脂肪干細(xì)胞向神經(jīng)方向誘導(dǎo)分化的研究現(xiàn)狀

李珂雅，白 琳，高舒平，秦 川

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

神經(jīng)退行性疾病在全球范圍內(nèi)頻發(fā)，它們大多進(jìn)展緩慢，進(jìn)行性加重，具有一定致殘性，給社會(huì)造成沉重的負(fù)擔(dān)，構(gòu)成全球公共衛(wèi)生問題。近年來，隨著干細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展和對(duì)成人神經(jīng)發(fā)生的分子機(jī)制的研究，細(xì)胞替代療法由于它擁有能夠治愈神經(jīng)退行性疾病的潛力引起了研究人員的重視。脂肪干細(xì)胞(adipose tissue-derived stem cells，ADSCs)在體內(nèi)儲(chǔ)量豐富、獲取方便，已成為干細(xì)胞治療神經(jīng)退行性疾病的研究熱點(diǎn)。本文就神經(jīng)退行性疾病概況及ADSCs向神經(jīng)方向分化的條件進(jìn)行綜述。

1 神經(jīng)退行性疾病概況

1.1 神經(jīng)退行性疾病病因

1996年，全球疾病負(fù)擔(dān)研究項(xiàng)目提到，神經(jīng)系統(tǒng)疾病占全球疾病負(fù)擔(dān)的4.2%，2004年，該項(xiàng)數(shù)據(jù)上升至5.2%[1-2]。在中國(guó)，神經(jīng)系統(tǒng)疾病所致傷殘壽命調(diào)整年(DALYs)在2015年達(dá)到4948.6萬，相比1990年增加了7.9%[3]。而作為世界范圍內(nèi)最常見的神經(jīng)退行性疾病，阿爾茲海默病是神經(jīng)系統(tǒng)疾病所致死亡的第二位病因[3]。

神經(jīng)退行性疾病與年齡相關(guān)，如，阿爾茨海默病(Alzheimer’s diseases, AD)、帕金森病(Parkinson’s diseases, PD)和肌萎縮側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)[4]。它們的共同特點(diǎn)是神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的進(jìn)行性丟失[5]。AD是最常見的癡呆癥，主要表現(xiàn)為前腦基底部、杏仁核、海馬和大腦皮層神經(jīng)元的變性和壞死。隨著疾病進(jìn)展，病人記憶和認(rèn)知功能逐漸下降[6]。突觸前膽堿能系統(tǒng)的功能障礙被認(rèn)為是認(rèn)知障礙的原因之一。臨床上用于治療的膽堿酯酶抑制劑，就是基于這一理論，以增加乙酰膽堿含量來達(dá)到治療目的，然而這些藥物也僅是延緩了大腦功能的下降[7]。PD是世界范圍內(nèi)最普遍的運(yùn)動(dòng)障礙性疾病和位居阿爾茨海默病之后的第二常見的神經(jīng)退行性疾病。合成多巴胺的神經(jīng)元大多位于黑質(zhì)致密部，它的末梢延伸至紋狀體，當(dāng)這些位置出現(xiàn)超過60%的多巴胺能神經(jīng)元缺失，PD病人即出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)缺陷。而多巴胺能神經(jīng)元的持續(xù)丟失讓病人的癥狀越發(fā)明顯[8]。ALS作為一種嚴(yán)重的神經(jīng)退行性疾病，病人一般在確診后的5年內(nèi)死亡，其病理特征是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元在大腦皮層、腦干和脊髓中逐漸丟失[6]。筆者從眾多研究當(dāng)中對(duì)神經(jīng)退行性疾病的病因機(jī)制有了相當(dāng)?shù)牧私?，然而，由于它們的不可逆轉(zhuǎn)性，以及研究人員對(duì)其確切病因的認(rèn)識(shí)有限，至今仍沒有有效藥物或治療方法可以完全解除癥狀，幫助患者恢復(fù)健康[9]。

1.2 干細(xì)胞治療神經(jīng)退行性疾病現(xiàn)狀

干細(xì)胞是一組能夠自我更新、長(zhǎng)時(shí)間存活，具有多向分化潛能特性的細(xì)胞群。自然條件下干細(xì)胞根據(jù)其全能性不同，或者說發(fā)展進(jìn)程的不同，分為胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)、胎兒干細(xì)胞(fetal stem cells，F(xiàn)SCs)和成體干細(xì)胞(adult stem cells)?？蒲腥藛T還研究出一種方法來誘導(dǎo)已分化的細(xì)胞成為多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPS cells)。

