動物疫病病毒樣顆粒疫苗的研究進(jìn)展

劉 萍，郭富城，李林杰，李凌浩，馬曉霞，馬忠仁*

(1.西北民族大學(xué)生物工程與技術(shù)國家民委重點實驗室，甘肅蘭州730030；2.甘肅省動物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州730030；3.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730030)

病毒樣顆粒(Virus-like particles，VLPs)是由病毒結(jié)構(gòu)蛋白組成的空心顆粒，具有天然病毒粒子形態(tài)和空間結(jié)構(gòu)，但不含有病毒核酸，無感染能力，也不能自主復(fù)制[1-2]。許多病毒的結(jié)構(gòu)蛋白在異源系統(tǒng)內(nèi)重組表達(dá)即可自裝配形成VLPs，這些VLPs 的形態(tài)和結(jié)構(gòu)與真正的病毒粒子相似，大小介于15 nm～400 nm，具有天然病毒粒子的空間構(gòu)象和與天然病毒相似的免疫原性。機(jī)體免疫系統(tǒng)能夠高效識別VLPs 并產(chǎn)生特異的細(xì)胞免疫、體液免疫及黏膜免疫等免疫應(yīng)答[2]。VLPs 在結(jié)構(gòu)上允許外源基因或基因片段插入，將其它病原誘導(dǎo)的中和抗體的抗原表位展示在VLPs 表面，形成嵌合型VLPs，因此也可以作為各類疾病新型疫苗的展示平臺，目前VLPs 已成為研究熱點[3]。另外，VLPs 還具有包裹核酸或經(jīng)表面修飾后攜帶其它分子的能力，作為一種潛在的基因或藥物的投遞工具，具有廣闊的應(yīng)用前景[4]。本文對VLPs 的抗原特性、制備及其在重要動物疫病疫苗的研究和應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 VLPs的抗原特性

不同病毒來源的VLPs其結(jié)構(gòu)與親本病毒在形態(tài)大小和結(jié)構(gòu)上高度相似，例如結(jié)構(gòu)較為簡單的細(xì)小病毒、圓環(huán)病毒、戊型肝炎病毒等的VLPs 由1 種或2 種結(jié)構(gòu)蛋白組成；而流感病毒、艾滋病病毒和丙型肝炎病毒等的VLPs具有來自宿主細(xì)胞的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)以及經(jīng)糖基化修飾的病毒纖突蛋白。因此，VLPs 具有與天然病毒類似的病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMP)，能夠與天然免疫系統(tǒng)中的模式識別受體結(jié)合，激活天然免疫反應(yīng)。VLPs 的體積較小，容易通過淋巴管進(jìn)入淋巴結(jié)中。在淋巴結(jié)，VLPs 可以被定居于淋巴結(jié)中的樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell，DC)攝取[5]。DC 是機(jī)體內(nèi)功能最強(qiáng)大的專職性抗原遞呈細(xì)胞(Antigen presenting cell，APC)。VLPs高度有序的表位結(jié)構(gòu)和納米量級的粒徑有利于DC 的吞噬和抗原加工處理。VLPs 能夠促進(jìn)DC 的增殖，上調(diào)CD40、CD80、CD86 等表面標(biāo)志物的表達(dá)水平，同時上調(diào)主要組織相容性復(fù)合體(Major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ和Ⅱ類分子的表達(dá)水平，有效提呈抗原。VLPs 上的B 細(xì)胞表位與MHC-Ⅱ類分子結(jié)合，刺激活化B 淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性中和抗體；T 細(xì)胞表位由MHC-I 類分子提呈，能夠活化CD8+T 細(xì)胞，活化的CD8+T細(xì)胞(CTL)可以直接殺死被病原感染的細(xì)胞從而清除病毒或其它細(xì)胞內(nèi)寄生的病原體，VLPs 也能夠促進(jìn)IL-6、IL-10、MIP-1α 及TNF-α 等細(xì)胞因子的分泌，刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答[6]。

2 VLPs的表達(dá)系統(tǒng)

制備VLPs 的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)分為真核表達(dá)系統(tǒng)和原核表達(dá)系統(tǒng)。其中，真核表達(dá)系統(tǒng)包括哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，酵母表達(dá)系統(tǒng)和桿狀病毒/ 昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)以及植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等。原核表達(dá)系統(tǒng)主要為大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。目前已報導(dǎo)的VLPs 約70 %由真核表達(dá)系統(tǒng)制備，約30 %由原核表達(dá)系統(tǒng)制備。

