間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌作用在心血管疾病治療中的研究進展

公緒合綜述，王國干審校

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）治療心血管疾病取得很大進展，然而具體機制不明，早期認(rèn)為是干細(xì)胞分化參與了治療過程，然而直接分化的證據(jù)不足，且分化作用不能解釋干細(xì)胞治療的早期獲益，比如Gnecchi等[1]研究發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞移植后72 h就可獲得心功能改善；同時MSC條件培養(yǎng)基在體外也可以促進缺血心肌的修復(fù)[2]。越來越多的研究者認(rèn)識到MSC旁分泌作用的重要性。旁分泌作用是指干細(xì)胞自身分泌的各種因子參與心血管疾病的修復(fù)和治療，此概念首先在心肌梗死的小鼠模型提出；研究者發(fā)現(xiàn)，骨髓MSC移植可縮小心肌梗死面積，改善心功能，然而移植心肌部位沒有發(fā)現(xiàn)分化的心肌細(xì)胞，且靜脈注射的MSC大多數(shù)停留在肺部和肝臟，只有很少部分到達心肌病理組織[3]。上述研究均提示，干細(xì)胞是通過旁分泌機制在心血管疾病治療中發(fā)揮作用，這些旁分泌因子具有抗炎、抗凋亡、促進血管新生和修復(fù)等作用。下文以MSC旁分泌作用機制為線索，重點闡述其在心血管疾病治療中的研究進展。

1 間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌作用與心肌保護

心肌缺血環(huán)境中干細(xì)胞旁分泌作用的瞬時效應(yīng)是分泌保護性的細(xì)胞因子來改善心肌細(xì)胞生存。Gnecchi等[1]研究發(fā)現(xiàn)，MSC依賴旁分泌機制發(fā)揮直接心肌保護作用，缺氧預(yù)處理的MSC條件培養(yǎng)基可以減少缺氧誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞凋亡和壞死；該研究組還將MSC條件培養(yǎng)基注射到大鼠心肌梗死后心肌組織，結(jié)果72 h后，大鼠心肌梗死面積縮小，心肌細(xì)胞凋亡減少，其中注射蛋白激酶B修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞（Akt-MSC）條件培養(yǎng)基的大鼠改善最為明顯。他們的研究證實，MSC通過釋放旁分泌因子發(fā)揮心肌細(xì)胞保護作用，而蛋白激酶B（Akt）通路激活進一步刺激旁分泌因子的產(chǎn)生。

Uemura等[4]采用不同的檢測方法，同樣證實了MSC旁分泌作用對缺血心肌細(xì)胞的保護作用。他們發(fā)現(xiàn)，MSC條件培養(yǎng)基尤其是缺氧預(yù)處理的條件培養(yǎng)基高表達血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）、胰島素樣生長因子-1（IGF-1）和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（SDF-1）；進一步體內(nèi)實驗將綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記的MSC移植到梗死心肌，發(fā)現(xiàn)梗死邊緣有MSC，但GFP陽性的心肌細(xì)胞很少，分化機制無法解釋干細(xì)胞移植縮小心肌梗死面積和改善心肌細(xì)胞凋亡的作用，因此推斷MSC旁分泌機制起主要作用。

2 間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌作用與血管新生

MSC旁分泌作用的另一個體現(xiàn)是促進血管新生。盡管許多研究顯示骨髓來源干細(xì)胞可融合分化為血管結(jié)構(gòu)，但僅少量血管組織含有寄主來源細(xì)胞。而旁分泌因子包括VEGF、bFGF和肝細(xì)胞生長因子-1（HGF-1）等可以促進內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移和細(xì)胞外基質(zhì)合成。Kamihata等[5]注射MSC至豬心肌梗死后缺血心肌區(qū)域，3周時該部位毛細(xì)血管密度增加、側(cè)支血流明顯灌注，移植干細(xì)胞表達bFGF、VEGF、血管生成素1（Ang-1），腫瘤壞死因子-α（TNF-α），白細(xì)胞介素（IL）1β等促生長因子；這種旁分泌因子促進血管新生的機制進一步被MSC條件培養(yǎng)基證實：僅注射MSC條件培養(yǎng)基至心肌缺血區(qū)域同樣可以提高局部微血管密度。

許多研究證實，MSC條件培養(yǎng)基通過旁分泌機制促進側(cè)支血管生成，旁分泌因子變化參與其中。Yin等[6]發(fā)現(xiàn)，臍帶MSC條件培養(yǎng)基可促進內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，促進樹鼩下肢血管新生，從而減輕肢體缺血。心肌梗死方面，MSC移植實驗發(fā)現(xiàn)，盡管梗死心肌組織極少有寄主來源的新生內(nèi)皮細(xì)胞，但局部毛細(xì)血管密度明顯增加[7]。

上述研究表明，干細(xì)胞旁分泌作用極有可能參與了血管新生，旁分泌因子在缺血、缺氧后心肌組織毛細(xì)血管密度增加和血管新生等方面發(fā)揮重要作用。

3 間充質(zhì)干細(xì)胞的重要旁分泌因子

MSC分泌多種旁分泌生物活性因子，包括抗凋亡、抗炎、趨化和再生因子等，例如VEGF、HGF-1和轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）。