有研究表明以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的細(xì)胞替代療法能夠有效治療包括AD、PD及ALS在內(nèi)的大多數(shù)神經(jīng)退行性疾病[10]。目前，干細(xì)胞在治療神經(jīng)退行性疾病的大部分研究還是集中在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型階段。而分化為特定的細(xì)胞類型，可以有效避免干細(xì)胞移植入機(jī)體后的成瘤性和過度生長(zhǎng)。

胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為多巴胺能神經(jīng)元后植入PD小鼠模型，其運(yùn)動(dòng)出現(xiàn)明顯改善[11]。Kim等[12]將從脊髓提取的神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，植入ALS小鼠模型SOD1G93 A，使得疾病推遲了28 d發(fā)作。

2 脂肪干細(xì)胞及其生物學(xué)特征

ADSCs因脂肪組織在整形外科領(lǐng)域的豐富資源且脂肪組織低成本、易取得、運(yùn)送方便[13]及分離后培養(yǎng)能獲得大量脂肪干細(xì)胞[14]的優(yōu)點(diǎn)受到科研人員的關(guān)注。它在細(xì)胞替代治療中，有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，它不引起倫理道德問題也不存在胚胎干細(xì)胞帶來的副作用，如免疫排斥反應(yīng)及致瘤性，更是為自體治療提供了手段。

后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs有多向分化潛能，在特定誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，ADSCs能分化為肌上皮細(xì)胞[15]、心肌細(xì)胞[16]、成骨細(xì)胞[17]、軟骨細(xì)胞[18]等，也能朝神經(jīng)方向分化。ADSCs表達(dá)包括CD10、CD13、CD29、CD44、CD71、CD73、CD90、CD105、CD166和CD271在內(nèi)的表面標(biāo)記物，而CD14、CD34、CD45為陰性[14]。ADSCs具有免疫調(diào)節(jié)作用，能夠分泌多種細(xì)胞因子以及抗凋亡、抗氧化、抗炎癥能力。在體外培養(yǎng)時(shí)，ADSCs生長(zhǎng)迅速，分化能力不隨培養(yǎng)時(shí)間增加而降低，能在低溫環(huán)境下存活。ADSCs具有較低的免疫原性，有了這一特性，無論宿主與捐獻(xiàn)者的人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)是否相匹配，移植均可進(jìn)行[14]。

ADSCs本身就保有朝向神經(jīng)方向分化的潛能[19]，在此前，Zhang等[20]發(fā)現(xiàn)ADSCs朝向神經(jīng)方向分化后，無論是神經(jīng)球增殖速率、表達(dá)的神經(jīng)標(biāo)記物還是分泌的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子含量都要高于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stromal stem cells，BMSCs)，這說明ADSCs或許是更為有效的朝向神經(jīng)方向分化的一類干細(xì)胞。

由于脂肪干細(xì)胞的以上特點(diǎn)，體外誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞為成熟神經(jīng)元進(jìn)行干細(xì)胞移植治療具有廣闊的治療前景。

3 脂肪干細(xì)胞向神經(jīng)方向誘導(dǎo)分化的研究

ADSCs朝向神經(jīng)方向分化，常用的方法包括：(1)神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)；(2)共培養(yǎng)；(3)基因轉(zhuǎn)染；(4)電刺激。

3.1 神經(jīng)培養(yǎng)基誘導(dǎo)ADSCs向神經(jīng)方向分化

神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)是采用直接誘導(dǎo)分化或分步誘導(dǎo)分化法，即ADSCs先轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)，再朝向神經(jīng)細(xì)胞分化。在培養(yǎng)基中添加生長(zhǎng)因子運(yùn)用得較為廣泛，也有添加激素類蛋白、小分子化合物等。