2.1 哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 制備與人類或動物疾病密切相關(guān)的病毒的VLPs 是人們最關(guān)注的熱點問題。這些病毒是以人或動物的細(xì)胞為天然宿主進(jìn)行復(fù)制和增殖。哺乳動物細(xì)胞具有最完善的病毒蛋白質(zhì)翻譯和翻譯后修飾系統(tǒng)，能夠精確地完成糖基化、磷酸化、二硫鍵形成、蛋白質(zhì)折疊與空間構(gòu)象的形成等翻譯后加工過程，產(chǎn)生的病毒蛋白具有完整的結(jié)構(gòu)和功能，有利于VLPs 的高效包裝，并保證VLPs 的活性。哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的這一優(yōu)點使其被大量應(yīng)用于疫苗和治療性重組蛋白的研究和生產(chǎn)中[7]。中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)是該系統(tǒng)最常用的表達(dá)細(xì)胞。目前人用乙肝疫苗GenHevac B?、BioHep?(Sci-B-VacTM)和Hepacare?均是在CHO 中表達(dá)制備的。哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)也存在一些不足之處：生產(chǎn)成本較高，目的蛋白表達(dá)量低，表達(dá)外源蛋白的穩(wěn)定性不足等。在實際生產(chǎn)中，通過改進(jìn)生產(chǎn)工藝，降低生產(chǎn)成本，提高目的蛋白表達(dá)水平，是相關(guān)企業(yè)和研究者需要解決的最大問題。

2.2 酵母表達(dá)系統(tǒng) 酵母表達(dá)系統(tǒng)是一種應(yīng)用廣泛的重組蛋白真核表達(dá)系統(tǒng)，也被應(yīng)用于VLPs 的制備。畢赤酵母(Pichia pastoris)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和漢遜酵母(Hansenula yeast)是常用的酵母細(xì)胞，可以對表達(dá)的蛋白進(jìn)行翻譯后修飾以使其具有正確的構(gòu)象和生物活性，但酵母的翻譯后修飾功能有限，特別是蛋白糖基化的不足，常用于無囊膜VLPs 的制備。Merck 公司采用酵母表達(dá)系統(tǒng)開發(fā)出了乙型肝炎病毒(HBV)和人乳頭瘤病毒(HPV)VLPs 疫苗。酵母細(xì)胞也具有同時表達(dá)多種亞單位蛋白，并將其組裝成VLPs 的能力，例如同時表達(dá)輪狀病毒的3 種結(jié)構(gòu)蛋白，并將其組裝成多層VLPs[8]。

2.3 桿狀病毒/ 昆蟲表達(dá)系統(tǒng) 桿狀病毒/ 昆蟲表達(dá)系統(tǒng)是近年來廣泛應(yīng)用的高效表達(dá)外源蛋白的真核表達(dá)系統(tǒng)之一。桿狀病毒具有嚴(yán)格特異的感染嗜性，只能感染昆蟲細(xì)胞，對脊椎動物不致病，也不產(chǎn)生內(nèi)毒素，不存在生物安全問題；基因組較大，可以容納較大片段的外源基因，蛋白大都以可溶性表達(dá)，表達(dá)效率高；高表達(dá)的外源蛋白在昆蟲細(xì)胞內(nèi)可以進(jìn)行與哺乳動物細(xì)胞幾乎相同的折疊、二硫鍵形成、糖基化、磷酸化、?；?、信號肽切除及肽段的切割等，使重組蛋白具有良好免疫原性；此外，昆蟲細(xì)胞還可以高密度懸浮連續(xù)培養(yǎng)，容易擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模，適合于重組蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)。因此，桿狀病毒/ 昆蟲表達(dá)系統(tǒng)制備各種類型VLPs 的優(yōu)勢使其成為疫苗開發(fā)者最新關(guān)注的VLPs 表達(dá)系統(tǒng)?；谠撓到y(tǒng)，葛蘭素史克公司已經(jīng)成功開發(fā)出人用HPV16 型和18 型VLPs 疫苗Cervarix?，并于2009年得到美國食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)。用該系統(tǒng)制備VLPs 疫苗也存在一些潛在的問題，即制備的VLPs 顆粒大小與桿狀病毒粒子類似，二者存在共表達(dá)，容易被污染，因此，純化是該系統(tǒng)制備VLPs 疫苗所面臨的最大挑戰(zhàn)[9]。

