溶血對(duì)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)血漿中兒茶酚胺及其代謝產(chǎn)物的影響

袁鳳喜， 薛雄燕， 陳彩鳳， 賴月紅， 梁泳儀，李 巖， 謝雯春， 楊紹杰， 吳燕杰

（1.順德中科優(yōu)聯(lián)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所，廣東 佛山 528000；2.佛山市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 佛山 528000；3.中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所，北京 100101）

嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤（pheochromocytoma and paraganglioma，PPGL）是分別起源于腎上腺髓質(zhì)的嗜鉻細(xì)胞和腎上腺外交感神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的腫瘤，嗜鉻細(xì)胞瘤占80%～85%，副神經(jīng)節(jié)瘤占15%～20%，二者合稱為PPGL。PPGL會(huì)分泌大量的兒茶酚胺，包括腎上腺素（epinephrine，E）、去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）和多巴胺（dopamine，DA），造成患者的血壓陣發(fā)性或持續(xù)性升高。雖然PPGL患者只占普通高血壓患者的0.2%～0.6%，但這些患者如未能及時(shí)得到針對(duì)性治療，長(zhǎng)期的高血壓可對(duì)患者的心、腦、腎等器官造成嚴(yán)重?fù)p傷，有些患者甚至?xí)l(fā)生高血壓危象，危及生命。若PPGL患者能在早期得到準(zhǔn)確、及時(shí)的診斷，通過(guò)手術(shù)切除腫瘤，高血壓可被治愈[1]。傳統(tǒng)的PPGL實(shí)驗(yàn)室檢查是檢測(cè)血或尿中的E和NE水平。有研究結(jié)果顯示，E和NE的代謝產(chǎn)物變腎上腺素（metanephrine，MN）及去甲變腎上腺素（normetanephrine，NMN）主要在腎上腺髓質(zhì)和PPGL瘤體內(nèi)持續(xù)代謝產(chǎn)生，可以成為更好的PPGL檢測(cè)標(biāo)志物[2-3]。2016年，中華醫(yī)學(xué)會(huì)內(nèi)分泌分會(huì)發(fā)布的《嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤診斷治療的專家共識(shí)》首推以血漿中游離的或尿中的MN、NMN水平來(lái)診斷PPGL，檢測(cè)血或尿中的E和NE水平也可對(duì)PPGL的診斷起輔助作用[4]。對(duì)于個(gè)別只分泌DA的PPGL可以檢測(cè)血漿或尿中的DA及其代謝產(chǎn)物3-甲氧基酪胺（3-methoxytyramine，3-MT）水平[5]。目前，臨床實(shí)驗(yàn)室用于檢測(cè)MN和NMN水平的方法有酶聯(lián)免疫法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LCMS/MS）、液相色譜電化學(xué)法，其中酶聯(lián)免疫法的敏感性相對(duì)較低[1，6]?！妒茹t細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤診斷治療的專家共識(shí)》也建議使用LCMS/MS或電化學(xué)法測(cè)定MN和NMN水平。電化學(xué)法易存在對(duì)目標(biāo)峰的干擾，LC-MS/MS敏感性高、特異性好，因此越來(lái)越多地被用于小分子代謝產(chǎn)物的檢測(cè)。測(cè)定尿中的兒茶酚胺及其代謝產(chǎn)物時(shí)需要收集患者24 h尿，耗時(shí)長(zhǎng)，患者不易配合，而收集血漿樣本的可操作性相對(duì)較強(qiáng)。因此，檢測(cè)血漿兒茶酚胺及其代謝產(chǎn)物的水平用于診斷PPGL會(huì)更簡(jiǎn)便。溶血是血液樣本采集中最常遇到的問(wèn)題，溶血樣本由于響應(yīng)低、有基質(zhì)效應(yīng)等問(wèn)題經(jīng)常會(huì)影響LC-MS/MS的測(cè)定結(jié)果[7]?！吨腥A人民共和國(guó)藥典：2015版》、歐洲藥品管理局、美國(guó)食品與藥品監(jiān)督管理局都要求關(guān)注溶血樣本的基質(zhì)效應(yīng)[8-10]。為此，本研究擬探討溶血對(duì)LC-MS/MS測(cè)定兒茶酚胺及其代謝產(chǎn)物的影響，為臨床取樣提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣本制備

