猴頭菌-青蒿生物轉(zhuǎn)化物化學(xué)成分的研究

趙小芳， 徐 博， 任 杰， 何述金， 李 娟，3*， 李順祥，3*

（1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)， 湖南 長(zhǎng)沙410208； 2. 湖南新匯制藥股份有限公司， 湖南 長(zhǎng)沙410200； 3. 湖南省中藥活性物質(zhì)篩選工程技術(shù)研究中心， 湖南 長(zhǎng)沙410208）

猴頭菌絲體為齒菌科真菌猴頭菌Hericium erinaceus （Bull.） Pers. 經(jīng)固體發(fā)酵而得到的菌絲體干燥粉末, 具有利五臟、 健脾益胃、 降膽固醇、 滋補(bǔ)等功效。 青蒿為菊科艾屬植物黃花蒿Artemisia annua L. 的干燥地上部分[1], 《滇南本草》 中始載“青蒿, 味苦, 性寒, 入脾胃, 去濕熱”。 本課題在猴頭健胃靈片[1]研究基礎(chǔ)上, 將猴頭菌絲體創(chuàng)新性地接種于含青蒿藥材粉的培養(yǎng)基中制得猴頭菌-青蒿生物轉(zhuǎn)化物[2]。 喻凱等[3]從猴頭菌絲體中分離得到的蒽醌類具有抗幽門螺桿菌活性, 課題組前期研究發(fā)現(xiàn)其提取物乙酸乙酯部位抑制抗幽門螺桿菌效果最好, 故對(duì)該部位化學(xué)成分展開研究, 前期已對(duì)10 個(gè)化合物進(jìn)行了報(bào)道[4], 現(xiàn)又分離鑒定10 個(gè)化合物。

1 材料

超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters 公司）； AVANCE ⅢHD 600 型核磁共振波譜儀（德國(guó)布魯克公司）； BSA 124S-CW 分析天平（深圳市華恒儀器有限公司）； JHBE-50T閃式提取器（河南智晶生物科技發(fā)展有限公司）；Sephadex LH-20 （美國(guó)Pharmacia 公司）； 薄層硅膠GF254和柱層析用硅膠（青島海洋化工廠）。 所有試劑均為分析純。

猴頭菌-青蒿生物轉(zhuǎn)化物于2015 年12 月11 日由湖南新匯制藥股份有限公司提供, 標(biāo)本保存于湖南省中藥活性物質(zhì)篩選工程技術(shù)研究中心。

