7種國產(chǎn)沙眼衣原體核酸檢測試劑的平行比較

陳 凱， 韓 燕， 尹躍平， 鐘銘英， 朱邦勇， 施美琴

[1. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病醫(yī)院（研究所）中國疾病預(yù)防控制中心性病控制中心參比實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210042；2. 廣西壯族自治區(qū)皮膚病防治研究所，廣西 南寧 530003]

沙眼衣原體引起的泌尿生殖道感染是全球范圍內(nèi)最為常見的性傳播疾病之一。2008年，世界衛(wèi)生組織估計(jì)每年新發(fā)感染的病例達(dá)1.3億例[1]，沙眼依原體感染可導(dǎo)致尿道炎、子宮頸炎或盆腔炎等。如果感染者未能得到及時(shí)的診治，會(huì)導(dǎo)致沙眼衣原體持續(xù)傳播并可能引起繼發(fā)的后遺癥，如盆腔炎、異位妊娠，甚至不孕癥。近70%的女性和50%的男性泌尿生殖道感染沙眼衣原體后臨床癥狀隱匿[2]，且與其他感染引起的癥狀相似，臨床醫(yī)生對(duì)沙眼衣原體感染的明確診斷主要依據(jù)實(shí)驗(yàn)室的病原學(xué)檢測結(jié)果。目前，臨床診斷沙眼衣原體感染的方法主要包括：膠體金免疫層析法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、培養(yǎng)法和核酸檢測法等，其中核酸檢測法在美國、歐洲等發(fā)達(dá)地區(qū)已經(jīng)被推薦為沙眼衣原體檢測的首選方法[2-3]。

目前，美國食品藥品監(jiān)督管理局共批準(zhǔn)5家公司的商品化試劑用于泌尿生殖道沙眼衣原體感染的診斷。截至2018年6月，中國食品藥品監(jiān)督管理局已批準(zhǔn)28家單位生產(chǎn)沙眼衣原體的核酸診斷試劑，共29種產(chǎn)品。29種產(chǎn)品中采用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）-熒光探針法的27種，采用PCR-膜雜交法的1種，采用RNA恒溫?cái)U(kuò)增法的1種。此外，我國許多實(shí)驗(yàn)室也正在積極研制沙眼衣原體核酸檢測的方法[4]。我國利用核酸試劑診斷泌尿生殖道沙眼衣原體感染的醫(yī)療機(jī)構(gòu)數(shù)量正逐年增加，但尚無關(guān)于市售核酸檢測試劑質(zhì)量的報(bào)道。本研究采用臨床樣本對(duì)我國市售的部分使用頻率較高的沙眼衣原體核酸檢測試劑進(jìn)行小樣本的平行評(píng)估，為臨床選擇沙眼衣原體核酸診斷試劑提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

收集2016年10—12月在廣西壯族自治區(qū)玉林市皮膚病研究所性病門診就診的患者101例，其中男16例，女85例。采集每例患者2份拭子樣本，1份用于當(dāng)?shù)氐臋z測，1份保存在-80℃冰箱，通過冷鏈方式運(yùn)送至中國疾病預(yù)防控制中心性病控制中心參比實(shí)驗(yàn)室。本研究經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院（研究所）醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過。

1.2 參評(píng)試劑

我國目前共批準(zhǔn)沙眼衣原體核酸診斷試劑29種，結(jié)合2013—2017年全國沙眼衣原體檢測質(zhì)間質(zhì)評(píng)反饋信息，最終選擇國內(nèi)使用頻率較高、能夠應(yīng)用LightCycler 480熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增檢測的7種核酸試劑，分別標(biāo)為A、B、C、D、E、F、G試劑。

