細(xì)葉韭花提取物抗氧化及抑制亞硝化反應(yīng)的研究

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006）

人體在新陳代謝中會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧，包括羥自由基、超氧陰離子自由基等[1]，這些自由基的存在會(huì)對機(jī)體組織有一定損害甚至導(dǎo)致疾病，如脂質(zhì)過氧化、動(dòng)脈粥樣硬化、心血管疾病等[2-3]。亞硝胺是一種極強(qiáng)的致癌物質(zhì)，人群中流行病學(xué)調(diào)查表明，人類某些癌癥，如胃癌、食道癌、肝癌、結(jié)腸癌和膀胱癌等的形成可能與亞硝胺有關(guān)[4]。國內(nèi)外學(xué)者通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)了很多蔬菜水果的提取液均有清除亞硝酸鹽和阻斷亞硝胺合成的作用，從而保護(hù)細(xì)胞免受N-亞硝胺的毒害[2]。許多試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)天然植物中的活性成分如黃酮[5]、多酚[6]對抗氧化、清除亞硝酸鹽、阻斷亞硝胺合成都有一定的貢獻(xiàn)。從天然植物中尋求低毒、安全的抗氧化劑以及抑制亞硝化作用的活性成分越來越受廣大學(xué)者的關(guān)注。

細(xì)葉韭（Allium tenuissimum）為百合科蔥屬多年生草本植物[7]，又叫摘麻花、麻麻花、野韭花，主要分布于中國的東北、河北、內(nèi)蒙古、山西晉北等地區(qū)[8]，其頂端花序可食用。細(xì)葉韭花具有獨(dú)特的風(fēng)味，沒有蔥蒜那種刺激性味道，常作為一種蔬菜、腌制品、調(diào)味品食用，有的還對其進(jìn)行了香精油提取以作為面食佐料[9]。此外，細(xì)葉韭花還具有降血糖、降血脂、軟化血管、防止腫瘤、補(bǔ)腎、解毒等功效[10-11]。

目前對細(xì)葉韭花的研究主要集中在其生物特性[12]、栽培保存[13]、物候觀測[14]及化學(xué)成分[15-17]等方面。關(guān)于細(xì)葉韭花抗氧化活性的研究，國內(nèi)外尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)以細(xì)葉韭花為研究對象，采用不同溶劑對細(xì)葉韭花進(jìn)行提取，測定了各提取物的總酚、總黃酮、總糖、還原糖含量以及抗氧化和抑制亞硝化反應(yīng)效果，以期為細(xì)葉韭花作為天然抗氧化劑提供科學(xué)理論依據(jù)，為細(xì)葉韭花的開發(fā)利用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

細(xì)葉韭花：購買自山西省朔州市朔城區(qū)山老漢農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)有限公司。干燥后用組織搗碎機(jī)搗碎，過80目篩，置于干燥器保存待用。

沒食子酸：天津市光復(fù)精細(xì)研究所；蘆?。褐袊称匪幤窓z定研究院；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2'-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）：美國Sigma公司；福林酚：北京索萊寶科技有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、水楊酸等其他試劑均為分析純。

BS124S電子分析天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；JYL-012九陽多功能榨汁機(jī)：九陽股份有限公司；HH-2恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；80目國家標(biāo)準(zhǔn)篩：華天篩網(wǎng)金屬制品有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；SHB-IIIA循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；UV-Probe 2550雙光束紫外光譜儀：日本島津公司。

1.2 方法

分別稱取經(jīng)干燥、過篩處理的細(xì)葉韭花5.00 g于250 mL錐形瓶中，按照1∶10（g/mL）的比例分別向其中加入水、95%乙醇、乙酸乙酯、石油醚提取2次，減壓抽濾，濃縮至浸膏，得水提取物、95%乙醇提取物、乙酸乙酯提取物、石油醚提取物，置于-4℃冰箱中保存?zhèn)溆??？偡雍繙y定采用福林酚比色法[18-19]；總黃酮含量采用硝酸鋁比色法[20]；總糖含量采用苯酚-硫酸法[21]；還原糖含量采用水楊酸法[22]?？寡趸钚酝ㄟ^測定DPPH自由基清除能力[23-24]、ABTS+自由基清除能力[25-26]、總還原力[27]來評(píng)價(jià)；體外模擬胃液條件，采用鹽酸萘乙二胺法[28-29]測定亞硝酸鹽清除能力、采用α-萘胺法[30-35]測定亞硝胺合成阻斷能力。所有抗氧化試驗(yàn)均采用VC作為陽性對照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)試驗(yàn)數(shù)據(jù)均平行測定3次，結(jié)果以x±SD表示。采用origin 8.5軟件作圖并用SPSS 18.0數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行單因素方差分析和相關(guān)性分析，P＜0.05在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性差異，P＜0.01在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 總酚、總黃酮、總糖、還原糖含量

不同溶劑提取物中總酚、總黃酮、總糖、還原糖含量如表1所示。

表1 不同溶劑提取物中總酚、總黃酮、總糖、還原糖的含量Table 1 The total phenolics content，total flavonoids content，total sugar content，reducing sugar content of different solvents extracts from Allium tenuissimum flowers mg/g

