阿爾茨海默病標(biāo)志物的探索：外周血淋巴細(xì)胞G1/S調(diào)控點功能障礙

周小英， 張微微， 劉 揚， 高旭光

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是以進(jìn)行性全面認(rèn)知功能障礙和行為損害為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變?！吧窠?jīng)退行性變-細(xì)胞周期”假說認(rèn)為[1]，AD腦神經(jīng)元細(xì)胞周期調(diào)控異常發(fā)生于一個重要的細(xì)胞周期調(diào)控點：G1/S調(diào)控點，即異常進(jìn)入細(xì)胞循環(huán)的神經(jīng)元G1→S調(diào)控障礙。有報道[2]，AD病程中細(xì)胞周期調(diào)控失敗不僅局限于腦神經(jīng)元，外周組織(如外周血淋巴細(xì)胞)亦有神經(jīng)元細(xì)胞周期調(diào)控異常相關(guān)的表現(xiàn)。目前還沒有AD簡易有效的診斷標(biāo)志物[3]，這也是人們一直研究的熱點與難點。

AD外周血細(xì)胞周期方面的研究很少，國內(nèi)AD G1/S調(diào)控點功能的研究僅檢索到一篇，出自本作者團(tuán)隊[4]。AD外周組織G1/S調(diào)控點的報道更少，國外僅檢索到若干篇，其中一篇出自本作者團(tuán)隊[5]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)[4,5]：AD者淋巴細(xì)胞G1/S調(diào)控點功能發(fā)生障礙，這可能是中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元細(xì)胞周期調(diào)控異常在外周血淋巴細(xì)胞中的反應(yīng)之一。本研究在前期基礎(chǔ)上，除正常者外，另增設(shè)了血管性癡呆(vascular dementia,VaD)者以及其他神經(jīng)系統(tǒng)變性病伴發(fā)的癡呆：帕金森病/帕金森疊加綜合征(Parkinson’s disease/Parkinsonism-Plus syndrome,PD/PPS)者為對照組，對比各組G1/S調(diào)控點功能的差異情況，發(fā)現(xiàn)AD外周血淋巴細(xì)胞G1/S調(diào)控點功能障礙可能為AD所特有，這有望成為AD新的血液標(biāo)志物。該項標(biāo)志物的探索，不僅有助于我們更深入地理解AD的發(fā)病機(jī)制，還將對AD診斷準(zhǔn)確性的提高及其新的治療靶點的開創(chuàng)提供思路，可能具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2011年6月-2016年6月于北京大學(xué)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科收集：AD者18例、VaD者14例、PD/PPS者12例，正常者18例。利用簡易精神狀態(tài)量表(MMSE)評價各組認(rèn)知功能。全部研究對象通過北京大學(xué)人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，全部研究對象或其監(jiān)護(hù)人已簽署知情同意書。實驗組：AD組(18例)：男女比例為10∶8，年齡69～82歲，采用NINCDS-ADRDA(美國國立神經(jīng)病、語言機(jī)能紊亂和卒中研究所及阿爾茨海默病和相關(guān)疾病協(xié)會)臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，把診斷為“很可能AD”者列為AD組，MMSE≤23分。對照組：正常組(18例)：男女比例為10∶8，年齡63～81歲，經(jīng)臨床檢查和認(rèn)知評估正常，確定為健康者。家族中均無癡呆患者。年齡、職業(yè)及教育程度等與實驗組基本一致的正常人列為正常組。MMSE≥27分。排除全身系統(tǒng)性疾病，排除精神系統(tǒng)疾病，排除手術(shù)、外傷史。VaD組(14例)：男女比例為9∶5，年齡68～88歲，采用NINDS-AIREN(美國國立精神病與卒中研究所/瑞士神經(jīng)科學(xué)研究國際協(xié)會)診斷標(biāo)準(zhǔn)，將診斷為“很可能VaD”者列為VaD組，MMSE≤23分。PD/PPS組(12例)：男女比例為7∶5，年齡67～79歲，PD診斷按照“2006版中國帕金森病診斷標(biāo)準(zhǔn)”；對有帕金森樣癥狀、癡呆表現(xiàn)的其他神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病者列為PPS者，PD、PPS二者統(tǒng)一為PD/PDS組，MMSE≤23分。