2 提取與分離

取猴頭菌-青蒿生物轉(zhuǎn)化物47.2 kg, 粉碎, 12倍75%乙醇閃式提取6 min, 過濾, 提取液減壓濃縮至無醇味, 等體積乙酸乙酯萃取3 次, 萃取液減壓濃縮得乙酸乙酯部位440 g。 乙酸乙酯部位經(jīng)硅膠柱層析, 石油醚-乙酸乙酯（100 ∶1 ～0 ∶1） 梯度洗脫, 得17 個(gè)組分Fr.A ～Fr.Q。 其中, Fr.A（15.80 g） 經(jīng)硅膠柱, 石油醚-乙酸乙酯（50 ∶1 ～1 ∶1） 梯度洗脫, 得6 個(gè)組分Fr.A1-A6, Fr.A3（1.34 g） 經(jīng)硅膠和Sephadex LH-20 柱得化合物1（5.1 mg）； Fr.I （11.24 g） 經(jīng)硅膠柱, 石油醚-乙酸乙酯（10 ∶1 ～1 ∶1） 梯度洗脫, 得3 個(gè)組分Fr.I1～I(xiàn)3, Fr.I2 （8.13 g） 經(jīng)硅膠反復(fù)柱層析分離得化合物3 （15.3 mg）、 9 （30.2 mg）、 10 （4.8 mg）, Fr.I3 （1.62 g） 經(jīng)硅膠柱分離得化合物6（1.4 mg）； Fr.J 和Fr.K 合并為Fr.JK （25.76 g）經(jīng)硅膠柱, 石油醚-乙酸乙酯（10 ∶1 ～1 ∶1） 梯度洗脫, 得5 個(gè)組分Fr.JK1-JK5, Fr.JK4 （5.60 g）經(jīng)硅膠反復(fù)柱層析分離得化合物4 （47.2 mg）、 5（190.9 mg）, Fr.JK5 （4.01 g） 經(jīng)硅膠柱減壓層析, 石油醚-乙酸乙酯（10 ∶1 ～1 ∶1） 梯度洗脫,得化合物7 （12 mg）、 8 （4.3 mg）； Fr.L （62.35 g） 經(jīng)硅膠柱, 二氯甲烷-甲醇（50 ∶1 ～1 ∶1） 梯度洗脫, 得8 個(gè)組分Fr.L1-L8, Fr.L5 （9.87 g）經(jīng)二氯甲烷-甲醇（20 ∶1 ～3 ∶1） 梯度洗脫, 重結(jié)晶得化合物2 （285.6 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1： 無色針晶（乙酸乙酯）, HR-ESIMS m/z： 415.393 0[M+H]+（計(jì)算值415.394 0）,分子式C29H50O。1H-NMR （600 MHz, CDCl3） δ：1.00 （3H, s, CH3-19）, 0.91 （3H, d, J=6.5 Hz,CH3-21）, 0.84 （9H, m, 26, 27, 29-3CH3）, 0.68（3H, s, CH3-18）；13C-NMR （150 MHz, CDCl3） δ：38.7 （C-1）, 38.4 （C-2）, 212.5 （C-3）, 44.9（C-4）, 46.9 （C-5）, 29.1 （C-6）, 31.9 （C-7）,35.6 （C-8）, 53.9 （C-9）, 35.8 （C-10）, 21.6（C-11）, 40.0 （C-12）, 42.7 （C-13）, 56.3 （C-14）, 24.4 （C-15）, 28.4 （C-16）, 56.4 （C-17）,12.2 （C-18）, 11.6 （C-19）, 36.3 （C-20）, 18.9（C-21）, 34.0 （C-22）, 26.2 （C-23）, 46.0 （C-24）, 29.3 （C-25）, 20.0 （C-26）, 19.2 （C-27）,23.2 （C-28）, 12.1 （C-29）。 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[5] 基本一致, 故鑒定為5α-豆甾-3-酮。

化合物2： 白色片狀結(jié)晶（氯仿）, TLC 10%硫酸乙醇顯色為暗綠色, HR-ESI-MS m/z：431.352 5 [M+H]+（計(jì)算值431.352 5）, 分子式C28H46O3。1H-NMR （600 MHz, CDCl3） δ： 5.35（1H, m, H-7）, 5.23 （1H, dd, J=15.2, 7.6 Hz,H-23）, 5.16 （1H, dd, J=15.2, 8.2 Hz, H-22）,4.08 （1H, m, H-3）, 3.62 （1H, s, H-6）, 2.15（2H, m, H-4）, 2.04 （2H, m, H-12）, 1.09（3H, s, H-19）, 1.03 （3H, d, J = 6.5 Hz, H-21）, 0.92 （3H, d, J = 6.8 Hz, H-28）, 0.84（3H, d, J=6.4 Hz, H-26）, 0.82 （3H, d, J=6.5 Hz, H-27）, 0.60 （3H, s, H-18）；13C-NMR （150 MHz, CDCl3） δ： 33.1 （C-1）, 31.0 （C-2）, 67.9（C-3）, 39.6 （C-4）, 76.1 （C-5）, 73.8 （C-6）,117.7 （C-7）, 144.2 （C-8）, 43.6 （C-9）, 37.3（C-10）, 22.2 （C-11）, 39.4 （C-12）, 43.9 （C-13）, 54.9 （C-14）, 23.0 （C-15）, 28.1 （C-16）,56.1 （C-17）, 12.5 （C-18）, 19.0 （C-19）, 40.6（C-20）, 21.3 （C-21）, 135.5 （C-22）, 132.3（C-23）, 43.0 （C-24）, 33.2 （C-25）, 20.1 （C-26）, 19.8 （C-27）, 17.7 （C-28）。 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6] 基本一致, 故鑒定為 （22E, 24R）-啤酒甾醇。

