甲基苯丙胺與HIV-1Tat蛋白協(xié)同誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬的研究進(jìn)展

黃 儉，李 娟，楊根夢，李媛媛，劉 柳，沈?qū)氂瘢鴷凿h，李 楨

(昆明醫(yī)科大學(xué)1. 法醫(yī)學(xué)院法醫(yī)毒理學(xué)教研室、2. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)系，云南 昆明 650500)

甲基苯丙胺(methamphetamine，METH)是當(dāng)今世界最流行的新型毒品，其具有中樞興奮性、精神依賴性、神經(jīng)毒性等危害[1]。研究發(fā)現(xiàn)，METH誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞自噬在其神經(jīng)毒性中起重要作用[2-4]。人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)是引發(fā)獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immune deficiency syndrome，AIDS)的“罪魁禍?zhǔn)住?，病毒可感染中樞神?jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致艾滋病相關(guān)神經(jīng)認(rèn)知障礙(HIV-associated neurocognitive disorders，HANDs)，此過程涉及HIV-1Tat蛋白參與[5]。HIV-1Tat蛋白是反式轉(zhuǎn)錄激活因子，由HIV-1基因編碼，其能激活HIV轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)HIV復(fù)制。感染了HIV-1的T細(xì)胞及單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞可分泌大量HIV-1Tat蛋白，參與調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞自噬，引起神經(jīng)毒性[6-8]。

METH濫用極大地增加了HIV感染風(fēng)險，同時加重HIV誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性。HIV感染者濫用METH時，罹患HANDs的機率明顯增高[5,9-10]。HIV-1Tat蛋白同樣可加重METH誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性[9]。METH與HIV-1Tat蛋白不僅具有相互作用，兩者還具有明顯的協(xié)同神經(jīng)毒性作用[5,9,11-12]，且自噬在其中“扮演”著重要角色。因此，本文將綜述近年來兩者誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬的研究進(jìn)展，探討兩者與自噬的關(guān)系，為研發(fā)新的治療藥物提供參考。

1 細(xì)胞自噬

自噬是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)衍生的囊泡包裹異常蛋白及細(xì)胞器，形成自噬小體，并轉(zhuǎn)運至溶酶體降解的過程，其分為分子伴侶介導(dǎo)自噬、微自噬、巨自噬三類。不同自噬的生物學(xué)功能不同，激活自噬溶酶體降解途徑的方式也不盡相同。巨自噬即為通常意義的自噬，受自噬相關(guān)基因(autophagy relative gene，ATG)調(diào)控。其中，Atg8是LC3同源體，LC3-Ⅱ能與熒光蛋白融合，并在細(xì)胞膜上定位，因此，LC3-Ⅱ可作為自噬的標(biāo)記蛋白。此外，自噬泡(autophagic vacuoles，AVs)的形成也標(biāo)志著自噬的出現(xiàn)。細(xì)胞正常的生長發(fā)育、新陳代謝需要自噬參與，但在損傷、應(yīng)激或營養(yǎng)匱乏等壓力情況下，自噬同樣存在。其可非選擇性地降解蛋白質(zhì)、回收氨基酸，以維持細(xì)胞在營養(yǎng)缺乏時生存，也可選擇性消除異常蛋白及受損細(xì)胞器，利于細(xì)胞適應(yīng)損傷[13]。然而，自噬過度激活將導(dǎo)致細(xì)胞死亡[11]。

2 METH誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬的機制

使用不同濃度METH(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mmol·L-1)處理SH-SY5Y細(xì)胞，隨著METH濃度的增加，細(xì)胞LC3-Ⅱ表達(dá)水平逐漸升高[4]。樹鼩原代中腦神經(jīng)元經(jīng)0.5 mmol·L-1METH處理24 h后，LC3-Ⅱ表達(dá)水平明顯升高[5]。PC12細(xì)胞經(jīng)1.5 mmol·L-1METH處理后，LC3-I/II表達(dá)水平升高，同時出現(xiàn)大量AVs[3]。Xu等[2]使用METH處理SH-SY5Y細(xì)胞及原代紋狀體神經(jīng)元后，同樣觀察到自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC3-Ⅰ/Ⅱ表達(dá)水平升高。在METH誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬中，活性氧(reactive oxygen species, ROS)、mTOR、Beclin-1、Atg5、Atg7、miRNA等起關(guān)鍵作用。