1.2 研究方法 各組研究對象抽血5 ml于肝素抗凝管內(nèi),分離各組外周血淋巴細(xì)胞;于含青、鏈霉素的PRM1640培養(yǎng)液，37 ℃孵育，選擇對數(shù)生長細(xì)胞做實驗用。加入植物凝集素(促使細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞循環(huán))，使其終濃度為10 ng/ml，37 ℃孵育24 h；而后加入雷帕霉素(特異性阻滯細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)換)，使其終濃度為100 ng/ml，37 ℃繼續(xù)孵育24 h(標(biāo)記為T48期細(xì)胞)。細(xì)胞依次經(jīng)洗滌、固定、RNA酶消化、DNA染色，Becton-Dickinson流式細(xì)胞分析儀分析，記錄20,000個細(xì)胞事件。 采用Mod Fit LT 3.0與Multicycle計算機(jī)軟件分析細(xì)胞周期。計算出在細(xì)胞周期不同階段的細(xì)胞百分比，即細(xì)胞周期分布情況。細(xì)胞周期分布中的G1%=G0%+G1%,G2%=G2%+M%，所以用G1%、S%、G2%分別表示各時相。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 根據(jù)不同的可能影響因素對各組結(jié)果進(jìn)行分析。兩組間結(jié)果的比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析one-way ANOVA，若多組比較后總體差異有統(tǒng)計學(xué)意義，則進(jìn)一步采用LSD、SNK或者Dunnett T3方法進(jìn)行兩兩比較。使用SPSS 19.0軟件，P<0.05認(rèn)為組間有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 病例一般資料比較 4組病例“年齡”總體差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；AD組、VaD組、PD/PPS組“發(fā)病年齡”總體差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；正常組MMSE評分高于VaD組(P<0.01)、PD/PPS組(P<0.01)和AD組(P<0.01)，而VaD組、PD/PPS組、AD組間MMSE評分差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。

2.2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布比較 AD組T48細(xì)胞G1%低于正常組(P<0.01)、VaD組(P<0.01)、PD/PPS組(P<0.01)，而3組對照組間對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。AD組T48細(xì)胞S%高于正常組(P<0.01)、VaD組(P<0.01)、PD/PPS組(P<0.01)，而3組對照組間S%差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。AD組T48細(xì)胞G2%高于VaD組(P<0.01)、PD/PPS組(P<0.01)，AD組T48細(xì)胞G2%與正常組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

表1 各組一般資料比較

與VaD組、PD/PPS組、AD組相比*P<0.01

表2 各組T48細(xì)胞周期時相分布比較

與AD組相比*P<0.01

3 討 論

細(xì)胞周期分為4個階段：G1期(DNA合成前期)、S期(DNA合成期)、G2期(DNA合成后期)和M期(有絲分裂期)。為確保遺傳信息的準(zhǔn)確傳遞，細(xì)胞在長期的進(jìn)化過程中逐漸形成了一整套細(xì)胞周期監(jiān)督機(jī)制，稱為細(xì)胞周期“調(diào)控點”(Cell Cycle Checkpoints)[6]。一些突發(fā)事件引發(fā)的細(xì)胞反應(yīng)能影響驅(qū)動細(xì)胞周期前進(jìn)的因子，從而使細(xì)胞周期停滯于調(diào)控點，以消除所受到的不利影響，這被稱為細(xì)胞周期阻滯(Cell Cycle Arrest)[7]。作為體內(nèi)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)關(guān)鍵檢測裝備的細(xì)胞周期“調(diào)控點”又稱為細(xì)胞周期“關(guān)卡”,是控制細(xì)胞增殖周期的限速位點，其功能是在DNA復(fù)制和有絲分裂前確定DNA合成的完整性，保證各個細(xì)胞周期事件的啟動、完成與忠實地按序進(jìn)行。細(xì)胞對DNA損傷作用的反應(yīng)是激活細(xì)胞周期調(diào)控點。至少有兩個調(diào)控點監(jiān)測細(xì)胞DNA損傷：G1/S調(diào)控點(決定G1期向S期的轉(zhuǎn)換)和G2/M調(diào)控點(決定G2期向M期的轉(zhuǎn)換)，其中以“G1/S調(diào)控點”最為關(guān)鍵[8,9]，當(dāng)細(xì)胞受到損害時，細(xì)胞便被G1/S期調(diào)控點阻滯于G1期，待基因組被修復(fù)完整后重返進(jìn)入S期，若不能修復(fù)，則觸發(fā)細(xì)胞進(jìn)入程序性死亡。