1.1.1 溶血樣本制備 取肝素鋰抗凝血以4 470×g離心5 min，收集紅細(xì)胞，將紅細(xì)胞置于-80 ℃冰箱4 h后室溫融化，再以4 470×g離心10 min，取上清液，采用BC-5390CRP全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀（深圳邁瑞公司）測(cè)定血紅蛋白（hemoglobin，Hb）水平，根據(jù)Hb水平用生理鹽水配成Hb分別為75.0、30.0、15.0和7.5 g/L的溶血液。分別取上述不同Hb水平的100 μL溶血液與無(wú)肉眼可見黃疸、脂濁或溶血的900 μL正常血漿混合，制備成溶血樣本。根據(jù)Hb水平將樣本的溶血程度分為：重度溶血（7.50 g/L）、中度溶血（3.00、1.50 g/L）和輕度溶血（0.75 g/L）；另取100 μL生理鹽水加入900 μL正常血漿中，作為無(wú)溶血的正常樣本。

1.1.2 含不同水平兒茶酚胺及其代謝產(chǎn)物的樣本制備 在一定體積的溶血樣本和正常樣本中分別加入3-MT、MN、NMN、DA、E、NE標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液，制成低值和高值樣本。兒茶酚胺及其代謝產(chǎn)物加入血漿后的理論水平見表1。

表1 兒茶酚胺及其代謝產(chǎn)物加入血漿后的理論水平（pg/mL）

1.2 儀器與試劑

BC-5390CRP全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀（深圳邁瑞公司）、TSQ Endura串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）、UltiMate3000高效液相色譜儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）。甲醇（LC-MS級(jí)）、乙腈（LC-MS級(jí)）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，甲酸（LC-MS級(jí)）、異丙醇（分析純）、乙酸銨（LC-MS級(jí)）、甲酸銨（LC-MS級(jí)）及E、NE、DA、MN、NMN、3-MT標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司，氘代內(nèi)標(biāo)E-d6、NE-d6、DA-d4、MN-d3、NMN-d3、3-MT-d4購(gòu)自美國(guó)劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室。

1.3 方法

1.3.1 樣本前處理 （1）血漿樣本：取50 mmol/L醋酸銨250 μL、內(nèi)標(biāo)溶液（MN-d3、NMN-d3、3-MT-d4均為2 ng/mL，E-d6、NE-d6、DA-d4均為5 ng/mL）100 μL及高、低值樣本各200 μL，充分混勻后待用；（2）標(biāo)準(zhǔn)品溶液：取50 mmol/L醋酸銨250 μL、內(nèi)標(biāo)溶液（MN-d3、NMN-d3、3-MT-d4均為2 ng/mL，E-d6、NE-d6、DA-d4均為5 ng/mL）100 μL、兒茶酚胺（E、NE、DA均分別為156、312、625、1 250、2 500 pg/mL）或其代謝產(chǎn)物（MN、NMN、3-MT均分別為50、100、200、500、800 pg/mL）的標(biāo)準(zhǔn)品溶液200 μL，混勻待用。將Oasis弱陽(yáng)離子交換96孔固相提取板（美國(guó)Waters公司）分別用200 μL甲醇和水進(jìn)行預(yù)處理，將上述血漿或標(biāo)準(zhǔn)品樣本加入經(jīng)預(yù)處理的各孔中，待樣本加載完成后，分別用20 mmol/L醋酸銨200 μL及乙腈與異丙醇的混合液（V∶V=50∶50）清洗樣本孔，最后用2份50 μL 85%乙腈水溶液（含2%甲酸）將目標(biāo)化合物洗脫至接收板中。取10 μL洗脫液，采用LC-MS/MS檢測(cè)。每份樣本均重復(fù)3次前處理實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 色譜和質(zhì)譜條件 （1）液相色譜條件：色譜柱為Xbridge BEH Amide色譜柱（2.5 μm，2.1 mm×100 mm，美國(guó)Waters 公司），柱溫為35 ℃，流動(dòng)相A為100%含30 mmol/L甲酸銨、pH值3.0的水，流動(dòng)相B為85%乙腈及15%含30 mmol/L甲酸銨、pH值3.0的水，流速為0.4 mL/min，梯度洗脫。（2）質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正離子掃描，離子源噴霧電壓為3 600 V，離子傳輸管溫度為350 ℃，霧化溫度為330 ℃。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

