代謝組學(xué)在藥物性肝損傷研究中的應(yīng)用

徐 榛， 鄧中平， 孫嘉彬

（上海中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全評價研究中心，上海 201203）

肝臟作為機(jī)體物質(zhì)代謝的最主要器官，也是藥物損傷的主要靶點(diǎn)，藥物性肝損傷是指藥物在使用過程中因藥物本身或其代謝產(chǎn)物所導(dǎo)致的肝臟損傷，輕者停藥后即可恢復(fù)，嚴(yán)重者可造成不可逆的肝損傷甚至死亡，隨著新藥的廣泛應(yīng)用和人們對傳統(tǒng)中藥的不斷重視，該疾病越來越受到重視。Suk等[1］發(fā)現(xiàn)，每10萬人中有13.9～24人患有藥物性肝損傷；Bj?rnsson等[2］報道，每10萬個普通居民中即有19.1人患病，為冰島發(fā)病率最高的疾病之一。另外，個體差異同樣對藥物性肝損傷的預(yù)測和診斷造成很大影響，以老年人及女性更敏感，肝病史、肥胖、吸煙、飲酒也均可提高患病風(fēng)險[3-5］。

傳統(tǒng)的肝臟損傷研究主要采用體內(nèi)與體外評價體系，在敏感性和特異性方面存在明顯不足。代謝組學(xué)技術(shù)作為系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分，在藥物毒性或安全性評價等方面表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力，它主要以生命活動的下游小分子代謝產(chǎn)物 （MW＜1 000）為研究對象，以特異敏感、高通量檢測方法為基礎(chǔ)，主要包括核磁共振 （NMR）、氣相色譜-質(zhì)譜 （GC-MS）、液相色譜-質(zhì)譜 （LC-MS） 技術(shù)，常用于研究藥物代謝規(guī)律、尋找差異代謝物、考察作用靶點(diǎn)及機(jī)制等方面[6］。因此，本文對近年來代謝組學(xué)在藥物性肝損傷標(biāo)志物篩選、肝損傷機(jī)制及損傷修復(fù)等方面的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 藥物性肝損傷診斷標(biāo)志物篩選

藥物性肝損傷癥狀可能類似于各種肝臟疾病，目前對其診斷尚無靈敏、特異的方法。國際上主要以RUCAM法，即通過Hy｀s法則及危險因素計分表排除法進(jìn)行判斷，其中前者以血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶和堿性磷酸酶升高作為診斷標(biāo)準(zhǔn)，但敏感性較差，而藥物性肝損傷病情復(fù)雜預(yù)后性差，待確診時往往肝損傷已經(jīng)較為嚴(yán)重難以恢復(fù)，甚至導(dǎo)致死亡，故尋找準(zhǔn)確敏感的生物標(biāo)志物為大家所關(guān)注。

隨著對藥物性肝損傷研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)因果關(guān)系及 Hy｀s 法則有很大的局限性和不準(zhǔn)確性[7］。 Teschke 等[8］回顧文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，分別有14%、11%的案例由于替代原因及診斷未成立而未能納入藥物性肝損傷范疇。RUCAM法雖然準(zhǔn)確性較高，但診斷較繁瑣，標(biāo)準(zhǔn)界定模糊，難以推廣，至2017年我國僅有13.4%的文獻(xiàn)采用該方法，同時其實(shí)際應(yīng)用中診斷標(biāo)準(zhǔn)多、主觀性強(qiáng)也影響了病情治療和恢復(fù)[9］。目前，關(guān)于藥物性肝損傷的診斷仍有較多困惑：①關(guān)于藥物性肝損傷仍缺乏特異生物標(biāo)志物，給確診帶來極大困難，近年來人們在尋找新型標(biāo)志物上取得了很多成果，如谷氨酸脫氫酶、miRNA-122、結(jié)合型膽汁酸等，但仍處于研究階段，其普遍適用性等問題尚未得到臨床確證[10-11］；②藥物性肝損傷患者可能同時服用多種成分復(fù)雜的藥物，導(dǎo)致病因難以確認(rèn)，故在臨床中涉及常見易致藥物性肝損傷藥物 （如抗結(jié)核病藥物、抗生素等）時應(yīng)同時聯(lián)合護(hù)肝藥物以更密切關(guān)注肝臟情況[12-13］；③由于個體差異，導(dǎo)致易致藥物性肝損傷藥物在不同患者使用后反應(yīng)差異大，并且在病情出現(xiàn)之前鑒別出哪些患者易感的難度非常大，故在診治老年人、有肝病史等易感人群時要更密切關(guān)注肝臟情況，盡量避免使用可能有損傷的藥物。徐曾麗[14］等對藥物性肝損傷患者臨床分型與病理學(xué)檢查進(jìn)行對應(yīng)研究，發(fā)現(xiàn)兩者并沒有明顯相關(guān)性，故應(yīng)將精力集中于發(fā)展因果關(guān)系和利用各種技術(shù)與組學(xué)，尋找新型生物標(biāo)志物來代替現(xiàn)有指標(biāo)[15］。