3.1 VEGF

VEGF是第一個被發(fā)現(xiàn)的可溶性血管刺激因子，多種組織均可產(chǎn)生這種血管內(nèi)皮生長因子。研究證實，阻斷VEGF表達可以治療多種血管增生性疾病，如血管瘤和濕性黃斑變性[8-9]。相反，動物實驗和臨床研究顯示，給予VEGF可以促進血管再生[10]。MSC表達VEGF與生理變化密切相關(guān)，是一種有效促進血管新生的方法。

在骨髓干細(xì)胞治療缺血性心肌病心力衰竭動物的研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)了VEGF在MSC調(diào)節(jié)血管新生中的作用，干細(xì)胞表達VEGF或VEGF聯(lián)合干細(xì)胞移植能夠更好地促進血管再生和內(nèi)皮細(xì)胞增殖[11]。最新動物實驗顯示，MSC胞外囊泡通過激活VEGF受體，可促進小鼠后肢缺血的恢復(fù)[12]。臨床試驗干細(xì)胞治療的獲益則與血清VEGF升高相關(guān)[13]。

3.2 HGF-1

HGF-1是一種肝臟再生相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄因子，與酪氨酸激酶受體高度親和，可激活一系列的再生活動，包括血管生成、肌肉生成和造血等。

HGF-1在多種干細(xì)胞治療中起重要作用，比如HGF轉(zhuǎn)染的MSC能夠在肝臟損害中發(fā)揮保護作用[14]；Zhang等[15]將MSC或HGF-MSC移植到豬梗死后心肌組織中，4周后HGF-MSC移植豬的心肌血管密度和縫隙連接蛋白43（CX43）表達均增加，心肌細(xì)胞凋亡和室性心律失常減少。近年研究發(fā)現(xiàn)，MSC分泌HGF能夠通過細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK1/2）調(diào)節(jié)單核細(xì)胞免疫反應(yīng)，如增加IL-10產(chǎn)生[16]。綜上，MSC分泌的HGF-1可發(fā)揮多種作用，包括血管再生、免疫調(diào)節(jié)和抗細(xì)胞凋亡。

3.3 TGF-β

多種組織來源的MSC均可分泌TGF-β，包括脂肪、骨髓和臍帶。研究顯示，干細(xì)胞分泌TGF-β可以抑制T細(xì)胞增殖，TGF-β在阻斷MSC免疫抑制功能中發(fā)揮獨特作用[17]；動物實驗進一步證實，干細(xì)胞移植可促進腦缺血小鼠神經(jīng)功能恢復(fù)，這種作用在沉默TGF-β之后消失，TGF-β依賴性的治療作用與降低炎癥反應(yīng)和抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化有關(guān)[18]。

研究證實，TGF-β介導(dǎo)MSC的免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞分化作用；在MSC分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞的過程中，TGF-β發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用；反之，TGF-β信號家族的突變可以通過影響MSC分化而誘導(dǎo)人體出現(xiàn)各種疾病[19]。

綜上，MSC分泌TGF-β的作用與免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化密切相關(guān)，鑒于TGF-β在各種病理狀態(tài)下對纖維化的作用，它在干細(xì)胞治療研究中也將成為熱點。

4 間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌效應(yīng)的刺激因素

4.1 缺氧預(yù)處理

組織缺氧后可產(chǎn)生缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1），進一步誘導(dǎo)血管原性基因如VEGF、SDF-1轉(zhuǎn)錄[20-21]，一旦MSC遷移至缺氧區(qū)域，各種旁分泌因子的表達明顯增加。體外研究證實了缺氧與MSC旁分泌因子產(chǎn)生的關(guān)系，如骨髓MSC缺氧24 h后，VEGF、成纖維生長因子-2（FGF-2）、HGF、IGF-1的表達明顯增加。缺氧不僅可促使骨髓來源MSC旁分泌因子增加，對脂肪[22]、胎盤[23]、牙髓[24]來源MSC有同樣的效果；進一步研究顯示，缺氧可刺激老年動物來源的MSC產(chǎn)生血管原性因子和抗凋亡因子，如VEGF、HGF、IGF-1等。近期研究發(fā)現(xiàn)，缺氧預(yù)處理能夠通過HIF-1α-GRP78-Akt軸增強MSC的生物活性，包括增殖和分泌功能[25]。

缺氧不僅可刺激MSC旁分泌因子產(chǎn)生，而且可以維持MSC未分化的自我更新狀態(tài)，這可能與MSC本身往往來源于缺氧組織有關(guān)，如脂肪、骨髓等[26]。另外，MSC治療的一個關(guān)鍵作用就是抗炎和免疫調(diào)節(jié)，這種作用在移植物抗寄主病研究中被廣泛證實，而缺氧預(yù)處理本身可以增強這種免疫調(diào)節(jié)活性?？傊?，缺氧預(yù)處理能夠促進MSC旁分泌因子產(chǎn)生，促進血管生成及增強免疫調(diào)節(jié)活性。

