簡述熒光蛋白

王裕鵬

(海南省洋浦經(jīng)濟(jì)開發(fā)區(qū)洋浦中學(xué) 洋浦 578000)

染色和標(biāo)記是細(xì)胞生物學(xué)研究常用方法。早在熒光蛋白發(fā)現(xiàn)之前，免疫偶聯(lián)熒光標(biāo)記、化學(xué)熒光染料直接標(biāo)記等技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物分子的研究中。而熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)及后續(xù)改造，為生命科學(xué)基礎(chǔ)研究提供了更為完善和系統(tǒng)的標(biāo)記工具，為探索活細(xì)胞中微觀生命的活動規(guī)律創(chuàng)造了機(jī)會，推動了人們對生命進(jìn)一步的認(rèn)識。

1 熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)及分類

1.1 綠色熒光蛋白 1962年，下村修從維多利亞多管水母中分離到一種蛋白，在紫外線激發(fā)下它可以發(fā)出綠色熒光，即綠色熒光蛋白(GFP)[1]。他還采用生物化學(xué)方法初步推測了GFP的發(fā)光位點和發(fā)光基團(tuán)[2]。普拉舍于1985至1992年間完成了GFP基因和蛋白質(zhì)序列的測定，并確定了發(fā)光位點[3]。隨后科學(xué)家解析了GFP的晶體結(jié)構(gòu)[4]。首次將GFP應(yīng)用于生物學(xué)研究的是馬丁·查爾菲，他通過分子生物學(xué)技術(shù)將GFP的cDNA在線蟲等模式生物中表達(dá)[5]，使人們意識到GFP作為報告基因的巨大潛力。錢永健團(tuán)隊解析了GFP的發(fā)光機(jī)制[6]，并通過突變對GFP改造，得到了一些熒光亮度更高、吸收峰單一、構(gòu)象折疊效率高的突變體，如GFP-S65T[7]。為了表彰他們在綠色熒光蛋白研究中做出的巨大貢獻(xiàn)，2008年諾貝爾化學(xué)獎授予了下村修、馬丁·查爾菲和錢永健三位科學(xué)家。

1.2 紅色熒光蛋白 1999年，Matz等從珊瑚蟲中分離出了能在紫外照射下發(fā)出紅色熒光的蛋白質(zhì)——紅色熒光蛋白(RFP)[8]。其中，DsRed是最早用于研究的紅色熒光蛋白，2001年Yarbrough等人解析了它的晶體結(jié)構(gòu)[9]。相比于GFP，它有更高的熒光強(qiáng)度，成像背景低，并能激發(fā)和發(fā)射更長的波長。很多時候，研究者可同時使用GFP和DsRed對不同蛋白質(zhì)進(jìn)行雙標(biāo)記可完成GFP無法獨自解決的問題。但DsRed在應(yīng)用中也因成環(huán)氧化過程緩慢、易寡聚化等缺陷，限制了其在一些研究中的應(yīng)用。隨后科研人員對其進(jìn)行一系列的遺傳改造，使其成為真正意義上的RFP。

1.3 其他類型的熒光蛋白 為了擴(kuò)大熒光蛋白的用途，科研人員基于光譜特性作了進(jìn)一步的改造，得到了不同顏色的突變體。例如，突變GFP獲得了藍(lán)色(BFP)、青色(CFP)、綠色(GFP)和黃綠色(YFP)四組不同顏色的熒光蛋白，其光譜范圍覆蓋藍(lán)色至黃色[10]。RFP突變衍生出了橙色、紅色和近紅外光譜的熒光蛋白。以上變種的光譜幾乎覆蓋了可見光范圍，極大地提高了熒光蛋白標(biāo)記選擇的靈活性。此外，隨著人們對熒光蛋白的不斷研究，科研人員又從其他物種分離了各種熒光蛋白，發(fā)現(xiàn)它們會因物種的不同在結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和發(fā)光機(jī)制上也有所差異。

2 熒光蛋白的理化性質(zhì)