1.3 方法

1.3.1 定量樣本處理 （1）定量樣本制備。定量樣本為實(shí)驗(yàn)室自制，由9例樣本組成，其中陽性樣本8例、陰性樣本1例。陰性樣本選用McCoy葡萄糖細(xì)胞保存液。陽性質(zhì)控樣本的制備按照以下步驟進(jìn)行：采用細(xì)胞培養(yǎng)法對(duì)沙眼衣原體參考菌株（E-Bour）進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。培養(yǎng)物經(jīng)裂解混勻后采用G試劑進(jìn)行定量及均一性檢測。根據(jù)上述結(jié)果，將沙眼衣原體裂解后，純培養(yǎng)物利用G試劑進(jìn)行定量，測定的濃度為5.0×108，吸取20 μL純培養(yǎng)物，用80 μL保存液進(jìn)行稀釋，混勻后進(jìn)行10倍等比例稀釋，共計(jì)8個(gè)濃度，稀釋后的純培養(yǎng)物再利用達(dá)安試劑進(jìn)行定量檢測，以測定每個(gè)稀釋濃度下的純培養(yǎng)物濃度：101拷貝/mL～108拷貝/mL；分別將50 μL上述梯度稀釋的菌懸液滴加在拭子的纖維部位，置于37℃恒溫孵箱中干燥4 h，取出后置于 4℃冰箱備用。（2）定量樣本處理。所有定量樣本的DNA提取和擴(kuò)增試驗(yàn)均按照各試劑說明書的要求進(jìn)行。根據(jù)試劑說明書檢測結(jié)果的解釋對(duì)檢測結(jié)果進(jìn)行陰性、陽性的判定。利用定量試劑對(duì)10個(gè)同一濃度的弱陽性質(zhì)控（104拷貝 / mL）進(jìn)行重復(fù)性檢測，將檢測所得的循環(huán)時(shí)間帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線后計(jì)算濃度，然后根據(jù)計(jì)算所得的濃度計(jì)算離散系數(shù)。

1.3.2 臨床樣本處理 （1）DNA提取。用生理鹽水洗脫所有臨床拭子樣本。采用Qiagen公司生產(chǎn)的QIAxtractor全自動(dòng)核酸純化儀提取DNA，實(shí)驗(yàn)操作按照說明書進(jìn)行，每例樣本獲得200 μL DNA液，平均分為2份，保存于1.5 mL的凍存管中，放置于-20℃冰箱待用。（2）核酸擴(kuò)增檢測。按照試劑說明書對(duì)101例臨床拭子樣本的DNA提取液進(jìn)行核酸的擴(kuò)增檢測。根據(jù)試劑說明書對(duì)檢測結(jié)果進(jìn)行陰性、陽性的判定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

比較各試劑對(duì)質(zhì)控品結(jié)果的吻合度，選擇吻合度最高的試劑作為此次試劑平行比較的參考試劑，計(jì)算各種不同檢測方法的特異性、靈敏性、“參考試劑”之間的一致性。采用McNemar χ2檢驗(yàn)比較不同試劑對(duì)臨床樣本的檢測性能，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各試劑基本情況比較

試劑擴(kuò)增檢測的時(shí)間為2～3 h，但C試劑擴(kuò)增步驟較其他檢測試劑繁瑣，需要在PCR反應(yīng)管中先加入核酸釋放劑及待測樣本后，再加入PCR混合液，然后離心。適宜樣本：7種試劑適用的樣本均為宮頸拭子和尿道拭子，未提及無創(chuàng)傷性樣本（尿液樣本）。擴(kuò)增方法均以Taq酶水解熒光探針作為檢測探針。見表1。

表1 各試劑的基本情況比較[2]