最近，Marei團(tuán)隊(duì)[21]將人脂肪組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)至第3代時(shí)采用維甲酸(retinoic acid，RA)進(jìn)行誘導(dǎo)分化，在第6天的時(shí)候，細(xì)胞形態(tài)開始朝向神經(jīng)方向變化。這有可能是因?yàn)镽A通過維甲酸受體激活了受體連接的維甲酸反應(yīng)元件，引發(fā)了神經(jīng)方向基因的轉(zhuǎn)錄[22]。該團(tuán)隊(duì)還采用了成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2(fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF2)和肝素、RA和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-9(bone morphogenetic protein 9，BMP9)誘導(dǎo)的方法。結(jié)合TH和ChAT基因的上調(diào)水平，該團(tuán)隊(duì)認(rèn)為肝素結(jié)合FGF2是更佳的多巴胺能神經(jīng)元誘導(dǎo)劑，而RA和FGF2、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)、BMP9混合的誘導(dǎo)劑對(duì)于誘導(dǎo)膽堿能神經(jīng)元更為有效。Soheilifar等[23]同樣采用FGF2誘導(dǎo)，他們結(jié)合了音猬因子(sonic hedgehog，SHH)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-8(fibroblast growth factor 8，F(xiàn)GF8)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)，誘導(dǎo)出了能有效分泌多巴胺和表達(dá)相關(guān)基因的多巴胺能神經(jīng)元。值得注意的是，檢測(cè)基因中有一個(gè)是GIRK2基因，是黑質(zhì)致密部A9神經(jīng)元特定表達(dá)的基因，另一個(gè)是CALB1基因，此基因編碼產(chǎn)生calbindin蛋白只在腹側(cè)背蓋區(qū)的A10神經(jīng)元中表達(dá)，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)出的神經(jīng)元表達(dá)GIRK2而不表達(dá)CALB1，所以聯(lián)合SHH、FGF8、b-FGF和BDNF的方法誘導(dǎo)人ADSCs產(chǎn)生出的多巴胺能神經(jīng)元是A9神經(jīng)元。BDNF在神經(jīng)元的特性和功能產(chǎn)生方面有附加作用[24]。Singh[24]等采用FGF2和BDNF協(xié)同誘導(dǎo)人ADSCs，通過鈣離子成像證實(shí)產(chǎn)生了有功能的多巴胺能神經(jīng)元。

Mostafavi等[19]采用分步誘導(dǎo)分化法，將人ADSCs和人BMSCs進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，他們將這兩種細(xì)胞在b-FGF、EGF、B27的聯(lián)合誘導(dǎo)下先形成神經(jīng)球，再在含有B27的神經(jīng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)成神經(jīng)元樣細(xì)胞。培養(yǎng)出的神經(jīng)元樣細(xì)胞表達(dá)MAP2和GFAP基因，而作為星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物，GFAP基因在ADSCs的表達(dá)量低于BMSCs，成熟神經(jīng)元標(biāo)記物MAP2在這兩種細(xì)胞中相當(dāng)，由此可見，想要獲得神經(jīng)元樣細(xì)胞，ADSCs相較于BMSCs而言是更好的選擇。

除了在神經(jīng)培養(yǎng)基里添加各種細(xì)胞因子，激素類蛋白的添加，如T3[25]、雌激素[26]、催產(chǎn)素[27]等，也能促進(jìn)ADSCs產(chǎn)生神經(jīng)方向的分化。Razavi團(tuán)隊(duì)[25-26]前后試驗(yàn)了T3和雌激素協(xié)同b-FGF、EGF、B27對(duì)于人ADSCs的神經(jīng)分化作用，他們均采用分步誘導(dǎo)分化法，發(fā)現(xiàn)雌二醇或許能夠通過產(chǎn)生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子提高人ADSCs的增殖速率和神經(jīng)分化效率，而T3則促進(jìn)人ADSCs朝向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化。而催產(chǎn)素，作為神經(jīng)垂體激素，對(duì)小鼠ADSCs的神經(jīng)分化作用具有時(shí)間依賴性和濃度依賴性。只有在含10-7mol/L催產(chǎn)素的神經(jīng)培養(yǎng)基中，CHAT的基因有表達(dá)。而GFAP的不表達(dá)表明，催產(chǎn)素誘導(dǎo)的神經(jīng)分化直接朝向神經(jīng)元而不是膠質(zhì)細(xì)胞。

小分子化合物，屬于化學(xué)生物學(xué)范疇，它使用方便、可控[28]，它在ADSCs朝向神經(jīng)方向分化過程中，主要是作用于細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路，使細(xì)胞重編程，再定向分化。Park等[29]運(yùn)用TGF-β受體抑制劑SB431542和選擇性BMP信號(hào)通路抑制劑LDN193289分三步進(jìn)行誘導(dǎo)。使用小分子化合物，將人ADSCs轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)干細(xì)胞。最終超過76%的細(xì)胞誘導(dǎo)為能產(chǎn)生膜電位的神經(jīng)元，而功能性γ-氨基丁酸能神經(jīng)元的誘導(dǎo)效率超過45%。小分子化合物的使用，為ADSCs朝向神經(jīng)方向分化提供了可重復(fù)且有效的方法。