2.1 ROS與METH誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬ROS是有氧代謝副產(chǎn)物，包括超氧陰離子(O2-·)、羥自由基(·OH)、過氧化氫(H2O2)等。在機體氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)相互作用下，多余ROS會被及時清除。但當(dāng)機體抗氧化系統(tǒng)功能減弱或ROS大量增加時，就會出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷。METH可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量ROS[3,10,12,14]，同時抑制谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性[10]。ROS可調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞自噬，使用抗氧化劑“對抗”ROS后，METH誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞及大鼠紋狀體自噬明顯減弱[10]。ROS誘導(dǎo)自噬是通過介導(dǎo)自噬過程中多個信號通路實現(xiàn)的。METH誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，繼而通過凋亡和自噬誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞死亡[10,14]。

2.2 mTOR與METH誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬mTOR是一種自噬的負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白，是調(diào)控自噬的關(guān)鍵分子[14]。楊根夢等[4]在研究METH誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞自噬中，發(fā)現(xiàn)METH抑制了p-mTOR和p-Akt表達(dá)；而使用天麻素處理后，LC3-Ⅱ和Beclin-1表達(dá)水平降低，mTOR、p-mTOR、Akt、p-Akt表達(dá)水平升高?？梢奙ETH通過抑制p-Akt/p-mTOR信號通路，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬[2,4]。Li等[3]使用METH誘導(dǎo)PC12細(xì)胞自噬，發(fā)現(xiàn)p-mTOR表達(dá)水平降低，LC3-Ⅱ則升高，其具有METH劑量依賴性。此外，mTOR還參與METH誘導(dǎo)的人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬[13]。

2.3 Beclin-1與METH誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬Beclin-1與酵母Atg6同源，在AVs形成時，Beclin-1結(jié)合PI3K可利于自噬小體的形成[13]。而Beclin-1結(jié)合抗凋亡蛋白Bcl-2時，Beclin-1與PI3K的結(jié)合力減弱，起抗自噬作用[14]。研究表明，METH可通過Bcl-2/Beclin-1及JNK1通路，調(diào)控SK-N-SH多巴胺能細(xì)胞自噬[14]。2 mmol·L-1METH處理SH-SY5Y細(xì)胞8 h后，Beclin-1表達(dá)水平達(dá)到峰值[2]。Beclin-1位于自噬信號通路的下游，抑制mTOR可活化Beclin-1，進(jìn)而促進(jìn)自噬。Ma等[13]發(fā)現(xiàn)，METH通過抑制Akt/mTOR/p70S6K通路及活化ERK1/2通路，誘導(dǎo)Beclin-1、LC3表達(dá)水平增加?？梢夿eclin-1在自噬中起正性調(diào)節(jié)作用，它的積累可作為自噬誘導(dǎo)的指示器[13]。

2.4 Atg5、Atg7與METH誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬Atg5、Atg7是調(diào)控細(xì)胞自噬的兩個重要基因，兩者編碼的蛋白質(zhì)Atg5、Atg7可直接參與自噬過程。Atg5不僅可與Atg12、Atg16L1形成復(fù)合體，并結(jié)合于AVs外膜，促進(jìn)AVs的延伸，還能調(diào)節(jié)溶酶體再生及Atg8招募。Atg7是一種泛素樣激酶E1連接酶，其能識別Atg3和Atg10，并將它們分別轉(zhuǎn)運到LC3-Ⅱ和Atg12上，使之連接。SVGA細(xì)胞經(jīng)1 mmol·L-1METH處理24 h后，Atg5、Atg7表達(dá)水平均升高；提前使用siRNA技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，LC3-Ⅱ表達(dá)水平明顯下降[15]，提示Atg5、Atg7參與調(diào)控METH誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬。Li等[5]發(fā)現(xiàn)，0.5 mmol·L-1METH可誘導(dǎo)樹鼩原代中腦神經(jīng)元自噬，伴隨Atg5、Atg7表達(dá)水平明顯升高。此外，嗎啡可引起Atg5、Atg7依賴性的多巴胺能神經(jīng)元自噬，導(dǎo)致神經(jīng)元樹突棘減少和成癮行為的發(fā)生[16]?？煽ㄒ蚪閷?dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬涉及Atg5、Atg7參與，并誘導(dǎo)Ⅱ型細(xì)胞程序性死亡[17]。