2.4 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng) 大腸桿菌(E.coil)表達(dá)系統(tǒng)是目前制備重組蛋白最廣泛的表達(dá)系統(tǒng)，也可以用來表達(dá)一些無囊膜病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，并組裝形成VLPs。目前，利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)制備VLPs 的技術(shù)已經(jīng)比較成熟。該系統(tǒng)的一個特點是表達(dá)量大，外源蛋白常常以包涵體形式存在。制備VLPs 需要對包涵體復(fù)性，研究者更多的是利用低溫培養(yǎng)，或通過引入分子伴侶蛋白SUMO 的策略促使目的蛋白以可溶性的方式表達(dá)，以便VLPs 的高效組裝。在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中也可以同時表達(dá)多個結(jié)構(gòu)蛋白實現(xiàn)多層蛋白VLPs 的共組裝[10]。由于大腸桿菌內(nèi)沒有與真核細(xì)胞類似的蛋白質(zhì)翻譯后修飾系統(tǒng)，因此不適合用于表達(dá)需經(jīng)翻譯后修飾的形成VLPs 的亞單位蛋白，也不能用于有囊膜VLPs 的生產(chǎn)[10]。值得一提的是，全球首個成功上市的戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)疫苗的抗原就是由大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)其E2 蛋白N 端部分制備的VLPs。

3 動物用VLPs疫苗的研究進(jìn)展

VLPs 具有與天然病毒相似的構(gòu)象表位、可以重復(fù)且高密度展示抗原表位，表現(xiàn)更強(qiáng)的免疫原性，能夠誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答，但又不具有感染性，比減毒活疫苗和滅活苗安全，比其他類型亞單位疫苗更有效。隨著人用的HPV、HBV、H9N2 流感病毒及基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)等的VLPs 疫苗成功上市，用于動物疫病預(yù)防的VLPs 疫苗的研究也不斷取得突破性進(jìn)展。

