溫和灸對肌筋膜痛大鼠扳機點骨骼肌病理形態(tài)的影響及其作用機制

林業(yè)武，陳美雄，景亞軍，李義凱，袁仕國

(1 海南省中醫(yī)院，?？?70203；2 南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院)

肌筋膜痛是一種慢性肌肉疼痛，疼痛一般以肌肉上的激痛點(又稱扳機點)為中心，向周圍肌肉擴散[1]。雖然目前對扳機點現(xiàn)象的解釋不同，但均認為肌筋膜痛癥狀的產(chǎn)生起因于扳機點[2]。炎癥反應是導致機體疼痛信號產(chǎn)生的主要原因。有研究證實，肌筋膜痛扳機點存在明顯的炎癥反應[3]。因此，肌筋膜痛可能與扳機點炎癥反應有關。IL-6、TNF-α可通過上調(diào)環(huán)氧化酶2(COX-2)表達，使單核細胞和巨噬細胞大量合成前列腺素E2(PGE2)，從而參與機體炎性疼痛產(chǎn)生。傳統(tǒng)中醫(yī)艾灸治療肌筋膜痛可明顯緩解疼痛癥狀[4]，但其作用機制是否與扳機點組織IL-6、TNF-α、COX-2、PGE2等炎癥因子表達變化有關尚不清楚。2016年1月～2017年12月，本研究觀察了溫和灸對肌筋膜痛大鼠扳機點骨骼肌病理形態(tài)的影響，并探討其可能的作用機制，旨在為艾灸治療肌筋膜痛提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠64只，8周齡，體質(zhì)量(285.5±18.3)g，由南方醫(yī)科大學動物實驗中心提供，動物許可證號：SCXK(粵)20160041。所有大鼠分籠飼養(yǎng)，自由攝食、飲水，飼養(yǎng)環(huán)境溫度22 ℃、濕度60%。本研究符合科學和動物倫理規(guī)范，并接受南方醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會監(jiān)督。溫和灸純艾絨艾條，北京同仁堂(毫州)飲片有限責任公司。XR-PT-10A型動物實驗跑臺，上海欣軟信息科技有限公司。自制打擊器[5，6]，主要部分為長度50 cm的木棒，木棒頂端載有重物，木棒及重物總質(zhì)量1 200 g，下端為鈍頭錐形，打擊面積1 cm×1 cm，打擊高度20 cm，動能2.352 J。BX-53型光學顯微鏡，日本Olympus公司；RM2235型石蠟輪轉(zhuǎn)切片機，德國Leica公司；COX-2、PGE2、IL-6、TNF-α多克隆抗體及相應二抗，武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 動物分組處理 所有大鼠適應性飼養(yǎng)1周，隨機分為對照組24只、模型組24只、艾灸組16只。模型組與艾灸組采用打擊結(jié)合離心運動的方法[5，6]建立肌筋膜痛扳機點模型。具體方法：建模前3天，將大鼠置于動物實驗跑臺上進行適應性平坡跑，每次15 min，每天1次；建模期共8周，每周第1天進行1次打擊，打擊前用10%水合氯醛0.3 mL/100 g體質(zhì)量腹腔注射麻醉，麻醉完全后將大鼠固定于打擊器下方，將質(zhì)量為1 200 g的打擊器從20 cm高度自由落下，打擊右下肢股內(nèi)側(cè)肌中段偏上，造成股內(nèi)側(cè)肌鈍挫傷；打擊次日于傾斜度為16°的動物實驗跑臺上進行持續(xù)性下坡跑訓練，速度16 m/min，持續(xù)90 min，運動中使用聲音和電刺激驅(qū)趕。艾灸組建模結(jié)束，常規(guī)飼養(yǎng)7天開始艾灸治療。艾灸治療方法：10%水合氯醛0.3 mL/100 g體質(zhì)量腹腔注射麻醉，麻醉完全后將大鼠固定于固定板上，點燃艾條(長20 cm，直徑7 mm)并懸空置于右股內(nèi)側(cè)肌扳機點正上方20 mm，每次30 min；將溫度控制儀探頭置于施灸穴位皮膚，通過調(diào)節(jié)艾條與施灸穴位距離，保持施灸部位皮膚溫度(46±1)℃，每天1次，連續(xù)7天。模型組建模結(jié)束，常規(guī)飼養(yǎng)7天，同法麻醉并固定于固定板上，但不予艾灸治療，每天1次，連續(xù)7天。對照組正常飼養(yǎng)，不建模，同期同法麻醉并固定于固定板上，但不予艾灸治療，每天1次，連續(xù)7天。