2.5 miRNA與METH誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬miRNA是真核生物體內(nèi)一種小非編碼RNA，其可抑制基因轉(zhuǎn)錄或與靶mRNA結(jié)合促進(jìn)其降解，起調(diào)控基因表達(dá)作用。已有文獻(xiàn)報道，miRNA可參與調(diào)控METH成癮及神經(jīng)毒性[1]。近年來研究表明，miRNA還可對細(xì)胞自噬進(jìn)行調(diào)控。Zhang等[18]使用慢病毒(含抗Mir143)轉(zhuǎn)染經(jīng)METH處理的原代小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)LC3-Ⅱ表達(dá)水平明顯升高。顯微注射慢病毒(含抗miR143)到C57BL/6J小鼠的海馬區(qū)后，實驗結(jié)果相同[18]。miR143可參與METH誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞自噬，且通過細(xì)胞凋亡和自噬的相互作用，調(diào)節(jié)METH的神經(jīng)毒性[18]。

3 HIV-1Tat蛋白誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬的機制

HIV感染可改變中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自噬功能，其中Tat蛋白起關(guān)鍵作用。使用不同濃度Tat蛋白(10、50、100 nmol·L-1)處理C57BL/6J小鼠，Beclin-1表達(dá)水平呈劑量依賴性升高[8]。Bruno等[19]使用不同濃度的pDC515質(zhì)粒(表達(dá)完整的Tat蛋白)轉(zhuǎn)染U87MG、A-172膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞及正常的人類星形膠質(zhì)細(xì)胞后，細(xì)胞均出現(xiàn)自噬現(xiàn)象。此外，Tat蛋白可促進(jìn)自噬小體與溶酶體融合[6]。

3.1 ROS與HIV-1Tat蛋白誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬Tat蛋白可通過氧化應(yīng)激損傷產(chǎn)生大量ROS，繼而通過mTOR活性誘導(dǎo)細(xì)胞自噬[10]。Youn等[20]使用重組Tat處理CRT-MG人類星形膠質(zhì)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)NADPH氧化酶活化，并聚集了大量ROS。Mediouni等[9]認(rèn)為，Tat蛋白產(chǎn)生ROS可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞活性喪失。Mastrantonio等[21]使用Tat蛋白處理人SH-SY5Y細(xì)胞，檢測到精胺氧化酶(spermine oxidase，SMO)活性升高，并導(dǎo)致ROS生成增多。此外，Tat蛋白能自由穿透神經(jīng)細(xì)胞膜，增加大腦、腦脊液中蛋白和脂質(zhì)過氧化水平，導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷，產(chǎn)生大量ROS[10]。推測Tat蛋白誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，進(jìn)而介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬。

3.2 mTOR與HIV-1Tat蛋白誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬mTOR可調(diào)控HIV在細(xì)胞內(nèi)的潛伏期，從而調(diào)節(jié)HIV復(fù)制，而HIV也可增強mTOR活性。在HIV-1攜帶者及陽性感染者細(xì)胞中，沉默mTOR復(fù)合物的亞基或藥物抑制mTOR活性時，均可縮減HIV病毒的潛伏期、抑制HIV復(fù)制[22]，這些過程涉及Tat蛋白參與。提示在Tat蛋白激活HIV轉(zhuǎn)錄、促進(jìn)HIV復(fù)制、誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬及引起神經(jīng)毒性中，mTOR發(fā)揮重要作用。樹鼩原代中腦神經(jīng)元經(jīng)100 nmol·L-1Tat蛋白處理24 h后，與對照組相比，p-mTOR與非磷酸化形式的mTOR蛋白的比值明顯下降[5]。提示mTOR可調(diào)控Tat蛋白誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬。

