反向遺傳學(xué)技術(shù)應(yīng)用于豬繁殖與呼吸綜合征病毒研究的進(jìn)展

鄭海紅，孫竹筠，張可煜，高 飛，韋祖樟

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530005)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcinere productive and respiratory syndrome virus，PRRSV)屬于動(dòng)脈炎病毒科(Arteriviridae)、動(dòng)脈炎病毒屬(Arterivirus)成員。根據(jù)血清學(xué)和遺傳特性的差異，可將PRRSV 分為歐洲型(1 型)和美洲型(2 型)[1]。隨著反向遺傳操作系統(tǒng)的建立， 使對(duì)RNA 病毒基因組在其cDNA 分子水平上進(jìn)行體外人工操作成為可能，如對(duì)基因進(jìn)行點(diǎn)突變、缺失、插入、顛換、轉(zhuǎn)位和互補(bǔ)等改造。近年來(lái)，科學(xué)家通過(guò)對(duì)PRRSV 基因組的反向遺傳操作[2-6]，在研究PRRSV 的基因復(fù)制、亞基因組轉(zhuǎn)錄與表達(dá)調(diào)控機(jī)理、PRRSV 與宿主間的相互作用關(guān)系以及PRRSV 用于異源基因表達(dá)載體來(lái)開(kāi)發(fā)抗病毒疫苗等研究，取得了一些顯著成果。本文就應(yīng)用反向遺傳學(xué)技術(shù)來(lái)研究PRRSV 的進(jìn)展報(bào)告做一綜述。

1 應(yīng)用于PRRSV基因組結(jié)構(gòu)與功能方面的研究

1.1 PRRSV 5'UTR 的堿基缺失或突變對(duì)其功能的影響研究 通過(guò)比較分析不同PRRSV 病毒株的5'UTR 發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是 1 型還是 2 型 PRRSV，5' 端的 30 個(gè)核苷酸高度保守，特別是前10 個(gè)核苷酸。為了研究5' 端這段保守序列對(duì)病毒復(fù)制的作用，Choi 等以感染性克隆pBAC/PRRSV/FL 為框架，將PRRSV 5' 端核苷酸逐一缺失，直至缺失到15 個(gè)核苷酸，共構(gòu)建8 個(gè)突變體全長(zhǎng)cDNA 克隆。結(jié)果顯示，當(dāng)5' 端共缺失掉9 個(gè)核苷酸時(shí)，未能拯救出突變病毒，且PRRSV 5'UTR 的5' 端前7 個(gè)核苷酸對(duì)病毒復(fù)制是非必須的，但這7 個(gè)堿基的缺失極大降低了PRRSV 的復(fù)制效率[7]；Choi 等還通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了人為設(shè)計(jì)的5'AU- 富集序列能夠恢復(fù)其5'- 近端7- 核苷酸缺失突變體的復(fù)制效率[7]。而Gao 等以感染性克隆pAPRRS 為框架，證實(shí)PRRSV 能允許5' 端16 個(gè)核苷酸的缺失，并進(jìn)一步證實(shí)預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中的莖環(huán)結(jié)構(gòu)(SL1)對(duì)病毒的感染性至關(guān)重要[8]。另外，Lu 等還發(fā)現(xiàn)PRRSV 基因組5'UTR 中存在一個(gè)不同型間保守的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，將其命名為SL2，同樣以感染性克隆pAPRRS 為平臺(tái)，將SL2 進(jìn)行一系列突變、缺失、替換，以改變SL2 結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，PRRSV 5'UTR 中的SL2 為PRRSV 轉(zhuǎn)錄所必需，但對(duì)PRRSV 基因組RNA 的復(fù)制非必需，還證實(shí)N-SL2 發(fā)揮作用的關(guān)鍵元件是其莖結(jié)構(gòu)而非“三核苷酸環(huán)結(jié)構(gòu)”，只有保持該莖結(jié)構(gòu)的完整性，才能保證病毒的復(fù)制及突變體全長(zhǎng)cDNA 的拯救[9]。

總之，對(duì)PRRSV 而言，5'UTR 5' 端核苷酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)等高級(jí)結(jié)構(gòu)較初級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)病毒的感染性、基因組的復(fù)制及其亞基因組的轉(zhuǎn)錄更重要，至于Choi 等和Gao 等研究結(jié)果的不同，這可能與他們采用的不同感染性克隆框架有關(guān)[7-8]。