3.1 口蹄疫的VLPs口蹄疫(Foot and mouth disease，F(xiàn)MD)是由FM 病毒(FMDV)引起的偶蹄動物常發(fā)的一種烈性傳染病，曾多次在世界范圍內(nèi)暴發(fā)，嚴(yán)重威脅家畜安全和國際畜產(chǎn)品貿(mào)易，OIE 將其列為A 類傳染病之首。傳統(tǒng)的滅活疫苗仍是當(dāng)前防控該疫病的主要疫苗。為更好的防控和凈化FMD，近年來，利用基因工程技術(shù)制備針對FMDV 的新型疫苗，如標(biāo)記疫苗、復(fù)合表位肽疫苗、VLPs 疫苗等取得了一定進(jìn)展。其中VLPs 疫苗顯示出良好的應(yīng)用前景。Cao 等較早嘗試了以重組桿狀病毒為載體將O 型和亞洲I 型FMDV 的P1、2A、3C 基因在High Five 昆蟲細(xì)胞中表達(dá)，該幾種蛋白能夠自我組裝形成與親本病毒粒子大小相同的VLPs，具有一定的免疫原性，但免疫豚鼠未能獲得高水平的中和抗體[11]。Li 等同樣在昆蟲細(xì)胞表達(dá)了上述3 個FMDV 結(jié)構(gòu)蛋白并成功組裝了VLPs。以此VLPs 疫苗免疫牛，通過間接免疫熒光和夾心ELISA 檢測到FMDV 特異性抗體，攻毒試驗顯示，該疫苗半數(shù)保護(hù)量(PD50)可達(dá)6.34/ 頭份，超過OIE 規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)(3 PD50/ 頭份)[12]。Mohana 等將O 型FMDV 的P1、2A、3C 連接到pFastBac 表達(dá)載體中，構(gòu)建的重組桿狀病毒在Sf9 細(xì)胞中也能表達(dá)并組裝形成相應(yīng)的VLPs。將該VLPs與ISA206 佐劑混合后免疫牛，經(jīng)兩次免疫后可以檢測到中和抗體，攻毒試驗顯示，該疫苗每頭份合5.01 PD50[13]。利用重組桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)FMD-VLPs 的例子還有很多。這些研究表明，亞洲I 型和O 型FMDV 的P1、2A、3C 蛋白由重組桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)、組裝形成的VLPs 可以作為疫苗。Guo 等也嘗試了利用原核表達(dá)系統(tǒng)組裝FMDV VLPs，研究將亞洲I 型FMDV 的VP1、VP3 和VP0 分別與SUMO 融合使之在大腸桿菌中共表達(dá)，這3個結(jié)構(gòu)蛋白在去除SUMO 基團(tuán)后可以組裝形成VLPs。動物免疫試驗顯示，含50 μg 蛋白的VLPs 單劑量免疫豚鼠、豬和牛即可誘導(dǎo)高水平的免疫應(yīng)答。對牛的攻毒保護(hù)試驗結(jié)果顯示，每頭份含50 μg 蛋白的VLPs 疫苗可達(dá)到6.3 PD50[14]。這項研究表明，利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)FMDV 的結(jié)構(gòu)蛋白，也可以組裝VLPs，并可以做為候選疫苗。除了構(gòu)建由FMDV 自身結(jié)構(gòu)蛋白組裝的VLPs 的外，嵌合VLPs 也是FMDV 疫苗的一個研究方向。有學(xué)者將FMDV 主要保護(hù)性抗原或抗原中的B、T 細(xì)胞表位與其它病毒自組裝成VLPs 的結(jié)構(gòu)蛋白融合表達(dá)使其展示于嵌合VLPs 的表面，在免疫動物時能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生針對FMDV 的特異性免疫應(yīng)答。例如，基于乙肝核心抗原(HBcAg)融合FMDV 全長VP1 組裝成的VLPs，相比可溶性的VP1 蛋白，能夠更有效刺激小鼠產(chǎn)生高水平的T 細(xì)胞增殖和CTL 應(yīng)答，及中和抗體的產(chǎn)生[15]。

為大規(guī)模工業(yè)化制備FMDV 的VLPs，研究者也在做大量的工作。Kumar 等將O 型FMDVIND/R2/75 株的P1-2A-3C 蛋白串聯(lián)，構(gòu)建重組桿狀病毒，將該重組桿狀病毒經(jīng)口或血管腔內(nèi)注射感染蓖麻蠶幼蟲，在感染后3 d～7 d 能夠從幼蟲血淋巴中獲得大量VLPs，且VLPs 產(chǎn)量明顯高于該重組桿狀病毒感染的SF9 細(xì)胞。ELISA 檢測顯示，從蓖麻蠶幼蟲體內(nèi)獲得的VLPs 可以與FMDVIND/R2/75 株的陽性血清反應(yīng)，再用該陽性血清做western blot檢測VLPs，顯示在26 ku、37 ku 和47 ku 處有3 條目的條帶。采用經(jīng)蔗糖密度梯度離心純化的VLPs 免疫兔子和豚鼠，其血清能夠與FMDVIND/R2/75 株抗原發(fā)生反應(yīng)，表明該方法能夠制備具有免疫原性的VLPs。作者認(rèn)為以蓖麻蠶幼蟲為宿主可以大規(guī)模生產(chǎn)FMDV VLPs 疫苗[16]。Xiao 等開發(fā)了大腸桿菌共表達(dá)系統(tǒng)，在同一個質(zhì)粒中串聯(lián)表達(dá)FMDV 的3 個衣殼蛋白VP0、VP1 和VP3，共表達(dá)的FMDV 衣殼蛋白也可以在10 L 的發(fā)酵罐中大規(guī)模生產(chǎn)，利用色譜純化目的蛋白并在體外自組裝形成VLPs。單一劑量FMDV VLP 與佐劑混合后免疫?？梢哉T導(dǎo)牛產(chǎn)生抗FMDV 的ELISA 抗體和中和抗體，抗體持續(xù)期可達(dá)6 個月。該VLP 疫苗可以誘導(dǎo)免疫牛產(chǎn)生較好的保護(hù)作用，PD50可達(dá)到11.75/頭份[17]。