2.2 定量樣本檢測結(jié)果

對(duì)照7種試劑的說明書進(jìn)行陰性、陽性的判斷，所有試劑對(duì)9例樣本的檢測結(jié)果見表2。其中A試劑和B試劑在檢測濃度為101拷貝/mL的樣本時(shí)未能計(jì)算出Ct值；A試劑在檢測＜102拷貝/mL的樣本時(shí)、F試劑在檢測＜103拷貝/mL的樣本時(shí)、B試劑在檢測＜104拷貝/mL的樣本時(shí)Ct值超過了其陽性的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照說明書的給出的檢測限，F(xiàn)試劑和B試劑檢測定量樣本并未達(dá)到其說明書所給出的檢測限。C試劑和F試劑檢測陰性樣本時(shí)能夠計(jì)算出Ct值，這2種試劑檢測陰性樣本時(shí)熒光定量曲線有翹尾，見圖1。對(duì)3種定量核酸試劑104拷貝/mL的樣本（含樣本處理過程）重復(fù)檢測10次后，C試劑、G試劑和F試劑的均數(shù)及變異系數(shù)分別是6.26×103拷貝/mL、3.56%，2.91×104拷貝/mL、1.46%和5.04×104拷貝/mL、2.60%。

綜合各檢測試劑對(duì)不同濃度定量樣本及定量試劑檢測的變異系數(shù)，最終擬選擇2種定性試劑（E試劑，D試劑）作為參考試劑。

表2 7種國產(chǎn)核酸檢測試劑檢測定量樣本的Ct值比較

圖1 G試劑、F試劑檢測陰性樣本熒光定量曲線

2.3 臨床樣本的檢測結(jié)果

E試劑和D試劑檢測101例臨床樣本的結(jié)果一致（18例陽性，83例陰性），其余5種試劑共有7例臨床樣本檢測結(jié)果與參考試劑不一致。其中450100-007、450100-055、450100-110及450100-194號(hào)樣本僅有1種試劑檢測出陽性，450100-003和450100-150號(hào)樣本有2種試劑出現(xiàn)了漏檢，見表3。5種核酸試劑與參考試劑檢測比較結(jié)果見表4。各試劑與參考試劑的性能差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（A試劑和G試劑與參考試劑比較χ2=0.00，P=1.000；C試劑與參考試劑比較χ2=0.00，P=1.000；F試劑與參考試劑比較χ2=0.25，P=0.617；B試劑與參考試劑比較χ2=0.50，P=0.479。

表3 7種核酸試劑與參考試劑檢測結(jié)果比較

表4 5種核酸試劑與參考試劑檢測結(jié)果的比較

3 討論

本研究對(duì)我國目前常用的沙眼衣原體核酸檢測試劑的檢測結(jié)果進(jìn)行了平行比較。結(jié)果顯示：F試劑和B試劑在對(duì)定量樣本和臨床DNA樣本的檢測性能均較其他試劑的性能低，A試劑在檢測定量樣本時(shí)對(duì)低濃度樣本（101拷貝/mL）未能檢測出，E試劑和D試劑因?qū)|(zhì)控品檢測的性能較好被選為參考試劑，對(duì)臨床樣檢測的結(jié)果與其他半數(shù)以上的核酸試劑檢測結(jié)果一致，另外5種核酸試劑與參考試劑檢測結(jié)果比較后，敏感性為88.89%～100%，特異性為97.59%～100%，各試劑與參考試劑的檢測敏感性有一定的差異，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究評(píng)估的7種國產(chǎn)核酸試劑的特異性與趙廣錄等[6]報(bào)道的2種核酸試劑的特異性類似，均能達(dá)到95%以上，這與美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的5種沙眼衣原體核酸檢測試劑的特異性相當(dāng)[7-9]。但是國產(chǎn)核酸試劑中部分試劑的敏感性尚未達(dá)到90%，與趙廣錄等[6]結(jié)果相似，因此這些試劑的生產(chǎn)廠商需要進(jìn)一步提升產(chǎn)品敏感性。

生殖道沙眼衣原體感染可以通過檢測泌尿生殖道脫落的上皮細(xì)胞加以明確。脫落的上皮細(xì)胞不僅可以通過拭子采集，還可以通過尿液樣本檢測，檢測尿液樣本可以促進(jìn)對(duì)無癥狀患者的篩查，同時(shí)還可以降低采集的成本[11]。此外也可進(jìn)行多種試劑的平行評(píng)估。但此次參評(píng)的7種核酸檢測試劑均僅適用于男性尿道拭子和女性宮頸拭子樣本。因此檢測該類試劑在今后的研發(fā)中應(yīng)關(guān)注對(duì)無創(chuàng)性樣本的檢測。

