微量稀釋法檢測(cè)男性不育患者脲原體的耐藥性分析

周運(yùn)恒， 石曉星， 楊 陽(yáng)， 顧偉鳴， 馬紅霞

（1. 武警上海市總隊(duì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 201103；2. 上海市皮膚病醫(yī)院，上海 200443；3. 上海市東方醫(yī)院健康醫(yī)學(xué)管理部，上海 200120）

脲原體為條件致病病原體，可黏附于泌尿生殖道的黏膜及上皮細(xì)胞，是引起泌尿生殖道感染和男性不育的主要病原體[1]。脲原體屬在健康生育人群中也有一定的檢出率，但作為評(píng)價(jià)精液質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)，有很多醫(yī)療機(jī)構(gòu)尚未開展此項(xiàng)檢測(cè)，臨床上還未足夠重視[2]。多數(shù)患者感染癥狀輕微或無癥狀，常常反復(fù)發(fā)作，同時(shí)，不規(guī)范的治療和盲目用藥，導(dǎo)致耐藥菌株不斷增加。

在耐藥性檢測(cè)方面，我國(guó)絕大多數(shù)臨床實(shí)驗(yàn)室使用的商品化試劑盒只能將藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果定性為敏感、中介和耐藥3種情況，目前尚無藥物敏感性試驗(yàn)質(zhì)控品和統(tǒng)一的判定標(biāo)準(zhǔn)，同一患者樣本采用不同試劑檢測(cè)結(jié)果差異較大。微量肉湯培養(yǎng)法是檢測(cè)脲原體藥物敏感性的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但國(guó)內(nèi)外只有少數(shù)醫(yī)療機(jī)構(gòu)開展，其耐藥折點(diǎn)多參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）關(guān)于革蘭陽(yáng)性菌的折點(diǎn)，或借助標(biāo)準(zhǔn)敏感株最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）判斷[3-5]，一直以來沒有一個(gè)公認(rèn)的、標(biāo)準(zhǔn)的參考方法。目前尚未發(fā)現(xiàn)男性不育患者脲原體的定量藥物敏感性試驗(yàn)的報(bào)道。定量藥物敏感性試驗(yàn)需要先分離、純化菌株，因鑒定、純化、傳代條件要求較高，脲原體屬抵抗力差，在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)迅速、容易死亡，一定程度上限制了藥物敏感性試驗(yàn)的研究和臨床應(yīng)用[6]。2011年，來自美國(guó)、法國(guó)和加拿大3個(gè)國(guó)家的10個(gè)參比實(shí)驗(yàn)室，規(guī)范了CLSI微量稀釋法和瓊脂稀釋法的操作指南和耐藥折點(diǎn)，但其質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)還有待其他國(guó)家和地區(qū)的進(jìn)一步驗(yàn)證[7-8]。

1 材料和方法

1.1 樣本收集

采集2013年武警上海市總隊(duì)醫(yī)院就診的男性不育患者精液樣本，接種于固體選擇性培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基（河北眾愛生生物有限公司），在37°C孵箱內(nèi)培養(yǎng)48～72 h。通過液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基聯(lián)合判斷。在顯微鏡下觀察，以典型的脲原體屬菌落（“海膽型”等）作為陽(yáng)性的確診標(biāo)準(zhǔn)，形態(tài)學(xué)檢查可疑時(shí)可以延長(zhǎng)培養(yǎng)至72 h再觀察。

1.2 脲原體屬菌株的分離、純化、鑒定和凍存

排除脲原體屬合并人型支原體、真菌和淋球菌混合感染樣本，收集單純脲原體屬陽(yáng)性的樣本。在顯微鏡下挑選固體培養(yǎng)基上的單個(gè)脲原體屬菌落，標(biāo)記后用無菌小刀切取該處瓊脂塊，移入液體培養(yǎng)基中37°C孵育18～24 h或24～48 h，待顏色變?yōu)榈凵蛱壹t色時(shí)，用液體培養(yǎng)基稀釋10-3和10-4，取0.1 mL接種于固體瓊脂，使其成單個(gè)菌落生長(zhǎng)，再將單個(gè)菌落切下，置于液體培養(yǎng)基內(nèi)令其生長(zhǎng)。如此反復(fù)純化2～3次，即得到支原體純種，分裝并保存于-80°C冰箱。

1.3 微量稀釋法測(cè)定脲原體屬菌株的耐藥性

1.3.1 藥物配置 按照CLSI M43-A指南配置藥物濃度，初濃度為1 024 μg/mL。選取3類共12種抗菌藥物，分別是四環(huán)素類：四環(huán)素、米諾環(huán)素、多西環(huán)素；喹諾酮類：環(huán)丙沙星、莫西沙星、左氧氟沙星、安妥沙星；大環(huán)內(nèi)酯類：紅霉素、羅紅霉素、交沙霉素、克拉霉素、阿奇霉素，所有藥物由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。用乙醇或水以及相應(yīng)的稀釋劑稀釋藥物，終濃度分別為：64、32、16、8、4、5、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03和0.015 μg/mL。采用試管法倍比稀釋藥物，然后按照終濃度加至96孔微量板，每孔20 μL，置于生物安全柜內(nèi)過夜干燥，次日采用紫外燈消毒后放置于冰箱備用。