1.2 PRRSV 3'UTR 中的堿基缺失和突變對(duì)其功能的影響Sun 等以感染性克隆pAPRRS 為框架，構(gòu)建一系列PRRSV 3' UTR 5'端前66 個(gè)堿基缺失的突變體，并將獲得的突變體轉(zhuǎn)染Marc-145 細(xì)胞以拯救其相應(yīng)突變病毒。結(jié)果顯示，盡管PRRSV 3' UTR 5' 端前66 個(gè)堿基的缺失突變體仍能在Marc-145 細(xì)胞中拯救出其相應(yīng)突變病毒，但這種堿基缺失會(huì)降低病毒在Marc-145 細(xì)胞中的復(fù)制效率；此外，67 個(gè)堿基缺失突變體的轉(zhuǎn)染不僅會(huì)降低PRRSV 亞基因組的合成豐度，而且無(wú)法拯救出相應(yīng)突變體病毒[10]。Verheije 等以LV 株的感染性克隆為框架，將3'UTR 5' 端的7 個(gè)核苷酸缺失，構(gòu)建的全長(zhǎng)cDNA 突變體能夠拯救出相應(yīng)突變體病毒；當(dāng)缺失32 個(gè)核苷酸時(shí)，未能檢測(cè)到PRRSV 基因組RNA 復(fù)制，也不能拯救出相應(yīng)的突變病毒；對(duì)其它位置的突變顯示，PRRSV 3'UTR 3' 末端的4個(gè)核苷酸(5'-15517AAUU15520-3')中的5'-AU-3' 對(duì)突變病毒的拯救至關(guān)重要[11]。關(guān)于以上突變體無(wú)法拯救出突變病毒的原因，是突變或缺失影響到了PRRSV 亞基因組轉(zhuǎn)錄、基因組復(fù)制還是影響到了PRRSV 與細(xì)胞互作還有待于進(jìn)一步研究。Yin 等通過(guò)對(duì)PRRSV 3' 末端保守序列進(jìn)行一系列缺失、突變，發(fā)現(xiàn)PRRSV 3' 末端保守序列的初級(jí)序列較之其周圍的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)病毒的復(fù)制與感染性更加重要，推測(cè)該保守序列很可能為PRRSV 復(fù)制復(fù)合體的組裝提供一個(gè)連接區(qū)域[12]。

1.3 PRRSV 轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(TRS)堿基突變對(duì)其功能的影響 位于PRRSV Leader 末端及各個(gè)ORF 前的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(Transcription-regulating sequence，TRS，TRS-L 和 TRS-B)在sg mRNA 合成過(guò)程中起著重要作用，但其作用機(jī)制尚不清楚。Zheng 等以感染性克隆pAPRRS 為框架，采用插入、替換等一系列突變方式，鑒定了TRS 的核苷酸殘基構(gòu)成及外源序列對(duì)PRRSV 轉(zhuǎn)錄功能的影響。結(jié)果顯示：(1)構(gòu)成TRS 3 末端的CC 在相應(yīng)的亞基因組轉(zhuǎn)錄中起著重要作用，部分CC 具有核苷酸序列特異性；單獨(dú)突變CC 中的任一個(gè)C 不影響TRS 功能，且拯救的相應(yīng)突變病毒與親本病毒的生物學(xué)特性無(wú)差異；同時(shí)突變CC 能夠嚴(yán)重影響相應(yīng)TRS 功能，且無(wú)法拯救出相應(yīng)突變病毒；形成 sg mRNA7 兩個(gè) TRS (TRS7.1-B 和 TRS7.2-B)均可單獨(dú)調(diào)控PRRSV sg mRNA7 的轉(zhuǎn)錄，而對(duì)野生PRRSV 來(lái)說(shuō)，TRS7.1-B 比 TRS7.2-B 更重要，即只采用 TRS7.1-B 轉(zhuǎn)錄sg mRNA7 的突變病毒比只采用TRS7.2-B 轉(zhuǎn)錄sg mRNA7的突變病毒更接近野生PRRSV 的生物學(xué)特性；TRS-L 與互補(bǔ)鏈的TRS-B 的配對(duì)是調(diào)控亞基因組轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因素，但不是唯一因素。(2) PRRSV 可以采用外源序列中的類似TRS 序列作為啟動(dòng)子來(lái)調(diào)控新亞基因組的合成，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)突變或外源序列的插入，導(dǎo)致PRRSV 可以啟動(dòng)其基因組中無(wú)活性的一段類似TRS 合成相應(yīng)亞基因組或PRRSV 通過(guò)突變或缺失方式使PRRSV 基因組中無(wú)活性的一段序列變?yōu)轭愃芓RS 來(lái)合成相應(yīng)亞基因組。(3)上述研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了所有獲得拯救的突變病毒亞基因組中的leader-body 結(jié)合位點(diǎn)序列均來(lái)源于TRS-B[13-14]。由此可見(jiàn)，PRRSV 能靈活運(yùn)用TRS，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，通過(guò)突變TRS中的堿基，很難使其所在的TRS 功能失活，即使失活，PRRSV 也會(huì)啟動(dòng)其他TRS (野生株不啟用)來(lái)完成轉(zhuǎn)錄，保證病毒自身的存活。

