海南牛乳源鏈球菌的分離鑒定及特性分析

王 宇，郭桂英，張智勇，秦 燁，蒲文淵，楊 諾，李 遷，曾紀(jì)鋒*，鄭繼平*

(1.海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院/ 海南大學(xué)教務(wù)處/ 海南大學(xué)網(wǎng)絡(luò)與技術(shù)中心，海南?？?70228；2.海南艾森乳業(yè)有限公司，海南澄邁571925)

奶牛乳房炎(Mastitis)是一種全球性的奶牛疾病，可分為臨床型乳房炎和隱性乳房炎。其中隱性乳房炎占乳房炎70 %以上，常導(dǎo)致牛奶產(chǎn)量和質(zhì)量下降，造成奶牛養(yǎng)殖業(yè)的重大經(jīng)濟(jì)損失[1]。引起奶牛乳房炎的因素復(fù)雜多樣，其中鏈球菌(Streptococcus)的感染極為重要[2]，其主要種類有無乳鏈球菌(S.agalactiae)、乳房鏈球菌(S.uberis)及停乳鏈球菌(S.dysgalactiae)等。近年來，由于無乳鏈球菌對人、魚、牛的嚴(yán)重危害而倍受重視[3-4]；但對乳房鏈球菌的研究仍不深入，對其毒力因子、致病機(jī)理和耐藥機(jī)制等方面仍知之甚少。合理使用抗生素是治療奶牛乳房炎的有效手段，但定期篩查病原菌的耐藥性仍然是奶牛乳房炎防治措施中重要的一環(huán)。

海南地區(qū)屬亞熱帶島嶼，氣候條件高溫多濕，與大陸的天然隔斷使該地區(qū)病原具有其獨(dú)特性，因此對海南地區(qū)牛源鏈球菌的研究具有重要意義。本研究對海南澄邁地區(qū)某奶牛場牛源鏈球菌進(jìn)行分離鑒定，并進(jìn)行耐藥性分析和毒力因子的檢測，為海南地區(qū)鏈球菌引發(fā)奶牛乳房炎的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 腦心浸出液(BHI)培養(yǎng)基購自英國OXIOD 公司、鏈球菌顯色培養(yǎng)基購自法國Chromagar 公司；細(xì)菌生化微量鑒定管和藥敏紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司；2×A8 Fast HiFi PCR Master Mix、DL2000 DNA Marker、PCR 產(chǎn)物純化回收試劑盒，購自北京艾德萊生物科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒(Bacterial DNA Isolation Kit)， 購自北京華越洋生物科技有限公司；金黃色葡萄球(Staphylococcusaureus)ATCC25923 購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；乳質(zhì)體細(xì)胞測定儀，購自Dairy Quality 公司。

1.2 乳樣來源及采集方法 2017年12 月，從海南澄邁地區(qū)1 個奶牛場抽樣采集了67 頭奶牛的乳樣。67 頭泌乳奶牛均臨床健康，無乳腺炎臨床癥狀，但乳汁經(jīng)乳質(zhì)體細(xì)胞測定儀檢測，體細(xì)胞數(shù)(SCC)均高于50×104個/mL，初步判斷奶?；加须[性乳房炎。采樣時先用清水清洗奶牛乳頭，再用碘伏消毒，最后用滅菌毛巾擦干，每頭奶牛采集乳汁5 mL(舍棄頭兩把乳)裝于無菌EP 管中，樣品低溫存儲送回實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。

1.3 細(xì)菌的分離與純化 利用鏈球菌顯色培養(yǎng)基接種乳樣，培養(yǎng)出來的單菌落革蘭氏染色鏡檢后對分離到的鏈球菌編號，并記錄菌株分離時間、分離地點(diǎn)等。

1.4 分離菌生化鑒定和分子鑒定 根據(jù)初步分離純化結(jié)果，對革蘭氏染色為鏈球狀的菌株做進(jìn)一步的生化鑒定，依據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》 確定鏈球狀菌所屬的種。按照細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒的說明書，提取細(xì)菌基因組DNA，采用細(xì)菌16S rRNA 通用引物(27F： 5'-AGAGTTTGATCCTGGCT CAG-3'/1429R： 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')；PCR 擴(kuò)增其16S rRNA 基因。擴(kuò)增程序：94 ℃3 min；93 ℃30 s、54 ℃30 s、72 ℃1 min，30 個循環(huán)；72 ℃10 min。PCR 產(chǎn)物純化后由北京六合華大基因科技有限公司測序，對測序結(jié)果進(jìn)行BLAST 分析，并使用MEGA6.05 構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 分離菌的藥敏試驗(yàn) 按照Kirby-Bauer(K-B)紙片擴(kuò)散法對分離菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，以金黃色葡萄球菌ATCC25923 為藥敏質(zhì)控菌株，參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(NCCLS2017)推薦標(biāo)準(zhǔn)判斷分離菌的抑菌結(jié)果。

