一步研究。

4 植物精油抑菌活性研究展望

植物精油源于天然，對(duì)人及哺乳動(dòng)物低毒，且殘留低，具有很好的環(huán)境兼容性，有望開(kāi)發(fā)成為新型綠色無(wú)公害農(nóng)用殺菌劑，但其需要大量的工作要做。擴(kuò)展具有農(nóng)用抑菌活性的植物精油資源，對(duì)植物精油進(jìn)行農(nóng)用抑菌活性研究將極大地?cái)U(kuò)展植物精油資源在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用，使植物精油資源得到充分利用。雖然，植物精油及其主要成分的抑菌活性和作用機(jī)理已經(jīng)取得一定成果，但仍存在一些問(wèn)題。目前大多研究是在單一植物病原菌存在和恒定的環(huán)境條件下進(jìn)行的，關(guān)于多種植物病原菌共同存在的作用方式研究的比較少。植物精油成分十分復(fù)雜，對(duì)其多種成分之間以及不同精油之間的相互作用的研究較少，需要對(duì)不同精油及不同活性成分間的協(xié)同作用進(jìn)行深入研究。另外，植物精油的抑菌機(jī)理研究還不夠深入，關(guān)于植物精油對(duì)細(xì)胞膜的研究最多，但多是通過(guò)電鏡觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化、細(xì)胞內(nèi)容物滲漏情況、細(xì)胞膜上某物質(zhì)含量的變化證明植物精油可以破壞細(xì)胞膜，增加膜的通透性，對(duì)細(xì)胞膜上蛋白質(zhì)和磷脂的靶向作用尚不清楚，需要進(jìn)一步研究。植物精油對(duì)細(xì)胞其他細(xì)胞器結(jié)構(gòu)和功能的影響以及能量代謝等還處于初步研究階段，其明確靶位點(diǎn)和作用方式還不清楚，需要對(duì)生物分子水平進(jìn)行更深一步的研究，明確精油的作用方式。植物精油作為一種新型的植物源農(nóng)藥有其潛在的價(jià)值和廣闊的市場(chǎng)，可以預(yù)見(jiàn)植物精油用于植物病害的防治將是今后的一大趨勢(shì)。