高壓氧對大鼠脊髓損傷后蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶表達(dá)和運(yùn)動功能的影響①

應(yīng)新旺，陳曉龍，谷鵬鵬，李思思，蔣松鶴

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)中心，浙江溫州市325027

蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like ER kinase,PERK)是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的一個(gè)Ⅰ型跨膜蛋白，屬于真核細(xì)胞起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α,eIF2α)上游激酶家族[1]。PERK是介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)整合調(diào)控反應(yīng)重要的細(xì)胞內(nèi)信號途徑之一，參與機(jī)體多種疾病和病理過程的發(fā)生和發(fā)展[2]。相關(guān)研究表明，適度的ERS可以保護(hù)細(xì)胞器，持續(xù)、劇烈的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可誘導(dǎo)PERK蛋白表達(dá)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[3-5]。急性脊髓損傷后，ERS程度明顯增強(qiáng)，上調(diào)ERS凋亡相關(guān)蛋白，從而引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞等凋亡[6-7]。而高壓氧作為一種無創(chuàng)的物理治療方法，臨床上已用于治療脊髓損傷患者[8-9]，但其神經(jīng)保護(hù)機(jī)制尚不明確。

本實(shí)驗(yàn)觀察高壓氧治療對脊髓損傷大鼠后肢運(yùn)動功能恢復(fù)情況以及受損脊髓PERK蛋白表達(dá)的影響，探討高壓氧的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，為高壓氧治療脊髓損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級成年雄性Sprague-Dawley大鼠36只，體質(zhì)量200~250 g，購買于溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組和高壓氧組，每組9只。

本實(shí)驗(yàn)已通過溫州醫(yī)科大學(xué)動物保護(hù)和使用委員會同意，符合實(shí)驗(yàn)動物倫理學(xué)要求，實(shí)驗(yàn)過程盡量降低動物的不適感，且使用最小數(shù)量的動物。動物均飼養(yǎng)于動物房清潔籠內(nèi)，自由飲食、飲水，動物房室溫(22±2)℃，相對濕度50%~70%，動物房保持日夜12 h規(guī)律變化。

1.2 模型制作

5%水合氯醛6 ml/kg腹腔注射，術(shù)區(qū)常規(guī)碘伏消毒，定位于T10棘突，以此為中心，做一個(gè)約3 cm縱行切口，鈍性分離肌肉韌帶，暴露T9~T11棘突及椎板，用止血鉗小心咬除棘突及椎板，注意勿傷脊髓硬脊膜，充分暴露脊髓長度約1 cm。用紐約大學(xué)脊髓打擊器(New York University Impactor,NYU)[10]精確撞擊制作大鼠脊髓不完全損傷模型(T10打擊，2.5 cm×10 g)。以打擊后脊髓組織出現(xiàn)水腫，脊膜充血呈紫紅色，雙下肢回縮撲動，尾巴痙攣性擺動，弛緩性癱瘓即視為造模成功?？p合肌肉筋膜和皮膚，表面消毒，放回鼠籠飼養(yǎng)，術(shù)后早晚各一次協(xié)助脊髓損傷大鼠排尿、排便。

1.3 干預(yù)方法

正常組不做任何處理。假手術(shù)組僅暴露T9~T11節(jié)段脊髓，不打擊脊髓。模型組暴露T9~T11節(jié)段脊髓，打擊脊髓。高壓氧組暴露T9~T11節(jié)段脊髓，打擊脊髓，給予連續(xù)高壓氧治療7 d。

1.4 后肢運(yùn)動功能情況

采用BBB(Basso,Beattie and Bresnahan)運(yùn)動功能評分法[11]對實(shí)驗(yàn)大鼠雙下肢功能恢復(fù)情況進(jìn)行評分。分別于術(shù)前及造模后6 h、3 d、7 d，晚上19:00~20:00進(jìn)行。將大鼠后肢功能分為22個(gè)等級，最小值0分，最大值21分。其中0~7分主要評判動物后肢各關(guān)節(jié)活動；8~13分主要評判下肢的步態(tài)及協(xié)調(diào)；14~21分主要評判運(yùn)動中爪的精細(xì)動作。