已證實，AD腦神經(jīng)元細(xì)胞周期調(diào)控異常發(fā)生于G1/S調(diào)控點[10,11]，即異常進(jìn)入細(xì)胞周期的神經(jīng)元G1→S調(diào)控障礙，且該調(diào)控點功能異?？赡苁瞧癜l(fā)現(xiàn)的AD腦神經(jīng)元最早期的病理改變[12]。AD中細(xì)胞DNA受損后，其G1/S調(diào)控點的功能不僅不能被激活，反而失去了本來的固有功能，使受損細(xì)胞不能停滯于G1期進(jìn)行DNA修復(fù)，而是進(jìn)入G2/M期，但是細(xì)胞不能進(jìn)行正常的分裂，所以最終走向死亡。因此，可將AD的發(fā)展歸納為兩階段：首先是細(xì)胞周期調(diào)控障礙(G1/S調(diào)節(jié)失敗，細(xì)胞周期進(jìn)展)，接著是DNA復(fù)制，細(xì)胞發(fā)生兩種結(jié)局：經(jīng)過凋亡程序死亡或存活并產(chǎn)生AD型病理改變，即AD的發(fā)生是從G1期→S期→G2期→細(xì)胞死亡形成的途徑[13]。AD的病理形成是兩個階段過程，給AD的診斷及治療帶來了機(jī)會，G1/S調(diào)節(jié)失敗在AD的發(fā)展中具有獨特性，并可預(yù)測AD的發(fā)生和進(jìn)展。

本研究首先用植物凝集素活化處于靜止期(G0期)的淋巴細(xì)胞使其進(jìn)入細(xì)胞循環(huán)，再進(jìn)行雷帕霉素(細(xì)胞周期抑制劑，特異性阻止細(xì)胞由G1期向S期的轉(zhuǎn)化，使細(xì)胞停滯于G1期)干預(yù)后應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測其細(xì)胞周期時相分布情況。發(fā)現(xiàn)：(1)正常組、VaD組、PD/PPS組間細(xì)胞周期時相分布無差異，說明雷帕霉素于3組對照組細(xì)胞中所發(fā)揮出的G1期向S期轉(zhuǎn)換的阻滯效應(yīng)大致相同，可以認(rèn)為其G1/S調(diào)控點功能受損情況基本一致；(2)AD組G1%低于正常組、VaD組、PD/PPS組，表明：與AD組相比，雷帕霉素于對照組細(xì)胞中發(fā)揮出了更顯著的G1期向S期轉(zhuǎn)換的阻滯效應(yīng)，說明AD組細(xì)胞對雷帕霉素的反應(yīng)較對照組不敏感，從而經(jīng)雷帕霉素處理的AD組細(xì)胞呈現(xiàn)出較對照組不明顯的G1期停滯現(xiàn)象，提示：AD組淋巴細(xì)胞G1期至S期轉(zhuǎn)換過程調(diào)控異常，即G1/S調(diào)控點功能障礙(不能行使其阻滯細(xì)胞于G1期的正常功能)導(dǎo)致,盡管在雷帕霉素作用下，AD組細(xì)胞仍不能停滯于G1期而是進(jìn)入到細(xì)胞循環(huán)G2期。

本研究結(jié)果提示，外周血淋巴細(xì)胞周期G1/S調(diào)控點功能障礙可能為AD所特有，該指標(biāo)有望成為早期診斷AD的一個血液標(biāo)志物，但關(guān)于該方面的研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，該標(biāo)志物的準(zhǔn)確性、特異性均需進(jìn)一步驗證。常見類型癡呆除AD外，還有血管性癡呆、神經(jīng)系統(tǒng)變性病伴發(fā)癡呆等其他類型癡呆，故本研究在前期基礎(chǔ)上除設(shè)立正常組為對照組外，還加設(shè)血管性癡呆者、帕金森病/帕金森疊加綜合征伴發(fā)癡呆者為對照組，進(jìn)一步對比AD與其他類型癡呆外周血淋巴細(xì)胞G1/S調(diào)控點功能障礙的差異情況，使AD診斷血液標(biāo)志物的探索更有說服力。但AD分散發(fā)型AD及家族型AD，但絕大多數(shù)病例為散發(fā)型。本研究入選AD病例未能區(qū)分是散發(fā)型還是家族型，二者細(xì)胞周期調(diào)控點功能是否有差異，不得而知，這也是我們今后研究的計劃內(nèi)容之一。

本研究也將為AD提供新的治療靶點，如可發(fā)展G1期向S期轉(zhuǎn)換的阻斷劑來治療AD，這與以往的研究結(jié)果一致。促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程的藥物可加速AD腦神經(jīng)元死亡[14]，而抑制細(xì)胞周期因子或阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程的藥物可保護(hù)AD腦神經(jīng)元免于死亡[15]。目前，雖然尚缺乏有效藥物阻止疾病進(jìn)展，但進(jìn)入細(xì)胞周期的神經(jīng)元由G1期向S期轉(zhuǎn)換的阻斷將給AD的治療帶來曙光。