由表1可知，各提取物均可有效地提取出細(xì)葉韭花中的活性成分，但提取程度有所不同，其中水提取物中總糖和還原糖含量高于其他3種提取物，分別為（50.32±1.23）、（30.33±0.05）mg/g；95%乙醇提取物中總酚和總黃酮含量高于其他3種提取物，分別為（11.80±1.09）、（12.65±0.85）mg/g。

2.2 體外抗氧化試驗(yàn)

2.2.1 DPPH自由基清除能力

細(xì)葉韭花不同溶劑提取物對DPPH自由基的清除能力見圖1。

由圖1可知，細(xì)葉韭花各提取物濃度在0.05mg/mL～1 mg/mL范圍內(nèi)，對DPPH自由基的清除能力隨著提取物質(zhì)量濃度的增加而增大。各提取物對DPPH自由基清除能力的IC50值見表2。

圖1 細(xì)葉韭花不同溶劑提取物對DPPH自由基清除能力Fig.1 DPPH radical scavenging rate of different solvents extracts from Allium tenuissimum flowers

表2 不同溶劑提取物抗氧化活性的IC50值Table 2 IC50values of antioxidant activity from different solvents extracts

由表2可知，在測試濃度范圍內(nèi)，石油醚提取物對DPPH自由基的清除率未達(dá)到50%，水提取物、95%乙醇提取物、乙酸乙酯提取物對DPPH自由基清除能力的 IC50值分別為（0.53±0.01）、（0.57±0.02）、（0.62±0.08）mg/mL，且各提取物對DPPH自由基清除能力的差異性均達(dá)到顯著水平（P＜0.05），其中水提取物清除DPPH自由基的效果最佳。但對DPPH自由基清除能力均弱于VC。

2.2.2 ABTS+自由基清除能力

細(xì)葉韭花不同溶劑提取物對ABTS+自由基清除能力見圖2。

由圖2可以看出，各提取物對ABTS+自由基均有良好的清除能力，且與濃度呈正相關(guān)關(guān)系。由表2可知，在測試濃度范圍內(nèi)，石油醚提取物的ABTS+自由基清除率未達(dá)到50%，水提取物、95%乙醇提取物、乙酸乙酯提取物清除能力的IC50值分別為（0.60±0.04）、（0.84±0.01）、（1.09±0.02）mg/mL。對 ABTS+自由基清除能力的順序依次為：水提取物＞95%乙醇提取物＞乙酸乙酯提取物＞石油醚提取物，清除能力均弱于陽性對照VC對ABTS+自由基的清除能力。

圖2 細(xì)葉韭花不同溶劑提取物對ABTS+自由基清除能力Fig.2 ABTS+radical scavenging rate of different solvents extracts from Allium tenuissimum flowers

2.2.3 還原能力

細(xì)葉韭花不同溶劑提取物的總還原力見圖3。

圖3 細(xì)葉韭花不同溶劑提取物的總還原力Fig.3 Total reducing capacity of different solvents extracts from Allium tenuissimum flowers

相同條件下，試驗(yàn)測定了不同溶劑提取物對應(yīng)的還原力，結(jié)果用OD值表示，OD值越大，還原力越大。由圖3可知，不同溶劑提取物的還原力隨著樣品質(zhì)量濃度的增加而增大。其中水提取物的還原力最大，其次是95%乙醇提取物，石油醚提取物的還原力最小。當(dāng)濃度為5 mg/mL時(shí)，水提取物、95%乙醇提取物、乙酸乙酯提取物、石油醚提取物的OD值分別為0.77、0.70、0.68、0.56。

2.3 細(xì)葉韭花提取物抑制亞硝化作用試驗(yàn)

2.3.1 清除亞硝酸鹽能力

在模擬胃液條件下，細(xì)葉韭花各提取物對亞硝酸鹽的清除作用結(jié)果及IC50值如圖4、表3所示。由圖4可知，細(xì)葉韭花各提取物對亞硝酸鹽均有一定的清除作用，且具有劑量依賴性，對亞硝酸鹽清除能力順序由高到低為：水提取物[IC50=（2.00±0.02）mg/mL]＞95%乙醇提取物 [IC50=（3.50±0.12）mg/mL]＞乙酸乙酯提取物 [IC50=（4.00±0.08）mg/mL]＞石油醚取物 [IC50=（6.26±0.06）mg/mL]，各提取物對亞硝酸鹽的清除能力均弱于陽性對照 VC[IC50=（0.41±0.08）mg/mL]。

2.3.2 阻斷亞硝胺合成的能力試驗(yàn)

在體外模擬胃液條件下，細(xì)葉韭花各提取物對亞硝胺合成的阻斷作用結(jié)果及IC50值如圖5及表4所示。

圖4 細(xì)葉韭花不同溶劑提取物對亞硝酸鹽清除作用的影響Fig.4 Effect of concentration on nitrite-scavenging capacity of various solvents extracts from Allium tenuissimum flowers

