血管性癡呆大鼠模型的研究進(jìn)展

劉偉，胡鵬，馮波

(1. 濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，濱州 256603； 2. 濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院脊柱外科，濱州 256603)

血管性癡呆(vascular dementia，VaD)是由于腦血管病危險(xiǎn)因素或腦血管病變引起的認(rèn)知功能損害[1]。血管性癡呆的病理改變可能與腦血流量不足導(dǎo)致的腦血管屏障受損、神經(jīng)炎性反應(yīng)、神經(jīng)元損傷及彌漫性白質(zhì)改變包括髓鞘丟失、軸突異常等有關(guān)[2-3]。VaD目前已成為導(dǎo)致癡呆的第二大病因，僅次于阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease， AD)[2]。VaD可以得到有效的預(yù)防，延緩癡呆的進(jìn)展過程。因此積極防治VaD以及研究有效藥物顯得尤為重要，諸多實(shí)驗(yàn)者將設(shè)計(jì)理想的動(dòng)物模型視為研究VaD治療的第一步。本文將對(duì)VaD大鼠模型制作方法進(jìn)行闡述。

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇及注意事項(xiàng)

動(dòng)物模型的選擇應(yīng)該盡量滿足以下幾個(gè)條件：1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦血管解剖特點(diǎn)與人類相似；2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物易獲得、易飼養(yǎng)管理；3.制作模型簡(jiǎn)單，存活率高，易觀察實(shí)驗(yàn)指標(biāo)；4.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及造模過程符合倫理道德規(guī)范。相對(duì)于家兔、貓、狗、非人靈長(zhǎng)類等動(dòng)物，嚙齒類動(dòng)物在綜合條件下更符合大多數(shù)實(shí)驗(yàn)者的選擇[4]。其中大鼠體積大，血管較粗，易于操作，因此VaD動(dòng)物模型以大鼠最為常見，實(shí)驗(yàn)時(shí)一般選擇成年、體重為(250±20)g的SPF級(jí)SD雄性大鼠或Wistar雄性大鼠。

在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)該保持實(shí)驗(yàn)環(huán)境舒適且相對(duì)恒定。一般環(huán)境溫度設(shè)為(21～25)℃左右，濕度為50%-70%，且提供足夠的食物和水供大鼠自由獲取，光照時(shí)間一般為12 h/d[5-7]。麻醉大鼠時(shí)可以選擇腹腔內(nèi)注射1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)[6]，也有實(shí)驗(yàn)選擇使大鼠吸入4%異氟烷預(yù)麻醉后使用2%異氟烷維持麻醉狀態(tài)[7]等。術(shù)后為防止大鼠發(fā)生感染影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果甚至死亡，在縫合切口后可應(yīng)用青霉素、慶大霉素等抗生素[8-9]。

2 動(dòng)物模型制備方法

2.1 血管外阻斷法

血管外阻斷法通過閉塞顱內(nèi)大動(dòng)脈或腦缺血再灌注導(dǎo)致腦血流量顯著減少?gòu)亩痫B內(nèi)局部血流動(dòng)力學(xué)改變，發(fā)生大腦白質(zhì)受損、神經(jīng)炎性反應(yīng)及大腦皮層及海馬區(qū)神經(jīng)元受損或死亡，進(jìn)而出現(xiàn)認(rèn)知功能缺陷[6-7]。此外，腦缺血再灌注會(huì)產(chǎn)生羥自由基，明顯地增加了大鼠大腦皮質(zhì)和海馬內(nèi)丙二醛的含量，丙二醛通過影響DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及傳遞影響蛋白質(zhì)的合成及功能，最終導(dǎo)致腦組織結(jié)構(gòu)及功能紊亂[10]。

2.1.1 永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈

大鼠于實(shí)驗(yàn)前12 h開始禁食，不禁水。麻醉后將大鼠固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，消毒后沿頸正中線切開皮膚約4～5 cm，暴露并分離出雙側(cè)頸總動(dòng)脈，此時(shí)需注意避免損傷迷走神經(jīng)，永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈。若有對(duì)照組，則對(duì)照組大鼠只分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈而不結(jié)扎，術(shù)后縫合皮膚、消毒并應(yīng)用抗生素[5,11-15]。有研究將此法改良為分次進(jìn)行的永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈，即先結(jié)扎一側(cè)頸總動(dòng)脈，3～7 d后再行結(jié)扎對(duì)側(cè)頸總動(dòng)脈[7,16]。由于大鼠側(cè)支循環(huán)具有個(gè)體差異性，因此結(jié)扎頸總動(dòng)脈后所造成的卒中嚴(yán)重程度不同，腦血流量嚴(yán)重不足時(shí)可導(dǎo)致大鼠死亡。改良后的手術(shù)方法結(jié)扎一側(cè)頸總動(dòng)脈后通過大腦側(cè)支循環(huán)逐步代償后再行結(jié)扎對(duì)側(cè)頸總動(dòng)脈，不至于使腦血流量驟然減少導(dǎo)致大鼠死亡。該方法提高了大鼠存活率，但目前應(yīng)用較少，還需重復(fù)驗(yàn)證該方法的穩(wěn)定性及可靠性。