1.5 高壓氧治療

高壓氧治療在大鼠急性脊髓損傷造模成功后6 h開始。將大鼠放置在紙箱內(nèi)，放入單人高壓氧艙(DS400-Ⅳ型，濰坊華信氧業(yè)有限公司，中國山東)進(jìn)行高壓氧治療。在純氧洗艙5 min后，采用純氧逐漸升壓至2個(gè)絕對大氣壓，穩(wěn)壓吸純氧90~100 min，中間暫停15 min，最后經(jīng)15~20 min逐漸減壓出艙。高壓氧治療時(shí)始終保持艙內(nèi)氧濃度在95%以上。每次120 min，每天1次，連續(xù)治療7 d，治療后送回動物房內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng)。

1.6 標(biāo)本取材

1.6.1 脊髓組織蛋白電泳標(biāo)本制作

每組取實(shí)驗(yàn)大鼠5只于術(shù)后7 d處死取材。5%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，迅速打開胸腔，充分暴露心臟，灌注針經(jīng)左心室插入主動脈，止血鉗將灌注管固定，剪開右心耳，200 ml生理鹽水由快到慢灌注至肝由紅色變?yōu)樯n白。在低溫下迅速切取損傷區(qū)脊髓約1.5 cm，置于液氮中，之后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于Western blotting檢測。

1.6.2 HE染色標(biāo)本制作

每組取實(shí)驗(yàn)大鼠4只于術(shù)后7 d處死取材。5%水合氯醛6 ml/kg腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠，迅速打開胸腔，充分暴露心臟，灌注針經(jīng)左心室插入主動脈，止血鉗將灌注針固定，剪開右心耳，生理鹽水行心臟灌注，灌注至肝肺變白，后改輸預(yù)冷4%多聚甲醛300~400 ml左右，灌注速度先快后慢，灌注過程中看到大鼠四肢和尾巴抽搐，待四肢脊柱變硬后即完成灌注，取出損傷節(jié)段脊髓1.5 cm，放于4℃的4%多聚甲醛中固定24 h，然后分別經(jīng)15%、20%、30%蔗糖溶液梯度脫水沉底，找一個(gè)大小合適的模具，擠適量冰凍切片包埋劑(optimum cutting temperature,OCT)，然后放入脊髓組織，根據(jù)切的方向和部位調(diào)整好位置，OCT沒過脊髓組織，放進(jìn)-80℃冰箱保存做冰凍切片。冰凍切片機(jī)上連續(xù)冠狀切片，片厚8μm，每隔4張取1張。

1.7 HE染色

室溫下風(fēng)干切片，PBS浸泡10 min，蘇木素染色60 s，自來水沖洗30 s，自來水返藍(lán)5 min，伊紅染色1 min，自來水沖洗30 s，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.8 Western blotting

取標(biāo)本受損區(qū)脊髓1.5 cm置于勻漿管中，加入強(qiáng)裂解液RIPA、PMSF(100∶1)于勻漿器上搖勻震碎，4℃離心機(jī)12000 r/min，共15 min，提取上清進(jìn)行蛋白檢測與定量。制膠(10%分離膠和5%濃縮膠)，100℃高溫使蛋白質(zhì)變性后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電壓80 V，時(shí)間90 min。切膠濕轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜，PERK蛋白(分子量140 kD)轉(zhuǎn)膜120 min，內(nèi)參 Tubulin(分子量 55 kD)轉(zhuǎn)膜60 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將膜置于TBS液平衡5 min，5%脫脂奶粉封閉2 h。封閉結(jié)束后TBST洗膜5 min×3次，孵育兔源性PERK一抗(1∶1000，CELL SIGNALING公司)，兔源性Tubulin一抗(1∶1000)，4℃過夜。孵育一抗結(jié)束后TBST洗膜5 min×4次，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(1∶5000，碧云天公司)室溫孵育1 h。TBST洗膜5 min×4次，ECL顯影。蛋白條帶用AlphaE-ascFC(FluorChem 8900)軟件分析，采用平均灰度值比值比較各組蛋白的表達(dá)差異。Tubulin作為內(nèi)參，將指標(biāo)灰度值與對應(yīng)內(nèi)參灰度值比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析所得數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用(xˉ±s)表示，多組間比較用單因素方差分析，兩組間比較采用Student t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)顯著性，方差齊者予LSD檢驗(yàn)，方差不齊者予Dunnett's T3檢驗(yàn)。顯著性水平ɑ=0.05。