3.2 共培養(yǎng)促進(jìn)ADSCs向神經(jīng)方向分化

Razavi等[30]首先將人ADSCs誘導(dǎo)成神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分泌細(xì)胞，再將其制成細(xì)胞微膠囊與人ADSCs誘導(dǎo)成的神經(jīng)球以1∶1的比例共培養(yǎng)，最終誘導(dǎo)成的細(xì)胞表達(dá)的MAP2和nestin明顯升高，而GFAP下降，表明將人ADSCs和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分泌細(xì)胞共培養(yǎng)促進(jìn)了朝向神經(jīng)元的分化，這種促進(jìn)作用是通過分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分泌細(xì)胞分泌BDNF、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(nerve growth factor，NGF)、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)等產(chǎn)生。

Bahmani團(tuán)隊(duì)[31]將小鼠ES細(xì)胞與小鼠ADSCs進(jìn)行非接觸共培養(yǎng)48 h后，再進(jìn)行神經(jīng)誘導(dǎo)2周，神經(jīng)特定標(biāo)記物的表達(dá)量多于未共培養(yǎng)ADSCs。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，共培養(yǎng)后，小鼠ADSCs表達(dá)PCNA基因、SOX2基因、OCT4基因上調(diào)，這些多能性標(biāo)記物的升高提示小鼠ES細(xì)胞分泌細(xì)胞因子和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑以增加小鼠ADSCs的多能性來促進(jìn)其朝向神經(jīng)分化。

3.3 其他促進(jìn)ADSCs向神經(jīng)方向分化的方法

除了在神經(jīng)培養(yǎng)基中添加各類細(xì)胞因子、激素、小分子化合物，或是ADSCs與有分泌功能的細(xì)胞共培養(yǎng)促進(jìn)神經(jīng)方向的分化外，科研人員還采用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將BDNF和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3(neurotrophin-3)經(jīng)由慢病毒轉(zhuǎn)入SD大鼠的ADSCs，再經(jīng)由神經(jīng)培養(yǎng)基誘導(dǎo)，其表達(dá)的NSE基因量有所增加[32]。

Yang[33]則將不同強(qiáng)度電刺激作用于SD大鼠的ADSCs，最終篩選出最適宜脂肪干細(xì)胞神經(jīng)分化的電刺激強(qiáng)度(1 V/cm)，在此電刺激強(qiáng)度下，脂肪干細(xì)胞增殖活力增強(qiáng)，且能促進(jìn)脂肪干細(xì)胞向神經(jīng)方向分化。而后結(jié)合基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將Nurr-1基因轉(zhuǎn)入ADSCs，發(fā)現(xiàn)電刺激聯(lián)合Nurr-1基因轉(zhuǎn)染作用于脂肪干細(xì)胞后能進(jìn)一步提高其向神經(jīng)方向分化的能力。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

人類神經(jīng)退行性疾病主要是由大腦或脊髓中的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞丟失引起的。在尚無有效療法的情況下，細(xì)胞替代療法正在成為治療這種缺陷的創(chuàng)新方法。

由于人體脂肪組織分布廣，含量多，在局麻條件下，較少引起病人不適便能取得，它能成為干細(xì)胞替代治療的重要來源。隨著ADSCs研究的深入，對(duì)于它的特性，人們也有了清晰的認(rèn)識(shí)：ADSCs能分泌多量對(duì)于神經(jīng)的再生修復(fù)作用來說特別重要的生長(zhǎng)因子，諸如BDNF、胰島素樣生長(zhǎng)因子和成纖維樣生長(zhǎng)因子；ADSCs有較強(qiáng)的朝向神經(jīng)方向分化的能力，且在朝向神經(jīng)元分化過程中，ADSCs分化過程當(dāng)中出現(xiàn)的GFAP基因的下調(diào)是非常重要的；ADSCs生長(zhǎng)迅速、有免疫抑制特性等。因此，ADSCs在治療神經(jīng)退行性疾病方面存有巨大潛力。

然而盡管ADSCs朝向神經(jīng)方向的誘導(dǎo)方式各樣，方法眾多，但大多實(shí)驗(yàn)只是處于體外誘導(dǎo)階段，且誘導(dǎo)后的細(xì)胞只是記錄了形態(tài)變化和一些選擇性的神經(jīng)元特異性或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記物的表達(dá)，缺乏真正細(xì)胞功能的檢測(cè)，如膜電位和/或特定細(xì)胞群體(如多巴胺能神經(jīng)元)的分泌功能，也缺乏一些體內(nèi)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的支持。探索一種更為有效的誘導(dǎo)方法，制備出具有功能的神經(jīng)元或者神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，無論是從補(bǔ)給丟失的神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，從根本上治療神經(jīng)退行性疾病還是避免干細(xì)胞移植入機(jī)體后的成瘤性和過度生長(zhǎng)均具有重大意義。