3.2 小反芻獸疫的VLPs 小反芻獸疫(Peste des petits ruminants，PPR)是近年來傳入我國的一種山羊和綿羊急性、烈性、高度接觸性傳染病，由PPR 病毒(PPRV)引起，被我國列入一類動物疫病名錄，OIE 列為A 類烈性傳染病。從事該病原的研究需要生物安全3 級以上的條件設(shè)施。VLPs 技術(shù)為在普通實驗室模擬研究該病原的生物學(xué)特性和疫苗研發(fā)提供了有力工具。F、H 和N 蛋白是PPRV 的主要保護(hù)性抗原，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，常作為VLPs 疫苗的候選抗原，M 蛋白在PPRV VLPs 的組裝過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Wang 等將PPRV 的N、M、H 和F 蛋白在Vero 細(xì)胞中表達(dá)，這4 種蛋白共表達(dá)可以高效的組裝和釋放VLPs，與病毒自然感染形成自帶病毒粒子的效率相當(dāng)。將M 和F 蛋白共表達(dá)也能夠有效組裝和釋放VLPs。但如果無M 蛋白，N、H 和F 單表達(dá)或共表達(dá)均不能組裝和釋放VLPs，這表明M 蛋白對于VLPs 的形成至關(guān)重要[18]。Liu 等根據(jù)昆蟲細(xì)胞密碼子的偏好對M 基因，H 基因進(jìn)行了密碼子的優(yōu)化，并將它們與N 基因一起構(gòu)建重組桿狀病毒。Western blot 等方法檢測到重組桿狀病毒在昆蟲細(xì)胞中共表達(dá)這3 種結(jié)構(gòu)蛋白，透射電鏡觀察到VLPs 穿過細(xì)胞膜的出芽過程，純化后的該VPLs 在形態(tài)學(xué)上與親本病毒相似，但粒徑較小[19]。他們還將M蛋白和N 蛋白利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在昆蟲中表達(dá)，組裝出了VLPs，該VLPs 的粒徑與由3 種結(jié)構(gòu)蛋白形成的VLPs 類似，在100 nm～150 nm，均明顯小于親本病毒的粒徑(400 nm～500 nm)[20]。以由M、H 和N 蛋白組裝的VLPs 免疫小鼠2 次，所有免疫小鼠的血清中均可以檢測到PPRV 特異性的中和抗體[21]。Li 等對由M、H 和N 蛋白組裝的VLPs 進(jìn)行了小鼠和山羊的免疫試驗，結(jié)果顯示，皮下注射VLPs 能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生PPRV 特異性的IgG 和高水平的中和抗體。該VLPs 在不加佐劑單獨免疫的情況下與相同劑量的PPRV 弱毒疫苗具有相當(dāng)?shù)拿庖咝Ч＿@項研究也提示，VLPs 作為PPRV 疫苗的候選抗原，在凈化該疫病時還具有能夠區(qū)分血清學(xué)陽性動物為野毒感染或疫苗免疫的潛力[22]。

3.3 豬繁殖與呼吸綜合征的VLPs 我國于2006年暴發(fā)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome，HP-PRRS)，其感染率和死亡率極高，給養(yǎng)豬業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。PRRSV變異較快，傳統(tǒng)疫苗對其保護(hù)性較差，尤其是滅活苗誘導(dǎo)低效價中和抗體時，會發(fā)生抗體依賴作用，反而感染程度增強(qiáng)。弱毒苗對HP-PRRSV 保護(hù)作用較好，但存在散毒和毒力返強(qiáng)等潛在的缺陷。因此VLPs 可以作為安全有效的PRRSV 新型疫苗的一個發(fā)展方向。