2 結(jié)果

2.1 BBB評分

術(shù)前四組BBB評分均為21分，穩(wěn)定無變化。術(shù)后6 h，模型組和高壓氧組BBB評分為0分，造模成功。術(shù)后3 d和7 d，模型組BBB評分低于假手術(shù)組(P<0.05)。術(shù)后7 d，高壓氧組BBB評分高于模型組(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)間段BBB評分

2.2 HE染色

正常組和假手術(shù)組均未見明顯結(jié)構(gòu)異常。模型組損傷脊髓區(qū)域可見胞體腫脹，結(jié)構(gòu)模糊，間隙增大，胞核固縮等病理結(jié)構(gòu)。與模型組相比，高壓氧組組織水腫情況明顯減輕。見圖1。

圖1 各組損傷脊髓區(qū)HE染色(400×)

2.3 Western blotting

術(shù)后7 d，模型組PERK蛋白表達(dá)明顯高于假手術(shù)組(P<0.01)，高壓氧組PERK蛋白低于模型組相比(P<0.05)。見圖2、表2。

表2 術(shù)后7 d各組脊髓PERK蛋白表達(dá)

圖2 術(shù)后7 d各組脊髓PERK蛋白條帶圖

3 討論

脊髓損傷是嚴(yán)重危害人類生存和生活質(zhì)量的一類中樞性神經(jīng)創(chuàng)傷。近年來，隨著交通運(yùn)輸業(yè)和建筑業(yè)的快速發(fā)展，脊髓損傷的發(fā)病率逐年上升，尤其在中青年人群中高發(fā)，給患者、家庭、社會帶來嚴(yán)重的身心打擊和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[12]。急性脊髓損傷由原發(fā)損傷和繼發(fā)損傷共同導(dǎo)致，繼發(fā)損傷通常是由級聯(lián)、進(jìn)展性的局部組織破壞引起[13]。繼發(fā)損傷伴隨原發(fā)損傷而發(fā)生，可持續(xù)數(shù)周，主要表現(xiàn)為血管缺血、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)興奮性毒性反應(yīng)和自由基的釋放產(chǎn)生，最后導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的死亡和組織破壞[14-15]。

高壓氧治療脊髓損傷是一種安全、有效的治療手段，高壓氧治療能有效促進(jìn)脊髓功能恢復(fù)，縮短治療時(shí)間，降低致殘率，提高患者生活質(zhì)量，具有明顯的社會效益。特別是在急性脊髓損傷早期接受高壓氧治療對功能恢復(fù)更有益處[9]。研究表明，高壓氧治療可在多方面阻止或逆轉(zhuǎn)頸髓損傷后的病理生理發(fā)展進(jìn)程，如控制炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)神經(jīng)修復(fù)和再生能力，促進(jìn)血管再生，降低肌張力等，對脊髓損傷后脊髓功能恢復(fù)有促進(jìn)作用[16-17]。