2.1.2 雙血管阻斷法

雙血管阻斷法[17-20]與永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈法相似，但其分離出雙側(cè)頸總動(dòng)脈后不直接結(jié)扎，而是使用血管夾夾閉頸總動(dòng)脈10 min后松開，等待10 min后再次夾閉，重復(fù)2～3次后縫合皮膚、消毒并應(yīng)用抗生素。也有實(shí)驗(yàn)[20]是將其夾閉20 min后再松開血管夾，待血管放松10 min后再次夾閉。目前尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定夾閉、放松時(shí)間及重復(fù)次數(shù)，還需進(jìn)一步研究夾閉和放松時(shí)間及重復(fù)次數(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

2.1.3 四血管阻斷法

四血管阻斷法[21-23]與雙血管阻斷法不同之處在于先將椎動(dòng)脈永久性閉塞，即大鼠麻醉后以俯臥位固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)，沿背部正中線切開皮膚后，充分暴露雙側(cè)第1頸椎橫突翼小孔，用電凝針燒灼翼小孔內(nèi)的椎動(dòng)脈，縫合皮膚并消毒。而后再?gòu)那罢芯€切開皮膚，分離出雙側(cè)頸總動(dòng)脈進(jìn)行夾閉、松開數(shù)次，最后縫合皮膚、消毒并應(yīng)用抗生素。夾閉及松開時(shí)間、重復(fù)次數(shù)尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。該方法需要做兩個(gè)切口，操作步驟復(fù)雜、感染風(fēng)險(xiǎn)大，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物耐受性差。

2.2 血管內(nèi)栓塞法

血管內(nèi)栓塞法一般可用血凝塊、膽固醇晶體、微球[24]、石蠟等作為栓子。小栓子進(jìn)入顱內(nèi)后造成多發(fā)性腦梗死灶，且多位于于大腦中動(dòng)脈供血區(qū)，造成相應(yīng)部位的腦組織缺血，從而出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙。值得注意的是線栓法有所不同，其原理同血管外阻斷法相似，通過阻斷大腦中動(dòng)脈使腦血流量持續(xù)降低，引起神經(jīng)元損傷，形成血管性癡呆動(dòng)物模型。

2.2.1 線栓法

該方法最初由Longa提出，即將尼龍線一端燙成光滑的球面作為線栓，將麻醉后的大鼠固定于試驗(yàn)臺(tái)上，消毒后沿頸正中線做切口，暴露并分離出頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、及頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈后，可沿頸總動(dòng)脈插入栓線進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈，也可于分叉處直接將栓線插入頸內(nèi)動(dòng)脈，留置一段時(shí)間后將栓線取出，達(dá)到腦缺血再灌注的效果[25-27]。留置時(shí)間過短有可能達(dá)不到腦缺血效果，大鼠可能無明顯神經(jīng)系統(tǒng)受損癥狀因而不能納入研究，而時(shí)間過長(zhǎng)又會(huì)導(dǎo)致大鼠顱內(nèi)嚴(yán)重缺血甚至死亡，國(guó)內(nèi)大部分實(shí)驗(yàn)者選擇留置2 h[28]。有研究將此法改良為結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端、頸外動(dòng)脈根部后，用血管夾暫時(shí)夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈根部，于頸總動(dòng)脈剪一小口，將線栓沿頸總動(dòng)脈插入頸內(nèi)動(dòng)脈，至血管夾處快速松開血管夾使線栓進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈，進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈約18～25 mm后感到稍有阻力時(shí)于頸內(nèi)動(dòng)脈根部牢牢固定線栓，消毒并縫合手術(shù)切口[29]。研究表明，實(shí)驗(yàn)環(huán)境及圍手術(shù)期護(hù)理相同的情況下，改良后的線栓法成功率明顯高于Longa的方法，且手術(shù)操作更加簡(jiǎn)單，動(dòng)物模型更加穩(wěn)定[30]。