化合物3： 白色針晶（氯仿）, HR-ESI-MS m/z：283.154 9 [M+H]+（計(jì)算值283.154 5）, 分子式C15H22O5。1H-NMR （600 MHz, CDCl3） δ： 5.64（1H, s, H-5）, 3.63 （1H, brs, H-3β）, 3.21（1H, m, H-11）, 2.07 （1H, dt, J=13.3, 4.4 Hz,H-7）, 1.54 （1H, m, H-1）, 1.50 （1H, m, H-2β）, 1.99 （1H, m, H-2α）, 1.82 （1H, m, H-9α）, 1.12 （1H, m, H-9β）, 1.94 （1H, m, H-8α）, 1.02 （1H, m, H-8β）, 1.30 （1H, m, H-10）, 1.58 （3H, s, CH3-15）, 1.21 （3H, d, J=7.2 Hz, CH3-13）, 0.94 （3H, d, J=6.4 Hz, CH3-14）；13C-NMR （150 MHz, CDCl3） δ： 40.7 （C-1）,30.5 （C-2）, 69.2 （C-3）, 109.0 （C-4）, 99.1（C-5）, 83.1 （C-6）, 42.2 （C-7）, 23.7 （C-8）,33.5 （C-9）, 35.3 （C-10）, 32.9 （C-11）, 171.5（C-12）, 12.7 （C-13）, 18.6 （C-14）, 20.7 （C-15）。 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7-8] 基本一致, 故鑒定為3α-羥基脫氧青蒿素。

化合物4： 黃色棒狀結(jié)晶（甲醇）, TLC 紫外燈（365 nm） 下檢視呈藍(lán)色熒光, HR-ESI-MS m/z：193.049 4 [M+H]+（計(jì)算值193.050 1）, 分子式C10H8O4。1H-NMR （600 MHz, CD3OD） δ： 7.85（1H, d, J=9.4 Hz, H-4）, 7.10 （1H, s, H-5）,6.76 （1H, s, H-8）, 6.20 （1H, d, J=9.4 Hz, H-3）, 3.90 （3H, s, 7-OCH3）；13C-NMR （150 MHz,CD3OD） δ： 164.2 （C-2）, 110.1 （C-3）, 147.2（C-4）, 104.1 （C-5）, 153.0 （C-6）, 146.3 （C-7）, 112.7 （C-8）, 151.5 （C-9）, 112.7 （C-10）,57.0 （7-OCH3）。 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) [9] 基本一致, 故鑒定為異莨菪亭。

化合物5： 白色針晶 （甲醇）, TLC 紫外燈（365 nm） 下檢視呈亮紫色熒光, HR-ESI-MS m/z：247.096 6 [M+H]+（計(jì)算值247.097 0）, 分子式C14H14O4。1H-NMR （600 MHz, CD3OD） δ： 7.87（1H, d, J=9.5 Hz, H-4）, 7.42 （1H, s, H-5）,6.74 （1H, s, H-8）, 6.21 （1H, d, J=9.5 Hz, H-3）, 4.77 （1H, t, J=8.7 Hz, H-2′）, 4.59 （1H,s, 4′-OH）, 3.26 （2H, m, H-3′）, 1.31 （3H, s,CH3-5′）, 1.25 （3H, s, CH3-6′）；13C-NMR （150 MHz, CD3OD） δ： 163.6 （C-2）, 112.0 （C-3）,146.2 （ C-4）, 124.9 （ C-5）, 127.2 （ C-6）,165.2 （C-7）, 98.0 （C-8）, 156.8 （C-9）, 113.9（C-10）, 92.4 （C-2′）, 30.1 （C-3′）, 72.2 （C-4′）, 25.2 （C-5′）, 25.2 （C-6′）。 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10] 基本一致, 故鑒定為nodakenetin。