3.3 Beclin-1、Atg5、Atg7、BAG3與HIV-1Tat蛋白誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬研究表明，Tat蛋白誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬涉及Beclin-1的參與，沉默Beclin-1可阻斷自噬的發(fā)生[8]。Atg5、Atg7與Tat蛋白誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞自噬關(guān)系密切。Hui等[7]研究了Tat蛋白誘導(dǎo)原代海馬神經(jīng)元產(chǎn)生自噬的程度，經(jīng)100 nmol·L-1Tat蛋白處理后，Atg5表達(dá)水平下降。而合用Tat蛋白與嗎啡處理人類原代神經(jīng)細(xì)胞后，Beclin-1、Atg5及Atg7的表達(dá)水平均升高，神經(jīng)細(xì)胞的自噬現(xiàn)象增強，且均具有Tat蛋白濃度依賴性的特點[23]。由此可見，Tat蛋白可通過Beclin-1、Atg5及Atg7信號途徑，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬。BAG3是一種抗凋亡、促自噬蛋白[19]。BAG3抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的同時，可促進(jìn)其自噬。在HANDs病理改變中，Tat蛋白可通過NF-κB信號途徑增加BAG3表達(dá)，從而促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞自噬[24]。Bruno等[19]發(fā)現(xiàn)，Tat蛋白作用于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，導(dǎo)致BAG3蛋白表達(dá)水平升高，且其與神經(jīng)細(xì)胞自噬有關(guān)，沉默BAG3后，Tat蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬水平下降。提示Tat蛋白通過BAG3誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬。

3.4 溶酶體與HIV-1Tat蛋白誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬Tat蛋白能作用于溶酶體，調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞自噬[6-7]。使用重組Tat處理B103大鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞及原代大鼠神經(jīng)細(xì)胞后，通過共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞質(zhì)中，Tat蛋白與LC3或組織蛋白酶D在同一位置同時表達(dá)[6]。提示Tat蛋白可與自噬小體結(jié)合，且能參與溶酶體代謝。使用GFAP-Tat轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)一步研究Tat蛋白與溶酶體的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)Tat蛋白也可與溶酶體相關(guān)膜蛋白2A(lysosomethl associated membrane protein，LAMP2A)結(jié)合[6]。因此，Tat蛋白可作為“連接點”，一方面結(jié)合自噬小體，另一方面通過LAMP2A結(jié)合溶酶體，最終誘導(dǎo)自噬小體與溶酶體融合[6]。此外，Tat蛋白處理大鼠海馬原代神經(jīng)細(xì)胞后，溶酶體形態(tài)結(jié)構(gòu)改變(體積增大、膜完整性變化)及功能受損(相關(guān)酶活性下降，伴有pH升高)，提示Tat蛋白通過溶酶體調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞自噬[7]。

4 METH與HIV-1Tat蛋白協(xié)同誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬的機制

目前，關(guān)于單獨使用METH或HIV-1Tat蛋白誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬的研究頗為豐富，但少見兩者合用協(xié)同誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬的報道。

4.1 METH與HIV-1Tat蛋白協(xié)同神經(jīng)毒性作用研究表明，較單純HIV-1感染者，METH濫用后，基底神經(jīng)節(jié)功能障礙的發(fā)病率明顯增高[11]。METH與Tat蛋白可協(xié)同誘導(dǎo)SD大鼠血腦屏障損傷，進(jìn)而誘導(dǎo)神經(jīng)毒性[12]。體外實驗也證實，METH與Tat蛋白對樹鼩原代中腦神經(jīng)元的毒性作用具有明顯的協(xié)同效應(yīng)[5]。此外，METH與Tat蛋白的協(xié)同神經(jīng)毒性作用可加速濫用METH的HIV-1感染者神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展[9]。METH與Tat蛋白均可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬，在兩者協(xié)同神經(jīng)毒性作用中，自噬“扮演”著重要角色。