線栓法具有無需開顱、術(shù)后動(dòng)物生命體征穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，是目前認(rèn)可度較高的一個(gè)血管性癡呆模型。但仍然存在一些問題，比如線栓進(jìn)入的部位對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響、估量線栓進(jìn)入的長(zhǎng)度、線栓停留的時(shí)間等，值得我們不斷探討與改進(jìn)。

2.2.2 血凝塊

在大鼠身上取血后經(jīng)無菌干燥后形成血凝塊，加入生理鹽水制成混懸液。大鼠麻醉后暴露頸總動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈后將混懸液注入頸總動(dòng)脈，小栓子沿頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈進(jìn)入顱內(nèi)，形成多發(fā)性腦梗死動(dòng)物模型[31-32]。有研究將大鼠自身靜脈血0.6 mL與200 U/mL凝血酶0.15 mL混合，放入PE50管靜置4 h形成血凝塊，再將血凝塊切成小血栓放入PE50管中備用。暴露頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈及其他小動(dòng)脈后，將頸外動(dòng)脈及其他小動(dòng)脈永久性結(jié)扎，將頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈暫時(shí)夾閉，把含有小栓子的PE50管插入頸總動(dòng)脈分叉處，打開血管夾向動(dòng)脈內(nèi)輸注小栓子，造成顱內(nèi)多發(fā)梗死灶[33]。

2.2.3 膽固醇晶體

此法與血凝塊法相似，使用過濾器過濾出大小為70～100 μm的膽固醇晶體并用生理鹽水稀釋，每只大鼠使用300 μL的生理鹽水稀釋500±100個(gè)膽固醇晶體。麻醉大鼠后沿頸正中線做切口，暴露并分離頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈并用血管夾夾閉頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈，將1 mL注射器連接至PE50管上，插入頸總動(dòng)脈分叉處，在1 min內(nèi)緩慢向血管內(nèi)注射晶體并移除血管夾，從而形成多發(fā)性腦梗死動(dòng)物模型[34-35]。

2.3 高危因素導(dǎo)致的VaD

2.3.1 高血壓[36-37]

自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat, SHR)是Wistar大鼠通過選擇性交配培育出的一種大鼠，其高血壓發(fā)生率高，具有腦卒中傾向。在自發(fā)性高血壓大鼠發(fā)生腦卒中后，對(duì)存活的大鼠進(jìn)行認(rèn)知功能評(píng)估篩選出符合實(shí)驗(yàn)條件的動(dòng)物模型[36-37]。自發(fā)性高血壓大鼠通過引起小血管內(nèi)皮損傷導(dǎo)致白質(zhì)及髓鞘損傷、神經(jīng)炎性反應(yīng)及神經(jīng)元損傷等形成高血壓腦卒中模型[36]。但由于高血壓所造成的卒中部位及嚴(yán)重程度不確定，且此大鼠模型費(fèi)用較高，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛻?yīng)用較少。

2.3.2 糖尿病

給予大鼠高糖飲食4周，禁食12 h后測(cè)量體重及空腹血糖。將鏈脲佐菌素(50 mg/kg)溶于0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液中，在避光條件下給予大鼠一次性腹腔注射，48 h后測(cè)量大鼠血糖，若空腹血糖>11.1 mmol/L則表示糖尿病大鼠造模成功，再通過認(rèn)知功能評(píng)估篩選出有認(rèn)知功能障礙的大鼠模型[36,38-39]。已有研究表明長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)會(huì)加速動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程，導(dǎo)致小血管閉塞，最終引起腦卒中。此外，糖尿病大鼠認(rèn)知功能缺陷可能與海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞活化、樹突狀細(xì)胞密度降低及氧化應(yīng)激等有關(guān)[36]。

2.4 認(rèn)知功能評(píng)估

通過血管外阻斷法、血管內(nèi)阻斷法或其他實(shí)驗(yàn)方法造模后需要通過行為學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行認(rèn)知功能評(píng)估，以確保造模成功。評(píng)估大鼠認(rèn)知功能常用的方法有迷宮實(shí)驗(yàn)、新物體識(shí)別、條件性恐懼實(shí)驗(yàn)以及主動(dòng)回避任務(wù)及被動(dòng)回避任務(wù)等[40]。其中以Morris水迷宮應(yīng)用最為廣泛，需要進(jìn)行手術(shù)的一般在術(shù)后6～8周開始進(jìn)行認(rèn)知功能評(píng)估實(shí)驗(yàn)[8, 11-13]。