近年研究發(fā)現(xiàn)高壓氧治療脊髓損傷可能與抑制ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)。在脊髓損傷后，受損神經(jīng)細(xì)胞存在著廣泛的ERS現(xiàn)象，ERS可能介導(dǎo)細(xì)胞死亡和修復(fù)過程[18-19]。當(dāng)發(fā)生ERS時(shí)，機(jī)體會通過減少新生蛋白質(zhì)的合成，增加伴侶分子的合成及錯(cuò)誤折疊或未折疊蛋白質(zhì)的降解來維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)平衡，即未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)[20]。當(dāng)ERS持續(xù)存在時(shí)，UPR不能緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)，UPR中一些促凋亡信號通路被激活，分別為PERK信號通路、肌醇酶l(inositol requiring enzyme l,IREI)信號通路和活化轉(zhuǎn)錄因子6(the activating transcription factor 6,ATF6)信號通路，這3條信號通路均可激活細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其中PERK信號通路是UPR中最先被激活，也是最主要的信號通路[21-22]。PERK信號通路可通過CHOP(C/EBP-homologous Protein)凋亡信號通路和胱天蛋白酶(caspase)介導(dǎo)的凋亡信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡[23]。CHOP屬于C/EBP轉(zhuǎn)錄因子族的成員，CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生凋亡的標(biāo)志性基因，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)節(jié)的凋亡，并且CHOP基因表達(dá)缺陷的細(xì)胞顯著減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[24]。PERK-eIF2α-ATF4-CHOP路徑是其產(chǎn)生的主要信號通路，PERK蛋白可通過磷酸化eIF2α抑制細(xì)胞中蛋白質(zhì)的合成，同時(shí)PERK蛋白可介導(dǎo)的eIF2α磷酸化可選擇性介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活化因子4(ATF4)的mRNA表達(dá)水平升高，ATF4的翻譯水平顯著增加，通過上調(diào)CHOP基因的表達(dá)，最終通過激活caspase-3從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[25-26]。另外研究發(fā)現(xiàn)，PERK信號通路也可通過T細(xì)胞死亡相關(guān)基因51(T-cell death-associated gene 51,TDAG51)、核呼吸因子(nuclear respiratory factors,NRFs)和鈣離子等途徑直接或間接激活下游促細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡[23,27]。

有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，低氧環(huán)境可能誘導(dǎo)ERS的發(fā)生，與磷酸化PERK、CHOP蛋白的表達(dá)趨勢呈正相關(guān)，這說明低氧造成的組織損傷可能與ERS激活PERK通路，誘導(dǎo)CHOP蛋白高表達(dá)，從而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡有相關(guān)性[22]。Liu等[19]研究脊髓損傷大鼠凋亡相關(guān)蛋白，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，脊髓損傷大鼠的凋亡相關(guān)分子CHOP、caspase-3、caspase-12的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯增加。Wang等[28]研究發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷大鼠高壓氧預(yù)處理后可促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達(dá)，降低凋亡相關(guān)分子caspase-3和caspase-9蛋白表達(dá)。

本研究采用2個(gè)絕對大氣壓高濃度純氧治療脊髓損傷大鼠，通過Western blotting觀察細(xì)胞凋亡上游重要的調(diào)控分子PERK蛋白。與模型組相比，高壓氧組脊髓損傷術(shù)后大鼠受損脊髓PERK蛋白表達(dá)明顯減少，說明高壓氧治療可抑制PERK蛋白表達(dá)，下調(diào)ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑，降低脊髓損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，高壓氧組組織水腫情況明顯減輕。另外，高壓氧組7 d后的BBB運(yùn)動評分高于模型組，說明高壓氧組脊髓損傷大鼠的運(yùn)動功能水平明顯改善。因此，長期高壓氧治療可改善脊髓損傷大鼠受損的組織細(xì)胞，進(jìn)而恢復(fù)其運(yùn)動功能。

綜上所述，高壓氧治療可以改善脊髓損傷大鼠的運(yùn)動功能水平，提示高壓氧治療可抑制PERK蛋白的表達(dá)，降低脊髓損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而起到一定的保護(hù)作用。