4.2 METH與HIV-1Tat蛋白協(xié)同誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬Qi等[11]使用50 μg·L-1Tat蛋白、500 μmol·L-1METH及兩者合用處理SH-SY5Y細(xì)胞，通過透射電鏡觀察到M組中出現(xiàn)自噬小體；M+T組形成了巨大的自噬小體，證實兩者可協(xié)同誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬。與單用1 mmol·L-1METH組相比，合用1 mmol·L-1METH+50 nmol·L-1Tat蛋白或2 mmol·L-1METH+100 nmol·L-1Tat蛋白處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h后，LC3-Ⅱ及Beclin-1表達(dá)水平明顯升高，伴隨典型的自噬小體出現(xiàn)[10]。50 nmol·L-1或100 nmol·L-1Tat蛋白作用樹鼩原代中腦神經(jīng)元時，自噬現(xiàn)象并不明顯，但在合用0.5 mmol·L-1METH后，自噬現(xiàn)象明顯增強[5]。HIV感染者濫用METH極易誘發(fā)HANDs，此過程可能涉及METH與Tat蛋白協(xié)同誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬及凋亡機制[9]。此外，EL-Hage等[25]合用嗎啡與Tat蛋白處理小膠質(zhì)細(xì)胞，Beclin-1表達(dá)水平升高，并出現(xiàn)自噬小體。Cao等[15]合用1 mmol·L-1METH與400 pmol·L-1gp120蛋白處理SVGA細(xì)胞及人原代星形膠質(zhì)細(xì)胞后，LC3-Ⅱ表達(dá)水平較兩者單用組明顯升高。

4.3 METH與HIV-1Tat蛋白協(xié)同誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬的機制目前，關(guān)于METH與Tat蛋白協(xié)同誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬的研究較少，兩者協(xié)同作用的機制并未闡明。研究表明[10]，METH與Tat蛋白可致神經(jīng)細(xì)胞線粒體功能異常及氧化應(yīng)激損傷，提前使用抗氧化劑則可減輕上述損傷程度。本課題組系統(tǒng)研究了METH與Tat蛋白協(xié)同誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡和自噬[11]，協(xié)同大鼠相關(guān)腦區(qū)及SH-SY5Y細(xì)胞中ROS、GSH-Px和SOD的變化[10]，協(xié)同神經(jīng)毒性作用[5]，推測氧化應(yīng)激是METH與Tat蛋白協(xié)同誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬的基礎(chǔ)，ROS是兩者協(xié)同神經(jīng)細(xì)胞自噬的主要原因。此外，Li等[5]在證實METH與Tat蛋白可協(xié)同誘導(dǎo)樹鼩原代中腦神經(jīng)元自噬后，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)此過程可由mTOR、Atg5、Atg7等參與調(diào)控。Zeng等[10]則證實，METH與Tat蛋白協(xié)同神經(jīng)細(xì)胞自噬涉及mTOR信號通路。除了Tat蛋白，合用1 mmol·L-1METH與400 pmol·L-1gp120蛋白24 h，也可誘導(dǎo)SVGA細(xì)胞自噬，p-mTOR表達(dá)水平明顯下降；而Beclin-1、Atg5、Atg7表達(dá)水平均升高，如提前使用化學(xué)抑制劑或siRNA干預(yù)后，各項指標(biāo)均翻轉(zhuǎn)，表明Beclin-1、mTOR、Atg5及Atg7可參與調(diào)控METH與gp120蛋白協(xié)同誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞自噬[15]。

5 小結(jié)與展望

對于神經(jīng)系統(tǒng)而言，METH誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬既可起保護(hù)作用，又可起加重神經(jīng)毒性作用。METH與HIV-1Tat蛋白具有復(fù)雜的相互作用，兩者往往可相互促進(jìn)，協(xié)同誘導(dǎo)神經(jīng)毒性，但其作用機制并不明確。近期研究表明，METH與HIV-1Tat蛋白合用可協(xié)同誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬，然而，目前對于兩者協(xié)同誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬的認(rèn)識并未成熟，其協(xié)同神經(jīng)細(xì)胞的自噬作用是否參與神經(jīng)毒性的調(diào)節(jié)、其協(xié)同損傷機制及信號通路等方面尚未明晰。因此，深入研究METH與HIV-1Tat蛋白協(xié)同誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬的作用機制、闡明其信號通路，并探討兩者協(xié)同自噬對于神經(jīng)毒性的作用，為毒品濫用的HIV感染者尋找有效的藥物干預(yù)靶點勢在必行。