Nam 等將PRRSV 的GP5 和M 蛋白利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功制備出VLPs，以純化后的VLPs 免疫Balb/c小鼠，結(jié)果顯示該VLPs 可以刺激機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫，顯著上調(diào)IL-4、IL-10、INF-γ 的表達(dá)，4.0 μg VLPs的免疫劑量誘導(dǎo)INF-γ 產(chǎn)生的水平顯著高于商品化的疫苗對照，在免疫2.0 μg 和4.0 μg VLPs 的小鼠體內(nèi)檢測到中和抗體[23]。Binjawadagi 等利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建了包含PRRSV 表面蛋白GP5-GP4-GP3-GP2a-M 或GP5-M 的PRRS-VLPs。為了增強(qiáng)免疫原性，將制備的VLPs 與PLGA 納米顆?；旌希⑴c佐劑一起經(jīng)鼻免疫豬。結(jié)果顯示，PRRS-VLPs 能夠誘導(dǎo)免疫豬產(chǎn)生高水平的IgG 和IFN-γ，免疫豬攻毒后體內(nèi)IgG 和IFN-γ 水平會再次顯著上升，并且PRRSV 在免疫豬肺臟中的載量較對照組低2個數(shù)量級，表明PRRS-VLPs 不僅能夠誘導(dǎo)記憶性免疫反應(yīng)，還具有很好的免疫保護(hù)效果[24]。也有學(xué)者嘗試將PRRSV 的保護(hù)性抗原表位插入到其它病毒的結(jié)構(gòu)蛋白中構(gòu)建嵌合型的VLPs 疫苗。例如以H3N2 豬流感病毒(SIV)結(jié)構(gòu)蛋白HA、M1、NA 為基礎(chǔ)制備VPLs，融合PRRSV的GP5 構(gòu)建的H3N2-PRRS 嵌合VPLs 能夠誘導(dǎo)針對H3N2 SIV 和PRRSV 的免疫應(yīng)答[25]。利用HBV 核心抗原(HBcAg)融合PRRSV 的B 細(xì)胞、T 細(xì)胞表位，在大腸桿菌中也制備了嵌合VLPs，其免疫效果尚需進(jìn)一步評價[26]。

3.4 豬圓環(huán)病毒2 型VLPs 豬圓環(huán)病毒2 型(Porcine Circovirus 2，PCV2)在我國豬群中感染比較普遍，主要引起免疫抑制，與其它病原混合感染時，可能會導(dǎo)致豬群大規(guī)模發(fā)病。PCV2 是一種小型無包膜的單股正鏈環(huán)狀DNA病毒，結(jié)構(gòu)簡單，基因組含3 個主要的開放閱讀框(ORFs)，其中ORF2 編碼核衣殼蛋白(Cap 蛋白)。Cap 蛋白是組成PCV2 病毒粒子的唯一結(jié)構(gòu)蛋白，也是該病毒的保護(hù)性抗原蛋白。針對Cap 蛋白已經(jīng)制備了多種PCV2 亞單位疫苗用于該病的預(yù)防。勃林格殷格翰以Cap 蛋白開發(fā)的PCV2 VLPs 疫苗已經(jīng)與2013年批準(zhǔn)上市，商品名為PCV2 桿狀病毒載體滅活疫苗Ingelvac CircoFLEX?，也是首個用于動物疫病預(yù)防的VLPs 疫苗。該疫苗以桿狀病毒為表達(dá)載體，用昆蟲細(xì)胞表達(dá)的Cap 蛋白自組裝形成VLPs。

目前，以桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備PCV2 VLPs 的技術(shù)已經(jīng)比較成熟，抗原的免疫效果也很好。為了進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本，研究者也在不斷嘗試用原核表達(dá)系統(tǒng)來制備PCV2 VLPs。Yin 等將完整PCV2 ORF2 與SUMO 融合構(gòu)建了原核表達(dá)載體，實現(xiàn)Cap 在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)，電鏡觀察重組Cap 蛋白能夠自我組裝形成直徑17 nm的VLPs[27]。研究表明，在原核系統(tǒng)中，Cap 蛋白N 端核定位區(qū)(NLS)、二聚體結(jié)構(gòu)形成有關(guān)的中間部分以及Cys108 對VLPs 的組裝至關(guān)重要。如果編碼Cap 蛋白的基因N 端缺失或者二聚化功能域缺失及Cys108 位氨基酸突變均會影響VLPs 的組裝[28]。Wu 等將密碼子優(yōu)化的PCV2 ORF2 全長插入表達(dá)載體pET-24a 中，在E.coliBL21 (DE3)誘導(dǎo)表達(dá)，重組Cap 蛋白的產(chǎn)量可達(dá)250 μg/mL，且能夠在體外組裝成直徑25 nm～30 nm 的VLPs，用該VLPs 免疫能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生中和抗體和細(xì)胞免疫應(yīng)答[29]。原核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點在于操作簡易，成本低廉。用該系統(tǒng)制備PCV2 或其它病原的VLPs，將較大降低VLPs 疫苗的制備成本，提高疫苗的產(chǎn)量和生產(chǎn)效率。

