單細胞測序技術研究進展概述

梁國婷

(濰坊科技學院賈思勰農(nóng)學院/山東省高校設施園藝實驗室 濰坊 262700)

單細胞測序技術是指在單個細胞的水平上對基因組進行高通量測序分析的技術。2011年和2013年，單細胞測序技術分別被《自然—方法(Nature Methods)》和《科學(Science)》列為年度最值得期待和關注的技術之一。單細胞測序技術不僅能更加精確地測量細胞內的基因表達水平，而且能檢測到罕見非編碼RNA和微量基因表達子[1]。而傳統(tǒng)的賴以進行高通量測序的DNA來源于大量細胞，其結果只是這個細胞群體的“平均值”。眾所周知，細胞之間存在異質性，即使表型相同，細胞的遺傳信息也可能具有顯著差異，并且這種“整體表征”的做法，丟失了很多低豐度的信息[2]。另外，很多生物樣品量非常稀少，難以培養(yǎng)，如人體內不能進行體外培養(yǎng)的微生物、早期發(fā)育階段的胚胎細胞及組織微陣列等[3]。這些難以培養(yǎng)的生物樣品給生物學研究帶來了難以逾越的信息鴻溝，人們甚至稱其為生物學上的“暗物質”。隨著單細胞測序需求的日益增加，國際上許多測序公司相繼推出新一代的單細胞測序技術，相關的研究成果也越來越多，如該技術已經(jīng)用于海洋微生物的多樣性研究[4]和腎透明細胞癌[5]及骨髓增殖性腫瘤[6]等的研究。單細胞測序技術正在成為基因序列研究的熱點。

本文概述單細胞測序技術設計的單細胞分離、細胞溶解與基因組DNA的獲取、全基因組擴增、測序與數(shù)據(jù)分析4個方面的操作技術的研究進展。

1 單細胞分離

單細胞測序技術首先要獲得單個細胞，相關技術主要包括連續(xù)稀釋法、顯微操作技術、激光捕獲顯微切割術(LCM)、微流控芯片技術、熒光激活細胞分選技術(FACS)等。這些技術適用范圍不同，各有優(yōu)缺點，需要根據(jù)實驗要求進行選擇。

1.1 連續(xù)稀釋法 連續(xù)稀釋法是一種通過連續(xù)稀釋細胞群來獲得單細胞的方法，這是最簡單、也是最不準確的單細胞分離的方法，很少用于復雜樣品的單細胞分離。

1.2 顯微操作技術 當細胞樣品的復雜度較低時，可以采用顯微操作技術，根據(jù)細胞的形態(tài)特征來分選細胞。目前主要用于分離一些難以培養(yǎng)的微生物細胞[7， 8]?？梢杂蔑@微操作器控制玻璃毛細管或可視化鑷子來分選，技術成本較低，可進行可視化操作，但是由于其通量低、人力成本高、容易造成細胞的機械損傷等缺點，難以廣泛應用。

1.3 激光捕獲顯微切割術 當目的細胞在細胞群中呈分散分布，且占有的比例很小時，人們一般采用激光捕獲顯微切割術(LCM)技術，直接從組織中分離單細胞。這種技術在臨床醫(yī)學中應用比較廣泛。一般步驟包括： 組織切片、裝片、染色處理和可視化操作分離單細胞。但由于操作過程中切割精度有限，容易摻雜相鄰細胞的原生質，以及目的細胞容易丟失核染色體片段，因此在轉錄組學分析中，一般不采用這種技術[9]。

1.4 微流控芯片技術 在物理學上，流體慣性可以在微米級尺度上忽略，微流控技術正是利用這一原理，人為控制(細胞)流體的流動，來實現(xiàn)單細胞的分離[10]。微流控裝置的核心是只容許單個細胞通過的通道，其直徑可根據(jù)細胞的大小進行調節(jié)，并且通道可根據(jù)需要檢測的細胞類型進行修飾。在實驗中，為了減少流體用量、提高樣品濃度，可以將微流控裝置結合到生物芯片上[11， 12]。目前已經(jīng)開發(fā)出了一種集單細胞分離、溶解、基因組DNA抽提與純化于一體的新型微流控芯片[10]，流體量已從原來的mL或μL降至nL或pL。盡管微流控芯片技術因樣品用量小而可以有效避免污染，但是由于其成本較高，故實際應用并不廣泛。