計(jì)算兒茶酚胺及其代謝產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品出峰面積與內(nèi)標(biāo)出峰面積的比值，將其與標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度作線性回歸?；貧w方程見表1。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出溶血血漿以及正常血漿中3-MT、MN、NMN、DA、E、NE的水平。

表1 兒茶酚胺及其代謝產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程

2.2 不同溶血程度對(duì)高、低值3-MT、MN、NMN、DA、E、NE的影響

無(wú)論MN、NMN、3-MT是高值還是低值，除3-MT在Hb為7.50 g/L（重度溶血）時(shí)未能被檢測(cè)到外，其他不同溶血程度的樣本與正常樣本之間MN、NMN、3-MT的檢測(cè)結(jié)果差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。高值3-MT、MN、NMN 3次檢測(cè)結(jié)果的變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）均＜15%。低值3-MT在中度溶血（Hb為1.50 g/L）時(shí)、低值NMN在重度溶血（Hb為7.50 g/L）時(shí)3次檢測(cè)結(jié)果的CV均?＞15%，不符合《生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》[8]對(duì)精密度的要求。見表2～表5。

當(dāng)DA、E、NE為低值時(shí)，輕度溶血（Hb為0.75 g/L）和Hb為1.50 g/L的中度溶血樣本的檢測(cè)結(jié)果與正常樣本比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。當(dāng)DA、E、NE為高值時(shí)，輕度溶血樣本（Hb為0.75 g/L）和Hb為1.50 g/L的中度溶血樣本的DA、NE檢測(cè)結(jié)果與正常樣本比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而E的檢測(cè)結(jié)果在Hb為1.50 g/L的中度溶血樣本中明顯降低（P＜0.05）。對(duì)于Hb為3.00 g/L的中度溶血樣本，無(wú)論DA、E、NE是高值還是低值均無(wú)法檢出。高、低值DA、E、NE在Hb≤1.50 g/L時(shí)3次檢測(cè)結(jié)果的CV均＜15%。見表2～表5。