1.3 相關指標觀察

1.3.1 扳機點骨骼肌組織病理形態(tài) 對照組與模型組分別于艾灸治療前1天及治療結(jié)束3、14天，艾灸組于艾灸治療結(jié)束3、14天，隨機選取8只，10%水合氯醛0.3 mL/100 g體質(zhì)量腹腔注射麻醉，麻醉完全后固定于手術(shù)臺上，充分暴露右側(cè)股內(nèi)側(cè)肌，輕輕按壓打擊部位，尋找緊張帶或收縮結(jié)節(jié)，即扳機點。對照組如無緊張帶或收縮結(jié)節(jié)，則取右下肢股內(nèi)側(cè)肌相同部位組織。以扳機點為中心，切取1 cm×1 cm×1 cm軟組織塊，均分為2份。取其中1份，用生理鹽水漂洗2～3次，40 g/L多聚甲醛4 ℃固定24 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，4 μm厚切片，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察扳機點骨骼肌組織組織病理形態(tài)。

1.3.2 扳機點骨骼肌組織COX-2、PGE2、IL-6、TNF-α表達 采用免疫組化法。取另1份扳機點組織，同法制成4 μm厚切片。切片經(jīng)脫蠟、水化，3% H2O2室溫孵育10 min，阻斷內(nèi)源性過氧化酶活性；0.1 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液(pH 7.4)熱抗原修復，自然冷卻至室溫。5% BSA封閉30 min，分別滴加兔抗大鼠COX-2、PGE2、IL-6、TNF-α多克隆抗體(稀釋比均為1∶200)，37 ℃孵育2 h；PBS沖洗5 min×3次，滴加山羊抗兔IgG二抗(稀釋比1∶100)，37 ℃孵育30 min；PBS沖洗5 min×3次，滴加鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物，37 ℃孵育30 min；PBS沖洗5 min×4次，DAB顯色15 min，蒸餾水沖洗，蘇木精復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察。COX-2、PGE2、IL-6、TNF-α陽性染色區(qū)域呈棕黃色，陰性染色區(qū)域呈淺灰色。每張切片采用CellSens-Entry1.15軟件隨機采集5個200倍視野，Image Pro Plus6.0圖像分析軟件分析COX-2、PGE2、IL-6、TNF-α陽性染色區(qū)域平均光密度(MOD)值。以其MOD值作為COX-2、PGE2、IL-6、TNF-α相對表達量[6]。

2 結(jié)果

2.1 各組扳機點骨骼肌組織病理形態(tài)變化 光鏡下可見，對照組各時期扳機點肌纖維排列規(guī)則，肌間隙均勻一致，無肌纖維扭曲、斷裂、溶解和壞死現(xiàn)象，偶有炎癥細胞浸潤。模型組各時期扳機點肌纖維排列紊亂、斷裂、扭曲，艾灸治療前1天扳機點局部骨骼肌有溶解壞死灶；艾灸治療結(jié)束3天扳機點局部肌纖維纖維化增粗、肌間隙大小不一，并有大量炎性細胞浸潤；艾灸治療結(jié)束14天扳機點局部肌纖維扭曲形成結(jié)節(jié)，炎性細胞浸潤較艾灸治療結(jié)束3天明顯減少。艾灸組艾灸治療結(jié)束3天扳機點肌纖維排列和炎性細胞浸潤較模型組同期明顯改善，局部可見新生小血管；艾灸治療結(jié)束14天可見扳機點骨骼肌纖維排列有序，炎性細胞浸潤基本消失，但局部結(jié)節(jié)膨大尚未消失。