化合物6： 白色針晶 （氯仿）, TLC 紫外燈（365 nm） 下檢視呈亮紫色熒光, HR-ESI-MS m/z：247.096 8 [M+H]+（計(jì)算值247.097 0）, 分子式C14H14O4。1H-NMR （600 MHz, CDCl3） δ： 7.63（1H, d, J=9.4 Hz, H-4）, 6.79 （1H, d, J=8.5 Hz, H-6）, 6.24 （1H, d, J=9.4 Hz, H-3）, 3.92（1H, t, J= 5.0 Hz, H-3′）, 3.14 （1H, dd, J =17.6, 4.9 Hz, H-4′）, 2.98 （1H, dd, J = 17.6,5.2 Hz, H-4′）, 1.42 （3H, s, CH3-2′）, 1.35（3H, s, CH3-2′）；13C-NMR （150 MHz, CDCl3） δ：161.5 （ C-2）, 156.5 （ C-7）, 153.8 （ C-9）,144.1 （ C-4）, 126.8 （ C-5）, 114.5 （ C-3）,112.7 （ C-6）, 112.4 （ C-8）, 107.6 （ C-10）,78.2 （C-2′）, 68.6 （C-3′）, 22.4 （C-4′）, 26.0（C-5′）, 24.8 （C-6′）。 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11] 基本一致, 故鑒定為（+）-lomatin。

化合物7： 黃色粉末（乙酸乙酯）, TLC 紫外燈（365 nm） 下檢視呈黃色熒光, HR-ESI-MS m/z：347.114 1 [M-H]-（計(jì)算值347.113 1）, 分子式C18H20O7。1H-NMR （600 MHz, CDCl3） δ： 8.13（1H, d, J=9.8 Hz, H-4）, 7.64 （1H, s, H-2′）,7.02 （1H, s, H-3′）, 6.29 （1H, d, J=9.8 Hz,H-3）, 4.60 （1H, d, J = 10.1 Hz, H-3″）, 4.27（1H, m, H-2″）, 4.19 （3H, s, 5-OCH3）, 3.49（3H, s, 4″-OCH3）, 1.32 （3H, s, CH3-4″）, 1.28（3H, s, CH3-4″）；13C-NMR （150 MHz, CDCl3） δ：160.4 （ C-2）, 113.0 （ C-3）, 139.7 （ C-4）,145.0 （C-5）, 60.9 （5-OCH3）, 114.7 （C-6）,150.3 （ C-7）, 127.0 （ C-8）, 144.1 （ C-9）,107.6 （C-10）, 145.4 （C-2′）, 105.5 （C-3′）,76.2 （C-2″）, 76.1 （C-3″）, 71.7 （C-4″）, 25.2（C-5″）, 26.8 （C-6″）, 51.0 （4″-OCH3）。 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12] 基本一致, 故鑒定為（+）-tert-Omethylbyakangelicin。

化合物8： 黃色針晶（甲醇）, HR-ESI-MS m/z：329.070 4 [M-H]-（計(jì)算值329.066 2）, 分子式C17H14O7。1H-NMR （600 MHz, CD3OD） δ： 7.26（2H, brs, H-2′, 6′）, 6.68 （1H, s, H-3）, 6.50（1H, s, H-6）, 6.22 （1H, s, H-8）, 3.96 （6H,s, 2CH3）；13C-NMR （150 MHz, CD3OD） δ： 166.1（C-2）, 104.6 （C-3）, 183.9 （C-4）, 163.3 （C-5）, 100.2 （C-6）, 166.1 （C-7）, 95.1 （C-8）,159.5 （ C-9）, 104.6 （ C-10）, 122.7 （ C-1′）,105.3 （C-2′, 6′）, 149.7 （C-3′, 5′）, 141.2 （C-4′）, 57.1 （3′, 5′-OCH3）。 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]基本一致, 故鑒定為5, 7, 4′ -三羥基-3′, 5′-二甲氧基黃酮。