4.2 炎癥反應(yīng)

除了缺氧刺激，炎癥反應(yīng)同樣可以促進免疫調(diào)節(jié)和血管再生，干擾素-γ（IFN-γ）干預(yù)可誘導(dǎo)MSC產(chǎn)生炎癥抑制因子，包括補體抑制因子H、免疫調(diào)節(jié)因子TGF-β 和HGF[27]。Noone等[28]的研究顯示，IFN-γ干預(yù)的MSC通過上調(diào)前列腺素-2而免受自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷。

TNF-α同樣可以誘導(dǎo)增強MSC的再生活性。體外及體內(nèi)下肢缺血動物實驗顯示，TNF-α處理的骨髓MSC具有更好的血管再生能力，可刺激VEGF高表達[29]。Lu等[30]的研究顯示，TNF-α預(yù)處理可促使MSC增殖、遷移和成骨分化，上調(diào)骨形成蛋白-2（BMP-2），而通過沉默核糖核酸（RNA）方法干擾BMP-2表達則可部分抑制TNF-α誘導(dǎo)的成骨分化。近期研究顯示，免疫催化劑如脂多糖、Toll樣受體激動劑也可以通過誘導(dǎo)MSC旁分泌因子如VEGF的產(chǎn)生來促進血管新生[31]?？傊装Y刺激可增強MSC的再生潛能和抗炎能力。

4.3 基因聯(lián)合治療

基因聯(lián)合MSC治療，一方面通過轉(zhuǎn)基因提高干細(xì)胞生存、代謝、增殖和分化，治療作用大大增加，其中Akt-MSC模型就是一個典型例子；另一方面，干細(xì)胞可作為基因治療的載體，分泌基因產(chǎn)物發(fā)揮自分泌和旁分泌作用而達到優(yōu)化治療。研究表明，Akt-1轉(zhuǎn)染的MSC移植后存活率及功能更佳，可以釋放更多的旁分泌因子，保護大鼠心肌細(xì)胞[32]。Zhou等[33]同樣發(fā)現(xiàn)，B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（Bcl-2）修飾MSC可提高大鼠心肌梗死細(xì)胞移植后干細(xì)胞存活率，促使更多的VEGF表達，增加毛細(xì)血管密度和減少心肌梗死面積。

以上研究說明，基因聯(lián)合干細(xì)胞治療可增強干細(xì)胞活力，促進更多的旁分泌因子產(chǎn)生，從而對臨近心肌細(xì)胞產(chǎn)生有益作用。類似的HGF、bFGF、VEGF修飾的MSC同樣具有較高的存活率，有心臟保護和血管新生作用。

4.4 三維立體培養(yǎng)

MSC常規(guī)在細(xì)胞塑料培養(yǎng)瓶中單層生長，三維立體如球狀體培養(yǎng)可以產(chǎn)生更多的旁分泌因子，如三維立體培養(yǎng)的臍帶MSC表型特征發(fā)生變化，可提高Toll樣受體和趨化因子受體4（CXCR4）的表達水平，且其遷移和歸巢能力增強[34]。Yl?stalo等[35]也發(fā)現(xiàn)，三維培養(yǎng)的MSC可分泌更多的抗炎、抗凋亡因子，如斯鈣素1（STC-1）、CXCR4。三維培養(yǎng)的MSC條件培養(yǎng)基還可抑制TNF-α、趨化因子受體2（CXCL2）、IL-6、IL-12和IL-23的表達，通過半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）依賴的IL-1通路介導(dǎo)抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用[36]；進一步研究證明，MSC往往自我聚集產(chǎn)生更多的旁分泌因子[37]。綜上，MSC的旁分泌作用可以通過三維立體培養(yǎng)誘導(dǎo)增強。

5 間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌作用的治療前景

許多基礎(chǔ)實驗和臨床研究均證實MSC治療心血管疾病有獲益，尤其是利用干細(xì)胞旁分泌作用治療心肌梗死的研究最為深入，目前由于具體獲益的旁分泌因子仍未完全明確，干細(xì)胞移植仍然是主流方法。若能明確有心臟益處的具體旁分泌因子以及最佳旁分泌因子移植途徑（靜脈、冠狀動脈、心?。┝?、時間，則旁分泌因子移植更容易應(yīng)用于臨床實踐。另外，人和動物模型的實質(zhì)性差異使得問題更加復(fù)雜。單一劑量的生長因子能夠促進動物血管新生，但在人體中則可能無效；另外，旁分泌因子的不穩(wěn)定性和代謝學(xué)特點也是旁分泌因子移植治療的巨大障礙之一。

雖然干細(xì)胞旁分泌治療的道路充滿困難，但隨著研究的深入和蛋白技術(shù)的發(fā)展，相信未來會產(chǎn)生新的干細(xì)胞旁分泌治療模式；在這種情況下，單一的干細(xì)胞旁分泌因子，或者更好的“雞尾酒”旁分泌因子治療心血管病將可能成為現(xiàn)實。