GFP是由238個氨基酸組成的分子量約為27 kD的單體蛋白。其二級結(jié)構(gòu)是11條β折疊鏈組成的圓柱體狀，還有一條α螺旋鏈沿圓柱體中軸分布，我們稱之為β罐[4]。GFP能產(chǎn)生熒光是因為內(nèi)部的絲氨酸-酪氨酸-甘氨酸(第65～67位氨基酸殘基)形成了生色團(tuán)，該生色團(tuán)位于圓柱體中心的α螺旋上，為自己創(chuàng)造了一個穩(wěn)定的環(huán)境。生色團(tuán)內(nèi)的分子可環(huán)化形成對羥基亞芐基-咪唑啉酮，這種化學(xué)鍵能被激發(fā)發(fā)光[3]。該過程是自動催化完成的，不需要底物和其他蛋白質(zhì)的修飾，唯一需要氧氣作為輔助因子參與化學(xué)鍵形成時的脫氫反應(yīng)[4，6]。

DsRed是由225個氨基酸組成，分子量約為26 kD的蛋白質(zhì)。與GFP相比，兩者在一級結(jié)構(gòu)上同源性很低，但二級結(jié)構(gòu)的相似度很高，也能形成β罐[9]。其生色團(tuán)是由谷氨酰胺—酪氨酸—甘氨酸(第66～68位氨基酸殘基)組成。生色團(tuán)的形成兩者也有差異，DsRed會先形成類似于GFP的生色團(tuán)中間體，再經(jīng)氧化反應(yīng)，才轉(zhuǎn)為紅色熒光生色團(tuán)[11]。總的來看，DsRed的生色團(tuán)是GFP生色團(tuán)的延伸。

3 熒光蛋白的應(yīng)用

由于熒光蛋白的眾多優(yōu)點，使其廣泛應(yīng)用于生物學(xué)的多個領(lǐng)域。

3.1 蛋白質(zhì)定位和功能研究中的應(yīng)用 熒光標(biāo)記和示蹤是熒光蛋白最基本的功能，也是目前細(xì)胞生物學(xué)研究的重要手段。例如，研究一種蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的分布時，可將目的蛋白基因和熒光蛋白基因融合到同一質(zhì)粒中，構(gòu)建融合基因表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)，表達(dá)的融合蛋白能行使目的蛋白的生物學(xué)功能，又有熒光蛋白的發(fā)光特點。隨后借助激光共聚焦顯微鏡分析目的蛋白的亞細(xì)胞定位。此外，上述融合表達(dá)載體還可用于啟動子分析、基因表達(dá)調(diào)控等的研究。

3.2 蛋白質(zhì)互作研究中的應(yīng)用 蛋白質(zhì)互作是生命現(xiàn)象發(fā)生的基礎(chǔ)，研究其互作可以闡明生物反應(yīng)的機(jī)理，揭示生命現(xiàn)象的本質(zhì)。目前，基于熒光蛋白的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)技術(shù)和熒光互補(FC)技術(shù)已成為研究蛋白互作的有效手段。以FRET技術(shù)為例，F(xiàn)RET現(xiàn)象涉及兩種熒光蛋白，分別作供體和受體，要求供體的發(fā)射譜與受體的吸收譜重疊，當(dāng)兩者距離很近時(1～10 nm)，光子能量將從供體轉(zhuǎn)移至受體，使受體發(fā)出熒光。目前，最常用的一對供受體是基于GFP突變的青色熒光蛋白(CFP)和黃色熒光蛋白(YFP)。例如，研究a、b兩種蛋白質(zhì)間是否互作，就可以將CFP基因和YFP基因分別與編碼a、b蛋白的基因融合到同一質(zhì)粒，并在同一細(xì)胞中表達(dá)。如果a、 b蛋白發(fā)生互作，CFP和YFP也會因a、b蛋白構(gòu)象的改變而靠得很近，從而發(fā)生FRET現(xiàn)象。此時就能檢測到Y(jié)FP發(fā)射的熒光，而CFP發(fā)射的熒光會大大減弱甚至消失。