化合物9： 黃色針晶 （氯仿）, TLC 紫外燈（254 nm） 下檢視顯暗斑, 10%硫酸乙醇顯色為黃色, HR-ESI-MS m/z： 389.123 0 [M+H]+（計(jì)算值389.123 6）, 分子式C20H20O8。1H-NMR （600 MHz, CDCl3） δ： 12.60 （1H, s, 5-OH）, 7.72（1H, dd, J=8.5,1.5 Hz, H-6′）, 7.68 （1H, d, J=1.5 Hz, H-2′）, 6.99 （1H, d, J= 8.5 Hz, H-5′）, 6.50 （1H, s, H-8）, 3.97 （6H, s, 3′, 4′-OCH3）, 3.96 （3H, s, 7-OCH3）, 3.92 （3H, s,6-OCH3）, 3.86 （3H, s, 3-OCH3）；13C-NMR （150 MHz, CDCl3） δ： 156.0 （C-2）, 139.0 （C-3）,179.0 （ C-4）, 152.9 （ C-5）, 132.4 （ C-6）,158.9 （C-7）, 90.5 （C-8）, 152.5 （C-9）, 106.7（C-10）, 123.0 （C-1′）, 111.4 （C-2′）, 148.9（C-3′）, 151.5 （ C-4′）, 111.0 （ C-5′）, 122.3（C-6′）, 60.3 （3-OCH3）, 61.0 （6-OCH3）, 56.5（7-OCH3）, 56.1 （3′-OCH3）, 56.2 （4′-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) [14] 基本一致, 故鑒定為蒿黃素。

化合物10： 黃色針晶（氯仿）, TLC 紫外燈（254 nm） 下檢視顯暗斑, 10%硫酸乙醇顯色為黃色, HR-ESI-MS m/z： 375.107 3 [M+H]+（計(jì)算值375.108 0）, 分子式C19H18O8。1H-NMR （600 MHz, CDCl3） δ： 12.59 （1H, s, 5-OH）, 7.72（1H, dd, J=8.6, 2.3 Hz, H-6′）, 7.68 （1H, d,J=2.3 Hz, H-2′）, 6.96 （1H, d, J=8.6 Hz, H-5′）, 6.50 （1H, s, H-8）, 3.99 （3H, s, 4′-OCH3）, 3.95 （3H, s, 7-OCH3）, 3.92 （3H, s,6-OCH3）, 3.87 （3H, s, 3-OCH3）；13C-NMR （150 MHz, CDCl3） δ： 155.8 （C-2）, 139.1 （C-3）,179.1 （ C-4）, 152.9 （ C-5）, 132.4 （ C-6）,158.9 （C-7）, 90.5 （C-8）, 152.5 （C-9）, 106.7（C-10）, 123.7 （C-1′）, 114.5 （C-2′）, 145.7（C-3′）, 148.9 （ C-4′）, 110.5 （ C-5′）, 121.7（C-6′）, 60.3 （3-OCH3）, 61.0 （6-OCH3）, 56.5（7-OCH3）, 56.2 （4′-OCH3）。 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15] 基本一致, 故鑒定為quercetagetin-3, 7, 3′,4′-tetramethyl ether。

4 討論

研究表明猴頭菌-青蒿生物轉(zhuǎn)化物中含有多種甾體類（1 ～2）、 倍半萜類（3）、 香豆素類（4 ～7） 及黃酮類（8 ～10）, 其抗幽門螺桿菌活性有待進(jìn)一步研究, 以便明確活性成分, 為抗幽門螺桿菌新藥的開發(fā)提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

猴頭菌作為1 種食藥兼用菌, 在治療消化道疾病、 糖尿病等方面引起了廣泛關(guān)注, 食藥用菌與中藥通過生物轉(zhuǎn)化可組成大量不同的發(fā)酵組合, 有利于發(fā)現(xiàn)新的活性成分[16-19], 以期為中藥的發(fā)展帶來新思路。