1.5 熒光激活細胞分選技術 熒光激活細胞分選(FACS)技術是目前最流行的單細胞分離技術。流式系統(tǒng)按照細胞特征(大小、顏色、核酸、生物化學活性等)迅速將單個細胞分選到幾百個孔板中。目前的細胞分選儀的參數(shù)已經(jīng)達到了20個，顏色已達到18種；而細胞分選的速率達到了每秒鐘上千個細胞[13]。但是，這種方法也有固有的缺陷： 一是需要大量的細胞懸浮液，會降低低豐度細胞的獲得率;二是分選速率比較快，容易造成細胞損傷。

2 細胞溶解與基因組DNA的獲取

細胞溶解是指采用物理、化學或生物的方法，破除細胞壁和細胞膜，將細胞內的物質釋放出來的一種方法。細胞溶解的質量直接影響了基因組DNA的獲取。實驗中要根據(jù)細胞的種類、基因組DNA的純化難易程度等因素來選擇細胞溶解的方法。

2.1 物理法 溶解細胞的物理方法主要有熱破壞、冷凍、剪切、研磨、高壓和超聲波等。這些方法操作簡便，不容易造成樣品污染，但有可能引起基因組DNA斷裂和降解。

2.2 化學法 溶解細胞的化學方法主要有： 極端pH法和表面活性劑(如SDS和tritonX-100)法。極端pH法主要是對細胞壁和細胞膜進行溶解，其中堿對細胞的磷脂雙分子層的溶解要優(yōu)于酸，這種方法后期需要中和作用；表面活性劑法則通過溶解細胞膜上的脂質和蛋白質，進而溶解細胞，這種方法操作簡便，但是容易造成樣品污染和引起基因組DNA降解。

2.3 生物法 溶解細胞的生物學方法最常使用的是酶降解法(如溶菌酶和蛋白酶)。大多數(shù)革蘭氏陰性菌可以利用溶菌酶進行溶解，而部分格蘭氏陽性菌和一些復雜的群落則需要溶菌酶結合多種其他酶來溶解[14]。模板擴增容易受到DNA結合蛋白的阻礙，需要先用蛋白酶(如蛋白酶K和胰蛋白酶)溶解DNA結合蛋白[15]。

由于在很多基因組中，基因位點拷貝數(shù)只有一個，因此獲得基因組DNA之后，不再進行DNA的純化，以防樣品丟失造成基因位點缺失，這是與傳統(tǒng)的高通量測序的不同之處。同時，該法對溶解細胞的操作提出了更高的要求，即不僅要徹底地溶解細胞，更要避免使用那些影響基因組DNA獲取和后續(xù)全基因組擴增的方法。

3 全基因組擴增

高通量測序需要的DNA樣品質量為幾百納克(ng)，而單個細胞的總DNA含量只有幾皮克(pg)，故遠遠達不到高通量測序的要求[16， 17]，必須進行全基因組擴增，方法目前主要有3種，即： 基于PCR技術的擴增、基于MDA技術的擴增及MDA與PCR相結合的擴增方法。這些方法由于使用的引物和DNA聚合酶不同而各有特點。

3.1 基于PCR技術的擴增方法 早期的全基因組擴增主要采用PCR技術，根據(jù)引物的不同可以將其劃分為三大類： 特異性引物PCR擴增、簡并性引物PCR擴增及雜合性引物PCR擴增。

利用PCR技術進行全基因組的擴增，擴增的覆蓋度比較高，但是容易出現(xiàn)錯誤和覆蓋度不均的現(xiàn)象，故該技術現(xiàn)在已經(jīng)在逐步淘汰。

3.2 基于MDA技術的擴增方法 為了避免PCR技術進行全基因組擴增的種種缺點，具有核酸外切酶抗性的隨機引物結合枯草芽孢桿菌噬菌體(phi29 DNA)聚合酶進行擴增的技術已經(jīng)開始被使用，該技術也稱多位點置換擴增(MDA)。

phi29 DNA聚合酶相比其他DNA聚合酶具有很多優(yōu)點： ①反應條件溫和，在30℃的恒溫下進行；②phi29 DNA聚合酶鏈置換活性強，擴增時可取代擴增模板的互補鏈，互補鏈也可以同時作為模板進行擴增，極大地提高了擴增的效率；③phi29DNA聚合酶持續(xù)合成能力強，能夠擴增出大分子的DNA鏈(大于10 000 nt)。