表2 不同溶血程度樣本低值3-MT、MN、NMN、DA、E、NE的檢測(cè)結(jié)果 （x±s）

表3 不同溶血程度樣本低值3-MT、MN、NMN、DA、E、NE 3次檢測(cè)結(jié)果的CV （%）

表4 不同溶血程度樣本高值3-MT、MN、NMN、DA、E、NE的檢測(cè)結(jié)果 （x±s）

表5 不同溶血程度樣本高值3-MT、MN、NMN、DA、E、NE 3次檢測(cè)結(jié)果的CV （%）

3 討論

溶血樣本是臨床實(shí)驗(yàn)室日常工作中最易遇到的問(wèn)題樣本。造成樣本溶血的原因有很多：抽血時(shí)操作不當(dāng)、對(duì)樣本的劇烈振蕩、突然冷凍等。溶血造成檢測(cè)結(jié)果異常的原因主要有：（1）血細(xì)胞破裂后，細(xì)胞內(nèi)的成分如鉀、磷、酶類等進(jìn)入血清或血漿，直接造成檢測(cè)結(jié)果異常；（2）Hb會(huì)對(duì)采用比色法的部分檢測(cè)項(xiàng)目存在干擾；（3）紅細(xì)胞釋放的過(guò)氧化物酶、腺苷酸激酶等對(duì)一些檢測(cè)項(xiàng)目存在干擾。本研究結(jié)果表明溶血對(duì)LC-MS/MS檢測(cè)兒茶酚胺及其代謝產(chǎn)物的最大影響在于待測(cè)物的質(zhì)譜信號(hào)被強(qiáng)烈抑制，這可能有2個(gè)原因：（1）Hb對(duì)待測(cè)物有一定的吸附作用；（2）盡管對(duì)樣本進(jìn)行前處理可去除血漿中的大分子，但在中度溶血和重度溶血的樣本中，Hb水平過(guò)高，可能已超出固相萃取板的處理能力，因此樣本中仍有大量Hb未被除去，進(jìn)入質(zhì)譜儀后，干擾了待測(cè)物的信號(hào)。另外，溶血對(duì)兒茶酚胺代謝產(chǎn)物的影響要遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于對(duì)兒茶酚胺的影響，這可能與兒茶酚胺代謝產(chǎn)物比較穩(wěn)定，質(zhì)譜信號(hào)相對(duì)較強(qiáng)有關(guān)。總之，中度和重度溶血會(huì)對(duì)LC-MS/MS檢測(cè)兒茶酚胺及其代謝產(chǎn)物產(chǎn)生明顯影響。

有研究結(jié)果顯示，通過(guò)優(yōu)化檢測(cè)方法、增強(qiáng)抗干擾能力、提升檢測(cè)敏感性，可消除溶血對(duì)LC-MS/MS檢測(cè)結(jié)果的影響。（1）溶血樣本中有干擾峰，可優(yōu)化色譜條件，如流動(dòng)相、色譜柱、洗脫梯度等，使待測(cè)物與基質(zhì)分離[11]；HUGHES等[7]在檢測(cè)血漿中的阿托伐他汀時(shí)，通過(guò)優(yōu)化流動(dòng)相中有機(jī)相和水相的比例，消除溶血樣本中的干擾峰對(duì)內(nèi)標(biāo)物的影響。（2）溶血樣本中待測(cè)物信號(hào)受到抑制，一方面可優(yōu)化樣本前處理過(guò)程，盡可能去除溶血產(chǎn)生的雜質(zhì)，HUGHES等[7]通過(guò)在固相萃取處理前先進(jìn)行蛋白沉淀，并在固相萃取處理時(shí)多進(jìn)行一步酸洗，成功消除了溶血對(duì)卡維地洛定量分析的影響；另一方面也可優(yōu)化離子源種類和質(zhì)譜參數(shù)，提高敏感性；一般情況下，LC-MS/MS常用的離子源克服基質(zhì)效應(yīng)的能力依次為大氣壓光噴霧電離源、大氣壓化學(xué)電離源、電噴霧電離源[12]；（3）溶血樣本和非溶血樣本間的差異較大，可選用合適的內(nèi)標(biāo)。與結(jié)構(gòu)類似物作為內(nèi)標(biāo)相比，同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)可更加準(zhǔn)確地修正基質(zhì)效應(yīng)對(duì)結(jié)果的影響，因此應(yīng)盡可能使用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)以消除基質(zhì)效應(yīng)的影響[7-8，13]。

綜上所述，由于肉眼不易判斷出溶血的程度，且樣本溶血程度的判斷標(biāo)準(zhǔn)尚未統(tǒng)一[14]，為了保證兒茶酚胺及其代謝產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，在日常檢測(cè)的樣本采集過(guò)程中應(yīng)盡量避免溶血，優(yōu)化檢測(cè)方法可消除溶血對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。