本研究選用了尿道和宮頸拭子的DNA樣本，對(duì)同一例樣本的DNA進(jìn)行擴(kuò)增性能比較，是對(duì)沙眼衣原體核酸檢測試劑擴(kuò)增的效果進(jìn)行的一次探索性評(píng)估，評(píng)估核酸檢測試劑擴(kuò)增的性能及使用的可接受性。為了平行比較多種核酸檢測試劑的性能，本研究選用了國際認(rèn)可的核酸提取試劑QIAxtractor全自動(dòng)核酸純化儀對(duì)樣本的DNA進(jìn)行了提取[12]，節(jié)省了對(duì)臨床樣本的需求。但不可否認(rèn)的是，這種評(píng)估方式忽略了對(duì)核酸試劑中DNA提取的評(píng)估。此外，因無法使用部分試劑的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，沒有分析試劑本身對(duì)陰性樣本的質(zhì)控結(jié)果。

判讀實(shí)時(shí)PCR的檢測結(jié)果最為關(guān)鍵的是閾值的設(shè)定，閾值的設(shè)定通常是3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。7種國產(chǎn)試劑多數(shù)的閾值設(shè)定能夠?qū)㈥幮再|(zhì)控樣本和陽性樣本區(qū)分開，C試劑和F試劑檢測陰性質(zhì)控樣本時(shí)熒光定量曲線出現(xiàn)翹尾，與低濃度樣本質(zhì)控樣本的曲線較為接近，對(duì)于閾值設(shè)定較難，這對(duì)于后期結(jié)果的判斷有很大的影響。

本研究中7種核酸試劑質(zhì)控品均含有陰性質(zhì)控、陽性質(zhì)控或臨界質(zhì)控，但多數(shù)缺乏可以對(duì)核酸提取及擴(kuò)增進(jìn)行全程質(zhì)控的內(nèi)部參照物，因此無法確保所有的樣本均能夠進(jìn)行有效的提取和擴(kuò)增。此外還需要對(duì)其陰性質(zhì)控品進(jìn)行更深層的評(píng)估，多數(shù)試劑選用生理鹽水作為質(zhì)控品，生理鹽水能夠保證樣本在核酸提取和擴(kuò)增過程中不被污染，但是由于缺乏內(nèi)部參照物，難以評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)對(duì)臨床樣本的干擾，從而排除假陽性。

由于國外已有關(guān)于質(zhì)粒缺失的新型變種沙眼衣原體的報(bào)道[13]，建議我國核酸檢測試劑中增加對(duì)新型變種沙眼衣原體的檢測。本次平行比較所涉及的檢測試劑均只能夠檢測沙眼衣原體，而核酸檢測大的趨勢是在同一個(gè)檢測中實(shí)現(xiàn)對(duì)多種病原體的檢測。

綜上所述，我國目前常用的國產(chǎn)沙眼衣原體核酸試劑的特異性較高，但是部分品牌試劑的敏感性有待進(jìn)一步提高。部分品牌試劑的質(zhì)控品應(yīng)增加能夠全程控制的內(nèi)部參照物。在試劑的應(yīng)用范圍上也應(yīng)擴(kuò)展至對(duì)無創(chuàng)傷性樣本的檢測，從而更好地應(yīng)用于無癥狀患者的篩查。此外，國外多數(shù)核酸試劑已經(jīng)實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化，減少了污染的概率，更利于在大型醫(yī)院及流行病學(xué)現(xiàn)場進(jìn)行檢測。mRNA能夠更好地反映感染的狀態(tài)，對(duì)臨床隨訪，判斷預(yù)后有重要的意義，國內(nèi)的試劑生產(chǎn)廠商可以在這方面作出努力。