1.3.2 菌落計(jì)數(shù) 從菌株庫(kù)中隨機(jī)選取64株分離自男性不育患者精液樣本的脲原體屬菌株，測(cè)定菌株濃度。取1份菌株解凍，將培養(yǎng)液每管0.9 mL分裝，加入對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性菌液0.1 mL，混勻后吸取0.l mL至第2管，依此順序作10倍遞增稀釋4次，得到10-1、10-2、10-3和10-44個(gè)濃度的菌液，各取20 μL置于固體培養(yǎng)基，37℃孵育24～48 h，在顯微鏡下進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.3.3 MIC測(cè)定 用10B肉湯液體培養(yǎng)基稀釋至104～105菌落形成單位（colony-forming unit，CFU）/mL，按藥物濃度梯度在96孔聚苯乙烯微量板第1～12孔逐孔加入待測(cè)菌液200 μg/mL。并設(shè)溶劑對(duì)照、培養(yǎng)基陰性對(duì)照、抗菌藥物陰性對(duì)照和生長(zhǎng)陽(yáng)性對(duì)照。同一菌株重復(fù)檢測(cè)2次，取平均值。解脲脲原體標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC 33175）（河北眾愛生公司）也按上述方法加樣作為質(zhì)控參照，每孔滴入1滴石蠟油，并加蓋密封，一定濕度下置37°C培養(yǎng)16～24 h后觀察結(jié)果。分別測(cè)定各菌株對(duì)12種抗菌藥物的MIC，即當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照孔的顏色首先發(fā)生改變時(shí)，能抑制支原體生長(zhǎng)（出現(xiàn)顏色改變）的MIC。按照2011年CLSI M43-A文件[7]統(tǒng)計(jì)各種抗菌藥物的MIC范圍、MIC50和MIC90。CLSI規(guī)定的4種抗菌藥物。耐藥折點(diǎn)見表1。

表1 CLSI規(guī)定的4種抗菌藥物的耐藥折點(diǎn)

羅紅霉素、克拉霉素、交沙霉素等其他抗菌藥物的耐藥折點(diǎn)為[9-12]：米諾環(huán)素S≤1，R≥4；克拉霉素S≤1，R≥4；羅紅霉素S≤1，R≥4；交沙霉素S≤2，R≥8；環(huán)丙沙星S≤1，R≥2；安妥沙星S≤2，R≥8。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)控結(jié)果

陰性對(duì)照、抗菌藥物對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果均無異常，解脲脲原體質(zhì)控菌株（ATCC 33175）MIC均在要求的范圍內(nèi)，說明改良的微量肉湯稀釋法檢測(cè)脲原體屬的MIC有效。見表2。

表2 脲原體質(zhì)控菌株（ATCC 33175）測(cè)定結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)要求 （μg/mL）

2.2 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

脲原體屬對(duì)3類12種抗菌藥物的MIC范圍分布均較為廣泛，其中紅霉素、阿奇霉素為0.03～16 μg/mL，羅紅霉素為0.06～16 μg/mL，克拉霉素、交沙霉素為0.015～8 μg/mL；左氧氟沙星和環(huán)丙沙星為0.5～64 μg/mL，莫西沙星為0.06～16 μg/mL，安妥沙星為1～64 μg/mL；四環(huán)素為0.015～4 μg/mL，多西環(huán)素為0.015～2 μg/mL，米諾環(huán)素為0.015～8 μg/mL。見表3。

表3 64株脲原體屬菌株對(duì)12種抗菌藥物的MIC （μg/mL）

在12種抗菌藥物中，脲原體屬對(duì)環(huán)丙沙星的MIC50和MIC90最高，分別為16.00和64.00 μg/mL，對(duì)多西環(huán)素的MIC50和MIC90最低，分別為0.125和0.50 μg/mL。在喹諾酮類抗菌藥物中，MIC50和MIC90最低的是莫西沙星，分別為1.00和4.00 μg/mL；在大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物中，MIC50和MIC90最低的是克拉霉素和交沙霉素，均為0.25和1.00 μg/mL；在四環(huán)素類抗菌藥物中，對(duì)四環(huán)素和米諾環(huán)素的MIC50和MIC90均分別為0.50和1.00 μg/mL。耐藥率最高的前3種抗菌藥物分別為環(huán)丙沙星（92.2%）、左氧氟沙星（70.3%）、安妥沙星（64.0%）；耐藥率最低的3種藥物分別為阿奇霉素（0.0%）、交沙霉素（1.6%）和多西環(huán)素（3.1%）。見表4。