1.6 分離菌的毒力基因檢測 參考文獻(xiàn)[5-9]中引物及方法， PCR 擴(kuò)增分離的乳房鏈球菌的11 種毒力基因。11 種毒力基因分別為：透明質(zhì)酸莢膜基因(hasA/hasB/hasC)、 纖溶酶原激活物蛋白基因(pauA/skc)、表面脫氫酶蛋白基因(gapC)、CAMP 因子基因(cfu)、乳鐵蛋白結(jié)合蛋白基因(lbp)、細(xì)菌肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(oppF)、一種脂蛋白受體抗原基因(mtuA)、粘附蛋白基因(sua)。引物由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

2 結(jié)果與討論

2.1 分離菌的形態(tài)特征 從67 份乳樣中共分離到20 株鏈球菌，其中16 株在BHI 瓊脂培養(yǎng)基上形成直徑約1 mm，隆起，圓形，邊緣整齊且閃光的菌落，顯微鏡觀察菌體形態(tài)為長鏈狀(圖1)，將其命名為U1～U16；另外4 株菌在BHI 瓊脂培養(yǎng)基上形成直徑約1.5 mm，隆起，圓形呈露珠狀的菌落，顯微鏡觀察菌體形態(tài)為短鏈狀(圖1)，將其命名為P1～P4。

2.2 分離菌的生化鑒定結(jié)果 分離菌染色鏡檢結(jié)果顯示為鏈球狀，且觸酶試驗(yàn)為陰性，則鑒定分離菌為鏈球菌。根據(jù)生理生化反應(yīng)結(jié)果，依據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》可認(rèn)定16 株長鏈鏈球菌符合乳房鏈球菌的生理生化特性，4 株短鏈鏈球菌符合巴氏鏈球菌(S.pasteurianus)的生理生化特性見表1。

圖1 分離菌形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of Streptococcus isolates

表1 分離菌的生理生化鑒定Table 1 Physiological and biochemical test of the isolates

2.3 分離菌16S rRNA 基因的PCR 擴(kuò)增及進(jìn)化分析 對上述鏈球菌16S rRNA 基因的PCR 擴(kuò)增結(jié)果顯示在約1 500 bp 處有目的條帶。PCR 產(chǎn)物純化測序后經(jīng)Blast 比對顯示，16 株長鏈鏈球菌與乳房鏈球菌的同源性≥98 %，4 株短鏈鏈球菌與巴氏鏈球菌的同源性≥98 %。采用16S rRNA 基因序列繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示分離菌與乳房鏈球菌的親緣關(guān)系最近(圖2)，進(jìn)一步表明分離株為乳房鏈球菌。因本次是針對引起海南奶牛乳房炎鏈球菌的調(diào)查分析，巴氏鏈球菌并不能引起奶牛乳房炎，而且該菌以前被稱為2 型牛鏈球菌[10]，是許多草食動物胃腸道內(nèi)的一種無害細(xì)菌，所以不對巴氏鏈球菌的特性進(jìn)行分析。

圖2 乳房鏈球菌16S rRNA 的進(jìn)化樹Fig.2 Cladogram of S.uberis based on 16S rRNA gene sequences