1.4 PRRSV 結(jié)構(gòu)蛋白基因的堿基突變對(duì)其功能的影響

1.4.1 糖基化位點(diǎn)的改變對(duì)相應(yīng)蛋白功能的影響PRRSV的 GP2a 、GP3 和 GP4 蛋白表面分別有 2、7 和 4 個(gè) N- 糖基化位點(diǎn)。GP5 有2～5 個(gè)不等糖基化位點(diǎn)。應(yīng)用反向遺傳學(xué)技術(shù)，Wei 等根據(jù)丙氨酸掃描法(Alanine scanning)將糖基化位點(diǎn)NXS/T突變?yōu)锳XS/T，發(fā)現(xiàn)GP2N184、GP3N42、N50 和N131 是病毒具有感染性所必須的；對(duì)GP5 膜外結(jié)構(gòu)域的3 個(gè)N- 糖基化位點(diǎn)(N34、N44、N51)突變分析發(fā)現(xiàn)，N44 的突變能夠?qū)е氯L(zhǎng)cDNA 無(wú)法拯救出病毒，N33、N55、N33/N55 突變降低了病毒的生長(zhǎng)滴度；研究還表明，突變病毒增強(qiáng)了對(duì)抗體的敏感性，突變病毒感染豬較野毒株感染豬能夠產(chǎn)生更高水平的抗體，表明GP5 膜外區(qū)多糖的缺失能夠提高病毒對(duì)中和抗體的敏感性及對(duì)其附近中和表位的免疫原性。對(duì)臨床上能分離到的這些糖基化位點(diǎn)缺失突變株的序列比對(duì)顯示，將糖基化位點(diǎn)中的氨基酸N→A 的突變可能改變病毒蛋白結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響了病毒的感染性[15]。Wei 等將糖基化位點(diǎn)中N 突變成臨床突變株中存在的氨基酸，或者突變成與N 結(jié)構(gòu)相似的氨基酸，以破壞糖基化位點(diǎn)，結(jié)果表明，GP2、GP3、GP4 或GP5 蛋白的任何一個(gè)糖基化位點(diǎn)突變，均不影響病毒的感染性；GP2、GP3 和GP4 蛋白表面的糖基化位點(diǎn)突變，也不能提高突變病毒對(duì)其抗血清的敏感性；突變GP5 表面所有的糖基化位點(diǎn)，盡管能拯救出病毒，但極大降低了突變病毒在細(xì)胞中的復(fù)制能力，且該突變病毒無(wú)法在豬體內(nèi)復(fù)制；該研究還發(fā)現(xiàn)GP5 糖基化缺失提高了突變病毒對(duì)中和抗體的敏感性，而N44 糖基化的缺失并不影響病毒中和表位的免疫原性[16]。

1.4.2 ORF5a蛋白基因的突變對(duì)其功能的影響PRRSV ORF5a 蛋白是最近發(fā)現(xiàn)的小蛋白，其與GP5 蛋白N 端編碼區(qū)部分重疊。在 1 型、2 型 PRRSV 感染性克隆(pARRSV、pAJXM 和pMSHE)中，將 ORF5a 基因的起始密碼子突變失活，未能拯救出感染性的病毒粒子，表明PRRSV ORF5a 蛋白對(duì)病毒活力是必需的[17]。