2.2 各組扳機點骨骼肌組織COX-2、PGE2、IL-6、TNF-α表達比較 見表1。

表1 各組扳機點骨骼肌組織COX-2、PGE2、IL-6、TNF-α

注：與同組治療結(jié)束3天比較，*P<0.05；與對照組同期比較，#P<0.05；與模型組同期比較，△P<0.05。

3 討論

肌筋膜痛是一種以存在肌筋膜扳機點為特征的局部骨骼肌疼痛綜合征，可嚴重影響患者生活質(zhì)量。目前認為，肌筋膜痛癥狀的產(chǎn)生起因于扳機點，是造成牽涉痛、關節(jié)活動受限等的主要原因[2，7]。肌筋膜扳機點具有以下病理特征：①扳機點溫度高于正常組織；②扳機點局部區(qū)域可出現(xiàn)異常神經(jīng)電生理改變；③扳機點局部區(qū)域循環(huán)灌注不佳，即有缺血情形；④扳機點局部區(qū)域缺氧，氧耐量和氧適應降低；⑤扳機點神經(jīng)血管活性物質(zhì)和某些神經(jīng)遞質(zhì)異常增多；⑥扳機點局部組織形態(tài)學和顯微病理學改變。雖然肌筋膜痛是非致命性疾病，但可明顯降低患者生活質(zhì)量。目前對肌筋膜痛并無特效治療方法，均為對癥治療，臨床以非甾體類止痛藥較為常見，雖可在一定程度上緩解疼痛，但長期服用胃腸道不良反應較多。近年來中醫(yī)艾灸治療肌筋膜痛取得了一定進展。溫和灸是中醫(yī)艾灸中最為常用的艾灸方法，具有簡、便、驗、廉及患者接受程度高等優(yōu)點。雖然溫和灸可用于治療肌筋膜痛，但對其作用機制尚不清楚。故本研究選擇中醫(yī)艾灸最為代表性的溫和灸作為干預方法，采用中醫(yī)“以痛為腧”取穴法取扳機點作為干預部位，探討了溫和灸對肌筋膜痛大鼠扳機點骨骼肌病理形態(tài)的影響及其可能的作用機制，旨在為艾灸治療肌筋膜痛提供科學依據(jù)。

研究發(fā)現(xiàn)，人體肌肉損傷后會出現(xiàn)IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子分泌增多[8～11]。IL-6作為一種重要的致炎因子，可刺激炎性細胞聚集、激活，并能促進炎性介質(zhì)釋放[12]。血清IL-6水平增加可誘導COX-2高表達，使單核細胞和巨噬細胞大量合成PGE2，從而產(chǎn)生廣泛而持久的血管擴張和致痛作用，在痛覺過敏形成中具有重要作用。有研究報道，COX-2與扳機點局部病理特征和疼痛密切相關。正常情況下，機體內(nèi)COX-2水平相對恒定，但在炎癥反應過程中其水平明顯升高，繼而使單核細胞和巨噬細胞大量合成PGE2。TNF-α作為一種重要的促炎介質(zhì)，主要由單核巨噬細胞產(chǎn)生，在急性炎癥反應過程中發(fā)揮關鍵性作用[13]。IL-6、TNF-α、COX-2、PGE2等形成復雜的炎癥因子網(wǎng)絡，參與扳機點炎癥反應過程。

本研究結(jié)果顯示，模型組扳機點局部肌纖維出現(xiàn)扭曲、斷裂、溶解和壞死灶，早期出現(xiàn)大量炎性細胞浸潤；艾灸組經(jīng)艾灸干預扳機點局部肌纖維排列紊亂明顯改善，炎性細胞浸潤明顯減輕，尤其是在艾灸治療結(jié)束14天，其組織病理學表現(xiàn)已與對照組接近，但尚未完全恢復正常。本研究還發(fā)現(xiàn)，模型組各時期扳機點骨骼肌COX-2、PGE2、IL-6、TNF-α相對表達量明顯高于對照組同期，而艾灸組各時期扳機點骨骼肌COX-2、PGE2、IL-6、TNF-α相對表達量明顯低于模型組同期；艾灸組艾灸治療結(jié)束14天扳機點骨骼肌COX-2、PGE2、IL-6、TNF-α相對表達量明顯低于治療結(jié)束3天，而模型組與對照組組內(nèi)各時期扳機點骨骼肌COX-2、PGE2、IL-6、TNF-α相對表達量變化不明顯。結(jié)果表明扳機點內(nèi)存在明顯的炎癥反應，溫和灸局部干預可降低炎癥因子表達，促進局部損傷肌纖維修復。

綜上所述，溫和灸局部干預能夠促進扳機點肌纖維修復，其作用機制與降低扳機點局部炎癥細胞因子募集、減輕炎癥反應有關。