3.5 其他重要動物疫病的VLPs 豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus，PPV)是造成妊娠母豬繁殖障礙的病原微生物之一。Ji 等利用原核系統(tǒng)表達(dá)PPV 完整的VP2 蛋白，成功獲得了VLPs。所獲得的VLPs 具有與PPV 相似的大小，形狀和血細(xì)胞凝集特性。用這些VLPs 免疫可刺激小鼠和豚鼠產(chǎn)生中和抗體。在免疫的豚鼠中也能夠誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)和細(xì)胞因子分泌，效果與用PPV 滅活疫苗免疫的豚鼠相當(dāng)。此外，攻毒試驗顯示用VLPs 免疫也可以顯著降低豚鼠脾臟中的PPV 含量[30]。高致病性禽流感(Highly pathogenic avian influenza，HPAI)和新城疫(New castle disease，ND)是最具破壞力的家禽傳染病，由HPAIV 和NDV 引起。研究者將H5N1 HPAIV 的M1 蛋白以及血凝素(HA)的胞質(zhì)區(qū)和跨膜區(qū)與NDV 的F 蛋白的胞外區(qū)融合表達(dá)，獲得的重組蛋白可以自組裝形成嵌合VLPs。用嵌合VLPs 單次免疫雞可誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的HA 特異性抗體，也能檢測到抗NDV 的抗體，并對雞隨后的HPAIV 和NDV 感染具有保護(hù)作用[31]。裂谷熱(Rift Valley fever，RVF)是由RVF 病毒(RVFV)引起的，由節(jié)肢動物傳播的急性發(fā)熱性人畜共患疾病，在非洲和阿拉伯半島盛行，并造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。利用桿狀病毒pFastBacDual 表達(dá)系統(tǒng)，將RVFV 的N 和G 蛋白在Sf9 昆蟲細(xì)胞中共表達(dá)，獲得了RVFV VLPs。透射電鏡顯示RVFV VLPs 的形態(tài)與RVFV 粒子一致，且具有一定的免疫原性，這為未來基于VLPs 的RVFV 疫苗研究奠定了基礎(chǔ)[32]。藍(lán)舌病毒(Bluetongue virus，BTV)是小反芻動物藍(lán)舌病的病原，具有多種血清型。Stewart 等利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)組裝出BTV血清型8 (BTV-8)的VLPs，用BTV-8 VLPs 免疫阿爾卑斯山羊可產(chǎn)生BTV-8 特異性中和抗體，用BTV-8 強(qiáng)毒株攻毒，所有接種VLPs 的動物都沒有BT 或病毒血癥的臨床表現(xiàn)，這表明BTV VLPs 是安全有效的免疫原[33]。

4 展 望

VLPs 的結(jié)構(gòu)特征使其能夠有效刺激機(jī)體產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，免疫原性優(yōu)于未正確折疊和修飾的可溶性重組亞單位疫苗。與減毒活疫苗相比，VLPs 不表達(dá)調(diào)控宿主免疫機(jī)能的病毒蛋白，不存在散毒和毒力返強(qiáng)的潛在風(fēng)險，生物安全性好。與滅活疫苗相比，其生產(chǎn)工藝簡單，成本更低。這些優(yōu)勢使得VLPs 成為開發(fā)新型疫苗的熱點和趨勢。許多動物病毒的VLPs 也已經(jīng)作為一個開放的平臺，通過融合異源抗原表位基因，將抗原整合至VLPs 用于多價疫苗研制。另外，VLPs 作為診斷用抗原和小分子藥物投遞方面也顯示出了廣闊的應(yīng)用前景[34]。相信隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步和研究的不斷深入，將會有更多新型獸用VLPs 疫苗成功上市并投入應(yīng)用，VLPs 作為有效的重組疫苗平臺，其發(fā)展也會日趨成熟。