2.4 分離菌毒力基因鑒定結(jié)果 對分離的乳房鏈球菌11 種毒力基因的PCR 鑒定結(jié)果顯示除lbp基因(31.25 %，5/16)外，hasA、hasB、hasC、mtuA、gapC、sua、pauA、skc、oppF、cfu基因的發(fā)生頻率均為100 %。在以往報道中[11-13]，乳房鏈球菌個別毒力因子高頻發(fā)生，但大規(guī)模毒力因子同時高頻發(fā)生的現(xiàn)象并未見報道。本次研究結(jié)果顯示海南的乳房鏈球菌，不僅有10 種毒力因子發(fā)生頻率高達(dá)100%，而且毒力模式罕見，與國內(nèi)外報道顯著不同[11-14]。目前國內(nèi)研究鏈球菌的毒力因子主要以豬鏈球菌(S.suis)、無乳鏈球菌(S.agalactiae)、副肺炎鏈球菌(S.paraubueris)為主，少有乳房鏈球菌毒力因子的研究，結(jié)果也并不夠精確。在國外對于核苷酸和氨基酸水平高度保守的毒力基因gapC、sua、pauA、skc被認(rèn)為是開發(fā)疫苗的良好靶標(biāo)[8,15-16]。對于猜測與乳房炎發(fā)病機(jī)制和感染有關(guān)的hasA、hasB、hasC、oppF、mtuA 基因，在不同地區(qū)與乳房炎相關(guān)的分離菌株中這些基因的發(fā)生頻率會明顯升高，個別基因發(fā)生頻率可達(dá)100 %。對于乳房鏈球菌生長非必須的cfu、lbp基因，其范圍可從波蘭[12]的lbp(0)和cfu(19 %)到泰國[11]的lbp(78.41 %)、印度[13]的cfu(85.7 %)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示無論是保守的毒力基因還是與發(fā)病相關(guān)的毒力基因均100 %存在，且與生長無關(guān)的cfu基因也高頻發(fā)生，這樣的毒力模式非常少見，為國內(nèi)外首次報道。乳房鏈球菌存在如此全面的毒力因子，表明奶牛場中存在一些強(qiáng)毒力和高度傳播的乳房鏈球菌優(yōu)勢菌株，也許這些優(yōu)勢菌株借助其毒力基因，逃避或減弱宿主的免疫應(yīng)答，從而增強(qiáng)其在宿主的存活率，提高對奶牛的感染率。目前研究不能解釋奶牛乳房炎的發(fā)生與其毒力因子之間的相關(guān)性；但在乳房鏈球菌的人工致病試驗(yàn)中，證明菌株的毒力比接種劑量更重要[17]；已有的研究表明，某些在毒力方面具有優(yōu)勢的乳房鏈球菌比其它菌株更易在奶牛中生長以及侵入其乳腺上皮細(xì)胞[18]。本次海南奶牛乳腺鏈球菌的感染調(diào)查表明乳房鏈球菌是奶牛乳腺感染的主要菌種，而非經(jīng)常報道的無乳鏈球菌，推測與乳房鏈球菌毒力因子發(fā)生頻率的獨(dú)特性有關(guān)。在后續(xù)調(diào)查研究中，本研究將擴(kuò)大對該菌在海南不同地區(qū)的流行病學(xué)調(diào)查，以便更進(jìn)一步證實(shí)以上推測。

2.5 分離菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果 青霉素G 等β- 內(nèi)酰胺類抗生素是奶牛場防治鏈球菌感染的常用藥物。本次從奶樣中分離得到的乳房鏈球菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素(青霉素類、頭孢菌素類)仍然具有高度敏感性。此外本次分離得到的乳房鏈球菌對氨基糖苷類、四環(huán)素類、多肽類、利福霉素類抗生素的耐藥率較高(18.5 %～50 %)；特別是對鏈霉素、大觀霉素、四環(huán)素的耐藥率高達(dá)31.25 %～50 %，其次是慶大霉素、利福平等。對于乳房鏈球菌的多重耐藥菌株，其中3 重耐藥的菌株有4 株，其次為2 重耐藥(3 株)和4 重耐藥(2 株)，甚至各檢測出1 株乳房鏈球菌出現(xiàn)了5 重耐藥和6 重耐藥的現(xiàn)象。雖然調(diào)查結(jié)果顯示多重耐藥菌株達(dá)68.75 %，但菌株依然對β- 內(nèi)酰胺類藥物、磺胺類藥物具有100 %敏感性。因此，牛場在用藥治療時可以根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，選擇有效的抗菌藥物，合理或交替使用，以減少耐藥菌株的出現(xiàn)。其藥敏結(jié)果詳見表2。

總之，本研究結(jié)果表明，乳房鏈球菌是本次奶牛乳腺鏈球菌感染調(diào)查的主要鏈球菌，同時該菌具有多重耐藥性且毒力因子發(fā)生頻率獨(dú)特。調(diào)查結(jié)果為海南牛源鏈球菌的防治提供依據(jù)；牛場在乳腺鏈球菌感染用藥防治時要參照藥敏結(jié)果，選擇有效藥物治療，同時奶牛的合理飼養(yǎng)和管理也必不可少。

表2 乳房鏈球菌的藥敏試驗(yàn)Table 2 Drug sensitivity test of the S.uberis