1.4.3 N蛋白基因的突變對(duì)其功能的影響N 蛋白是最保守的病毒蛋白，其主要功能是連接基因組RNA 和其它結(jié)構(gòu)蛋白的包裝。通過(guò)反向遺傳學(xué)技術(shù)證實(shí)，2 型PRRSV N 蛋白 N 端 aa5～aa13、aa39～aa42、aa48～aa52位氨基酸及其C 端最后4 個(gè)氨基酸均是非必需的，這些氨基酸的缺失并不影響病毒粒子的感染性；N 蛋白的半胱氨酸在動(dòng)脈炎病毒屬間缺乏保守性，2 型PRRSV N 蛋白含有 3 個(gè)保守的半胱氨酸(Cys23、Cys75、Cys90)，1 型PRRSV 和鼠乳酸脫氫酶病毒(Lactic dehydrogenase virus，LDV)的N 蛋白含有2 個(gè)保守的半胱氨酸，而馬動(dòng)脈炎病毒(Equine arteritis virus，EAV)和猴出血熱病毒(Simian hemorrhagic fever virus， SHFV)的N蛋白無(wú)半胱氨酸[18]。Wootton 等和Zhang 等將N 蛋白中半胱氨酸突變成丙氨酸，發(fā)現(xiàn)突變N 蛋白中所有的半胱氨酸不影響病毒的感染性，表明半胱氨酸介導(dǎo)的N 蛋白同源二聚體對(duì)病毒的感染性是非必需的[19-20]。N 蛋白含有核定位信號(hào)(Nuclear localization signals，NLS)點(diǎn)，其在病毒感染早期能夠進(jìn)入細(xì)胞核，Lee 等以PRRSV 感染性克隆為框架，將NLS 位點(diǎn)中的43K 和44K，突變?yōu)?3G 和44G，獲得的全長(zhǎng)突變cDNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞后能夠拯救出相應(yīng)突變病毒，且獲得的突變病毒將N 蛋白限制在細(xì)胞漿中，其生長(zhǎng)滴度較野生病毒株低100 倍；將含有NLS 突變的拯救病毒感染豬后發(fā)現(xiàn)，豬盡管出現(xiàn)時(shí)間較短的病毒血癥，但病毒能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生較高的中和抗體，表明PRRSV N 蛋白的細(xì)胞核定位可能會(huì)刺激豬體產(chǎn)生相應(yīng)的感染PRRSV 免疫應(yīng)答[21]。

1.5 構(gòu)建嵌合病毒來(lái)解析病毒蛋白功能

1.5.1 構(gòu)建嵌合病毒來(lái)解析病毒結(jié)構(gòu)蛋白功能為鑒定動(dòng)脈炎病毒與細(xì)胞嗜性相關(guān)的蛋白，以EAV 感染性克隆為框架，將 PRRSV 和 LDV GP5 的囊膜外結(jié)構(gòu)域替代EAV 感染性克隆的相應(yīng)區(qū)域，構(gòu)建的EAV 嵌合克隆轉(zhuǎn)染細(xì)胞后能夠產(chǎn)生子代病毒，并保留其對(duì)BHK-21 和RK-13細(xì)胞的感染性，但不能感染豬或者鼠的巨噬細(xì)胞。將1 型PRRSV 感染性cDNA 克隆的M 蛋白膜外結(jié)構(gòu)域的編碼序列分別替換為L(zhǎng)DV、EAV 和PRRSV VR2332 的相應(yīng)基因組序列，構(gòu)建的PRRSV 嵌合體均能夠拯救出嵌合病毒，且嵌合病毒仍然保持對(duì)豬肺泡巨噬細(xì)胞的感染性，但不能感染BHK-21 細(xì)胞。上述研究結(jié)果表明，M 和GP5 蛋白膜外結(jié)構(gòu)域并不決定動(dòng)脈炎病毒的細(xì)胞嗜性[22-23]。以2 型PRRSV 感染性克隆為基礎(chǔ)，將基因1 型PRRSV 的囊膜蛋白基因ORF2～ORF5 替換2 型PRRSV 感染性克隆相應(yīng)區(qū)域，拯救出的嵌合子代病毒表現(xiàn)出與親本骨架病毒相似的生物學(xué)特征，表明1 型PRRSV 的相應(yīng)囊膜蛋白能夠在2型PRRSV 中發(fā)揮功能；將EAV 的小囊膜蛋白GP2/GP3/GP4 編碼區(qū)替換PRRSV 相應(yīng)的GP2/GP3/GP4 區(qū)域，將嵌合感染性克隆pARRS-EAV234 轉(zhuǎn)染細(xì)胞后能夠拯救出嵌合病毒，且嵌合病毒vPRRSV-EAV234 擴(kuò)大了對(duì)傳代細(xì)胞系的細(xì)胞嗜性，嵌合病毒不但能夠感染MARC-145 細(xì)胞，還能感染PRRSV 非允許的體外傳代細(xì)胞BHK-21 和Vero細(xì)胞，但嵌合病毒無(wú)法感染PRRSV 易感的肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)， 表明決定動(dòng)脈炎病毒細(xì)胞嗜性的蛋白為GP2/GP3/GP4 復(fù)合物[24]。