表3 細(xì)葉韭花不同溶劑提取物和VC抑制亞硝化作用的IC50值Table 3 IC50values of inhibitory effect on nitrosation different solvents extracts from Allium tenuissimum flowers and VC

圖5 細(xì)葉韭花不同溶劑提取物對亞硝胺合成抑制能力的影響Fig.5 Effect on inhibitory N-nitrosamines formation capacity of different solvent extracts from Allium tenuissimum flowers

由圖5可知，細(xì)葉韭花各提取物均能阻斷亞硝胺的合成，且在測試濃度范圍內(nèi)，亞硝胺合成阻斷率隨著提取物質(zhì)量濃度的增加而增大，其中水提取物[IC50=（3.00±0.01）mg/mL]的阻斷能力最強(qiáng)，當(dāng)質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，其阻斷率可達(dá)90.27%，遠(yuǎn)大于其他提取物，但弱于陽性對照 VC[IC50=（2.41±0.11）mg/mL]。

2.4 相關(guān)性分析

為進(jìn)一步考察細(xì)葉韭花提取物中各活性成分與其抗氧化活性之間的關(guān)系，對不同溶劑提取物總酚含量、總黃酮含量、總糖含量、還原糖含量及其抗氧化活性間進(jìn)行相關(guān)性分析，其相關(guān)系數(shù)R2如表4所示。

表4 不同提取物各成分含量及其抗氧化能力的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis between compounds contents and antioxidant activity of different solvents extracts

總酚含量與DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力之間呈極顯著相關(guān)（R2＞0.80，P＜0.01），與總還原力之間呈顯著相關(guān)（0.50＜R2＜0.80，P＜0.05），但與亞硝酸鹽清除能力及阻斷亞硝胺合成能力的相關(guān)性不顯著（P＞0.50）；總黃酮與DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力之間呈極顯著相關(guān)（R2＞0.80，P＜0.01）；總糖與ABTS+自由基清除能力、總還原力、亞硝酸清除能力、亞硝胺合成阻斷能力之間均呈極顯著相關(guān)（R2＞0.80，P＜0.01）；還原糖與 ABTS+自由基清除能力、亞硝酸鹽清除能力、亞硝胺合成阻斷能力之間呈極顯著相關(guān)（R2＞0.80，P＜0.01），與 DPPH 自由基清除能力、總還原力之間呈顯著相關(guān)（0.50＜R2＜0.80，P＜0.05）。

3 討論

本試驗(yàn)對細(xì)葉韭花不同溶劑提取物中活性成分、體外抗氧化活性、清除亞硝酸鹽、阻斷亞硝胺合成進(jìn)行了研究。結(jié)果表明細(xì)葉韭花中具有多種活性成分，并且能夠有效地清除DPPH和ABTS+自由基，還能在模擬胃液條件下清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺的合成，對延緩衰老、預(yù)防癌癥等方面具有重要意義。

正常情況下，機(jī)體中活性氧的產(chǎn)生及清除或中和處于動(dòng)態(tài)平衡。當(dāng)機(jī)體處于疾病、有害環(huán)境時(shí)，活性氧大量產(chǎn)生，機(jī)體不能夠及時(shí)將其清除，進(jìn)而導(dǎo)致組織和細(xì)胞損傷[36-37]。Boora等[2]認(rèn)為多酚類化合物的抗氧化機(jī)制是中和脂質(zhì)自由基，防止過氧化氫分解為自由基。由本文細(xì)葉韭花提取物中各活性成分與抗氧化活性之間相關(guān)性分析可知，抗氧化活性與多酚和黃酮具有一定的相關(guān)性，這與Zhou等[38]所得結(jié)論一致。亞硝酸鹽和硝酸鹽常被添加到肉制品中用于護(hù)色、防腐、延長貨架期，但在體內(nèi)適宜的胃液環(huán)境中，易與胺類化合物反應(yīng)，產(chǎn)生有毒的N-亞硝胺，具有較強(qiáng)的致癌作用，能引起人和動(dòng)物胃、肝臟等多種臟器的惡性腫瘤。Zhan等[5]認(rèn)為黃酮類化合物、多酚類化合物可有效地清除亞硝酸鹽；鄭晶泉[37]認(rèn)為多糖可以直接捕獲脂質(zhì)過氧化過程中產(chǎn)生的活性氧，減緩或抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的進(jìn)行；李利華[39]的試驗(yàn)表明多糖具有較強(qiáng)的抗氧化能力及亞硝酸鹽清除能力。本研究首次對細(xì)葉韭花提取物清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成進(jìn)行測定，且水提取物清除亞硝酸鹽和阻斷亞硝胺合成的效果最佳，由提取物中活性成分含量和亞硝酸清除能力、亞硝胺合成阻斷能力的相關(guān)性分析可知，這是水提物中的總糖、還原糖、總酚和總黃酮共同作用的結(jié)果。這一結(jié)果將為細(xì)葉韭花的開發(fā)利用提供一定的科學(xué)理論依據(jù)。