表4 64株脲原體菌株藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

按照CLSI M43-A文件已經(jīng)有的折點(diǎn)判斷，脲原體屬對(duì)紅霉素、阿奇霉素、左氧氟沙星、莫西沙星、四環(huán)素和多西環(huán)素的耐藥率分別為9.4%、0%、70.3%、20.3%、9.4%和3.1%。根據(jù)文獻(xiàn)[9-12]報(bào)道的折點(diǎn)判斷，脲原體屬對(duì)羅紅霉素、克拉霉素、交沙霉素、環(huán)丙沙星、安妥沙星和米諾環(huán)素的耐藥率分別為37.5%、6.3%、1.6%、92.2%、64.0%和6.3%。

3 討論

支原體由于無細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，對(duì)青霉素及頭孢菌素天然耐藥，而對(duì)干擾蛋白質(zhì)合成及DNA復(fù)制的藥物敏感。臨床上用于脲原體屬感染治療的抗菌藥物主要有四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類和喹諾酮類3類。結(jié)合臨床實(shí)際，我們選擇了12種常用抗菌藥物來檢測(cè)脲原體的耐藥性。在進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)的過程中，我們參照文獻(xiàn)對(duì)傳統(tǒng)微量肉湯培養(yǎng)法作了一些改進(jìn)，采用試管法，先將抗菌藥物倍比稀釋后再加樣至96孔微量板，過夜干燥，紫外燈消毒后放置冰箱備用，與微量板孔內(nèi)稀釋相比，可以減少操作難度，增加抗菌藥物濃度稀釋的準(zhǔn)確性，從質(zhì)控菌株MIC分布結(jié)果看，改良的MIC微量肉湯稀釋法結(jié)果穩(wěn)定。

本研究結(jié)果顯示男性不育患者脲原體屬對(duì)12種抗菌藥物的MIC范圍分布均較廣，脲原體屬對(duì)環(huán)丙沙星的MIC50和MIC90最高，耐藥率為92.2%，對(duì)多西環(huán)素的MIC50和MIC90最低，耐藥率為3.1%。在喹諾酮類抗菌藥物中，MIC最低的是莫西沙星，耐藥率為20.3%；在大環(huán)內(nèi)酯類中，MIC最低的是克拉霉素和交沙霉素，耐藥率分別為6.3%和1.6%；在四環(huán)素類抗菌藥物中，對(duì)四環(huán)素和米諾環(huán)素耐藥率分別為9.4%和6.3%。耐藥率最高的前3種抗菌藥物分別為環(huán)丙沙星（92.2%）、左氧氟沙星（70.3%）、安妥沙星（64.0%）；耐藥率最低的3種藥物分別為阿奇霉素（0%）、交沙霉素（1.6%）和多西環(huán)素（3.1%）。

近年來，國(guó)內(nèi)外關(guān)于脲原體屬的定量藥物敏感性試驗(yàn)的結(jié)果差異較大。KRAUSSE等[4]于2010年報(bào)道了過去20年分離的179株脲原體屬對(duì)四環(huán)素的MIC50和MIC90分別為1和2 μg/mL，耐藥率為3%；對(duì)環(huán)丙沙星的MIC50和MIC90分別為2和4 μg/mL，耐藥率為16.2%，對(duì)多西環(huán)素、克拉霉素和交沙霉素的耐藥率均＜5%。LU等[13]2010年發(fā)現(xiàn)脲原體對(duì)紅霉素、克拉霉素、阿奇霉素和克林霉素的MIC90均為128 μg/mL，只有28%（MIC≤8 μg/mL）的菌株對(duì)這4種抗菌藥物全部敏感。劉楊等[5]2007年報(bào)道克拉霉素體外抗菌活性最大，MIC50和MIC90分別為0.125和0.25 μg/mL。FERNáNDEZ等[14]發(fā)現(xiàn)脲原體對(duì)左氧氟沙星的耐藥率在6%左右，脲原體屬的2個(gè)生物學(xué)分群UPA群和UUR群對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥率分別為27.2%和68.8%（MIC≥4 μg/mL）。本研究中脲原體對(duì)于喹諾酮類的耐藥率明顯高于其他報(bào)道，這些差異可能是由于耐藥折點(diǎn)、不同生物群、人群地區(qū)分布、用藥習(xí)慣、生物膜等耐藥機(jī)制的差異導(dǎo)致的[15-16]。

本研究發(fā)現(xiàn)對(duì)脲原體屬耐藥率最高的是喹諾酮類，阿奇霉素、交沙霉素和多西環(huán)素可作為男性不育患者治療脲原體屬感染的首選藥物。目前CLSI對(duì)脲原體僅有5種抗菌藥物的折點(diǎn)，其他藥物的折點(diǎn)還需進(jìn)一步完善；另外MIC檢測(cè)的影響因素較多，增菌肉湯成分、菌落計(jì)數(shù)、結(jié)果顏色判斷等操作還缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。因此，研究精液樣本脲原體耐藥性檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化方案，為不同實(shí)驗(yàn)室之間檢驗(yàn)結(jié)果的互認(rèn)提供重要依據(jù)，對(duì)反復(fù)感染和耐藥性較高的疑難菌株進(jìn)行個(gè)體化治療和精準(zhǔn)醫(yī)療更有臨床指導(dǎo)意義。