2.4.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)備一個(gè)直徑為160 cm，高度為50 cm的圓形水池，水溫維持在24～26℃，水池上方固定一個(gè)連接到電腦程序的攝像頭，將水池分為四個(gè)象限，在目標(biāo)象限中心放置一個(gè)直徑為10 cm的可移動(dòng)平臺(tái)，距離水面約2 cm，可在水中加入墨汁或牛奶更好地隱匿平臺(tái)。在5 d的訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)中，讓大鼠面向水池壁后從不同象限將其放入水池中，使大鼠在規(guī)定時(shí)間內(nèi)尋找平臺(tái)，規(guī)定時(shí)間可為60 s、90 s或120 s不等，大鼠到達(dá)平臺(tái)后使其停留10 s并記錄逃避潛伏期，若規(guī)定時(shí)間內(nèi)大鼠未能尋找到平臺(tái)則引導(dǎo)其到平臺(tái)上停留10 s，逃避潛伏期記錄為規(guī)定的時(shí)間。每天進(jìn)行2～3次，每次間隔10 min。第6天時(shí)，移除平臺(tái)，使大鼠自由游泳并記錄其穿過平臺(tái)的次數(shù)及停留時(shí)間，作為評(píng)估大鼠記憶能力的指標(biāo)。在實(shí)驗(yàn)過程中水池及平臺(tái)大小可以因?qū)嶒?yàn)室條件不同而做一定的調(diào)整。

2.4.2 新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)

新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)[40-41]將大鼠置于一個(gè)固定大小的場(chǎng)地中，在沒有任何物體的情況下讓大鼠熟悉環(huán)境5 min。次日將兩個(gè)相同的物體放在場(chǎng)地兩個(gè)相對(duì)的角落中，記錄10 min內(nèi)大鼠探索兩個(gè)物體的時(shí)間。利用大鼠喜愛探索新事物的天性，在第3天將其中一個(gè)物體換成一個(gè)不同的新物體，記錄10 min內(nèi)大鼠探索舊物體和新物體的時(shí)間，作為評(píng)估大鼠記憶能力的指標(biāo)。每次實(shí)驗(yàn)前用70%的酒精清洗物體和場(chǎng)地。

2.4.3 被動(dòng)回避任務(wù)

被動(dòng)回避任務(wù)[40, 42]需準(zhǔn)備一個(gè)由大小相同的暗室和光室組成的回避裝置，兩室間有可滑動(dòng)的隔板間隔。利用大鼠偏愛黑暗環(huán)境的天性，將大鼠放置在光室內(nèi)，移開隔板，記錄大鼠進(jìn)入暗室的潛伏期。當(dāng)大鼠四只爪子完全進(jìn)入暗室時(shí)關(guān)閉隔板并給予大鼠足部0.5 mA電擊10 s，電擊結(jié)束后立即將大鼠從裝置中取出，放回籠子中。第二天，再次將大鼠放置在光室中，移開隔板，記錄大鼠進(jìn)入暗室的潛伏期，作為評(píng)估大鼠記憶能力的指標(biāo)，若300 s后大鼠仍未進(jìn)入暗室，則實(shí)驗(yàn)結(jié)束，潛伏期記為300 s。

3 展望

現(xiàn)應(yīng)用較多的血管性癡呆大鼠模型為永久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈阻斷法、雙血管阻斷法、線栓法，其均是通過阻斷顱內(nèi)大動(dòng)脈造成腦血流量減少，引起認(rèn)知功能障礙，但在操作過程中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物容易失血過多而死亡，這對(duì)實(shí)驗(yàn)者的操作技術(shù)提出了更高的要求。造模后可應(yīng)用磁共振明確實(shí)驗(yàn)動(dòng)物卒中部位及責(zé)任血管[7]，或使用多普勒檢測(cè)儀在術(shù)前、術(shù)中、術(shù)后監(jiān)測(cè)腦血流量，同時(shí)通過Morris水迷宮等行為學(xué)實(shí)驗(yàn)評(píng)估認(rèn)知功能障礙程度，確保動(dòng)物模型符合實(shí)驗(yàn)條件[10, 43]。

總之，建立一種生理指標(biāo)穩(wěn)定、模型重復(fù)性好、簡(jiǎn)單易操作的血管性癡呆動(dòng)物模型有助于我們對(duì)血管性癡呆的發(fā)病機(jī)制、病理改變及臨床癥狀的認(rèn)識(shí)。