與PCR技術相比，MDA技術在基因組擴增上已經(jīng)有了進步，但其缺點也不容忽視： ①由于模板和引物隨機結合，所以MDA的全基因組覆蓋度依然不均勻[18]；②MDA反應容易形成單鏈中間體進而產(chǎn)生嵌合序列，導致基因組重排，影響基因組重建，這是MDA與基于PCR的擴增方法的共同缺陷；③污染的DNA容易導致MDA引起非特異性擴增。

3.3 MDA與PCR相結合的方法 多次退火環(huán)狀循環(huán)擴增技術(multiple annealing and looping-based amplification cycles， MALBAC)是一種新的將MDA與PCR結合的擴增技術，可以降低擴增偏倚性，提高測序覆蓋度，也可明顯提高單核苷酸多態(tài)性(SNPs)等位基因的檢出率，提高幅度為70%左右。雖然MALBAC目前主要應用于染色體重組和癌癥研究等方面，應用比較局限，但由于其在全基因組擴增的準確性方面明顯優(yōu)于PCR技術和MDA技術，相信MALBAC的應用前景十分廣闊。

擴增完成后，需要對擴增產(chǎn)物進行質量驗證，常規(guī)采用的方法是對標記基因PCR擴增后進行Sanger測序，來評估全基因組擴增的質量。

4 基因組測序及數(shù)據(jù)分析

4.1 基因組測序 用高通量測序技術進行單堿基測序成本低而數(shù)據(jù)產(chǎn)出量高，是核酸測序研究進程中的一次革命性創(chuàng)新，極大地促進了基因組學和后基因組學研究的進展。目前單細胞基因組測序主要使用第二代和第三代測序技術，前者已比較成熟，后者正在迅速發(fā)展。

4.2 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)分析前要把不需要的標簽序列(barcodes)、連接序列(linker)、接頭序列(adapter)、低質量堿基和污染DNA移除。

傳統(tǒng)的序列拼接方法是基于“嵌合序列比例很小且讀取深度隨基因組呈“泊松分布”的假設，而單細胞數(shù)據(jù)中嵌合序列比例高且基因組覆蓋度不均勻，不能滿足這一假設，必須對基因組進行預處理。目前可以用的預處理策略主要有： 核酸文庫標準化、單細胞測序數(shù)據(jù)混合分析以及生物信息學分析。

4.2.1 核酸文庫標準化策略 目前主要通過實驗法或計算機算法構建一個標準化的核酸文庫。實驗法通過利用一種雙鏈特異性核酸酶降解高豐度的雙鏈DNA序列，并構建標準化的核酸文庫，其標準化水平一般通過定量核酸擴增(quantitative PCR， qPCR)技術來評估；計算機算法利用相關軟件(gsAssembler)將隨機選擇的一定數(shù)目的讀長(reads)序列拼接成較大的片段(contig)；contig長度除以reads的數(shù)目，若結果小于1 bp/read，證明該contig覆蓋度較高，擴增可能存在偏倚性，這時需要移除部分reads序列，來構建標準的核酸文庫。

計算機算法與實驗法相比既節(jié)省了構建文庫的費用，又降低了序列拼接的難度，從而提高了單細胞測序的效率。

4.2.2 單細胞測序數(shù)據(jù)混合分析 細胞間的親緣關系越近，單細胞測序的數(shù)據(jù)混合分析就越可以顯著地提高樣品的平均覆蓋度。也可以將宏基因組數(shù)據(jù)與單細胞數(shù)據(jù)結合起來，既利于序列拼接，又利于建立單細胞和種群基因組之間的關聯(lián)。

4.2.3 生物信息學分析軟件 Velvet-SC是專門針對單細胞數(shù)據(jù)拼接而設計的傳統(tǒng)Velvet軟件的一個修正版。它引入了可變覆蓋度閾值的概念，利用迭代閾值的拼接方法，從“1”開始逐步遞增，在各個閾值下分別拼接并重新計算覆蓋度，減少低覆蓋度區(qū)域數(shù)據(jù)的丟失。Velvet-SC還可以與其他軟件(如EULER軟件)合并使用，或引入其他概念(如k-mers pairs)進一步升級，都可以進一步克服單細胞數(shù)據(jù)讀取中存在的覆蓋度不均和嵌合序列等問題，提高數(shù)據(jù)分析的精度和效率[19]。

5 總結和展望

單細胞測序技術的出現(xiàn)為生命體細胞生物學的研究提供了一個重要的手段。雖然受限于拼接軟件的匱乏和基因組擴增技術的偏倚性，目前單細胞測序技術還不完善，但是毫無疑問，隨著生物信息學的快速發(fā)展和基因組擴增方法的不斷進步，這些問題將迎刃而解。