1.5.2 構(gòu)建嵌合病毒來(lái)解析病毒非結(jié)構(gòu)蛋白功能為深入了解PRRSV 的生物學(xué)特性和毒力增強(qiáng)機(jī)制，采用反向遺傳操作系統(tǒng)將弱毒MLV 株與強(qiáng)毒MN184 株嵌合來(lái)致弱強(qiáng)毒株MN184，結(jié)果顯示，MLV 的5' UTR/ORF1 復(fù)制酶編碼區(qū)和結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)ORF2～ORF7/3'UTR 均能夠致弱強(qiáng)毒株MN184[25]。異源嵌合病毒致病力試驗(yàn)顯示，高致病性病毒株FL12 的毒力因子主要位于nsp3～nsp8 和GP5 中[26]。2006年暴發(fā)的高致病性 PRRSV (HPPRRSV)的nsp2 編碼區(qū)不連續(xù)性地缺失了30 個(gè)氨基酸，是該次流行的PRRSV 獨(dú)特的遺傳標(biāo)志。為確定該30 個(gè)氨基酸缺失是否與病毒毒力增強(qiáng)有關(guān)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為以HPPRRSV 病毒株JXwn06 感染性克隆為框架，將其nsp2 缺失部分替換為低致病性病毒株(HB-1/3.9)相應(yīng)區(qū)域，結(jié)果顯示，構(gòu)建的嵌合病毒對(duì)仔豬保持高致病性；而以該低致病性病毒株(HB-1/3.9)為骨架，缺失其nsp2 中的30 個(gè)氨基酸，嵌合病毒與親本病毒一樣，仍然對(duì)豬保持低致病性。由此表明，nsp2 的30 個(gè)氨基酸缺失并不是導(dǎo)致HPPRRSV 毒力增強(qiáng)的唯一原因[6]。還有研究將1 型PRRSV 5' UTR 替換至2 型PRRSV 感染性克隆pAPRRS 骨架中的相應(yīng)區(qū)域，或?qū)?1 型 PRRSV 3' UTR 替換至 2 型 PRRSV 感染性克隆pAPRRS 骨架中的相應(yīng)區(qū)域，結(jié)果均表明，嵌合病毒與親本病毒具有相似的病毒學(xué)和生物學(xué)特性[27-28]，表明1 型PRRSV 5' UTR 和 3' UTR 在功能上可以完全替代 2 型PRRSV 相應(yīng)的 5' UTR 和 3' UTR，提示雖然 PRRSV 1 型與2 型5' UTR 間和3' UTR 間的一級(jí)結(jié)構(gòu)均相差很大，但一些局部保守結(jié)構(gòu)域起著關(guān)鍵的功能作用。

2 應(yīng)用在疫苗方面的研究

動(dòng)脈炎病毒屬感染性克隆也可以作為新型的病毒 系統(tǒng)來(lái)表達(dá)外源基因有兩個(gè)可能：一是能夠產(chǎn)生攜帶外源基因的感染性重組載體/ 病毒，其次是能夠產(chǎn)生攜帶外源基因具有復(fù)制能力但是不能增殖的復(fù)制子載體。目前，以PRRSV 的感染性克隆作為外源基因表達(dá)載體已有大量研究，結(jié)果顯示，(1)外源基因得以穩(wěn)定表達(dá)的關(guān)鍵是外源基因要單獨(dú)作為一個(gè)亞基因組來(lái)轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[29-31]；(2)研究發(fā)現(xiàn)，雖然ORF7 和3' UTR 間等均可作為外源基因序列的插入位點(diǎn)[32-33]，但ORF1 和ORF2 間是外源基因序列插入的最好位點(diǎn)。另外，關(guān)于PRRSV 作為載體表達(dá)外源基因的研究進(jìn)展，李清清等做了詳盡的綜述報(bào)告[34]，可供學(xué)者們查閱參考。

3 展 望

綜上所述，通過(guò)對(duì)PRRSV 的反向遺傳操作，其基因組復(fù)制、亞基因組轉(zhuǎn)錄機(jī)制及基因組表達(dá)調(diào)控機(jī)理、病毒與宿主間的相互作用關(guān)系以及構(gòu)建新型載體來(lái)表達(dá)外源基因進(jìn)行疫苗的研制等方面研究均有了很大進(jìn)展。相信隨著反向遺傳操作技術(shù)的不斷進(jìn)步，通過(guò)研究一系列與毒力相關(guān)的位點(diǎn)以及合適的外源基因插入位點(diǎn)，從而有針對(duì)性地對(duì)病毒進(jìn)行有效的改造，不僅能夠獲得更理想的重組病毒，用來(lái)研制PRRSV 新型基因工程疫苗，還能找到治療靶點(diǎn)來(lái)防治該病毒，達(dá)到凈化該病毒的目的。