通過代謝組學(xué)技術(shù)對肝損傷不同階段和類型的差異代謝物進(jìn)行分析，從而尋找可能的早期生物標(biāo)志物和代謝異常，可為藥物性肝損傷診斷提供新視角[16-17］。Mattes等[18］取苯妥英、氟他胺、丙硫氧嘧啶、拉米夫定、甲氨蝶呤、卡托普利、奈法唑酮、奈韋拉平、丙戊酸9種已知潛在有肝臟毒性的藥物，以及齊多夫定、阿托品、甘露醇、新霉素、鏈霉素和萬古霉素6種無肝臟毒性的藥物對大鼠血清進(jìn)行代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)代謝物分析方法可對大鼠潛在藥物性肝損傷進(jìn)行信號探測；盛云華等[19］對黃藥子肝臟毒性研究時發(fā)現(xiàn)，給予大鼠5 g／kg乙醇提取物后血清脂質(zhì)、谷氨酸、磷酸膽堿、甘油磷酸膽堿等6種早期潛在生物標(biāo)志物較傳統(tǒng)生物標(biāo)志物 [谷丙轉(zhuǎn)氨酶 （ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）］可在尚未出現(xiàn)肝臟病理變化時即出現(xiàn)異常，同時何首烏以40 g／kg劑量給藥大鼠1周后，血清PCA分析即出現(xiàn)分離，油酰胺、溶血性磷脂膽堿、白三烯、雙氫皮層醇等代謝產(chǎn)物出現(xiàn)明顯變化，較傳統(tǒng)指標(biāo)更為敏感[20］，此外臨床藥物性肝損傷患者代謝譜較正常人也出現(xiàn)明顯變化；安卓玲、李小芬等[21-22］分別通過比較藥物性肝損傷患者與健康受試者代謝圖譜建議，應(yīng)著重關(guān)注溶血卵磷脂、膽汁酸、氨基酸類等成分的變化；Kim等[23］在對臨床上對乙酰氨基酚肝臟毒性進(jìn)行研究時發(fā)現(xiàn)，人體內(nèi)代謝組學(xué)技術(shù)較傳統(tǒng)血清生化檢測可更敏感地指征肝臟損傷，受到不同藥物導(dǎo)致的肝損傷機(jī)制復(fù)雜、個體差異及環(huán)境因素影響，不同實(shí)驗(yàn)報道的生物標(biāo)志物缺乏一致性和可重復(fù)性，難以直接應(yīng)用到臨床。目前，通過研究新的軟件及建立穩(wěn)定可靠的標(biāo)志物篩選模型成為研究熱點(diǎn)，Xia等[24］引用ROCCET工具協(xié)助進(jìn)行ROC曲線分析，對發(fā)現(xiàn)的差異代謝物進(jìn)行篩選；Chen等[25］通過對不同分類模型進(jìn)行對比分析，優(yōu)選隨機(jī)森林法可用于建立生物標(biāo)志物模型，提示代謝組學(xué)技術(shù)可輔助臨床藥物性肝損傷診斷和研究，具有良好的應(yīng)用前景，同時，如何整合和建立準(zhǔn)確可靠的差異代謝組，使其更好更快應(yīng)用于臨床也將成為關(guān)注的熱點(diǎn)。

膽汁酸代謝作為肝臟代謝中的重要途徑，可反映肝損傷程度，有利于提高診斷靈敏性。藥物性肝損傷發(fā)生時，可在血液、尿液、肝臟中檢測到膽汁酸代謝異常，而且在低劑量和早期即有明顯變化，成為病情潛在生物標(biāo)志物和機(jī)制的熱點(diǎn)[26-27］。例如，給予90、180 mg／kg利福平可使小鼠膽固醇7α-羥化酶基因的表達(dá)增加，并抑制膽鹽輸出泵表達(dá)，從而造成膽汁淤積型肝損傷，以180 mg／kg劑量更明顯，具有量效關(guān)系[28］；通過對膽汁酸代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，64 mg／kg黃毒素B可使?；撬峤Y(jié)合型膽汁酸迅速提高，較傳統(tǒng)指標(biāo)能更好地表征黃藥子所致肝臟毒性[29］；給予小鼠臨床劑量非諾貝特后，可通過上調(diào)Cyp7a1來加速膽固醇代謝調(diào)節(jié)血糖和血脂，同時可導(dǎo)致去氧膽酸的急劇升高，從而引起肝臟損傷[30］；課題組前期對山豆根造成肝臟毒性機(jī)制探索中發(fā)現(xiàn)，給藥可使膽酸、去氧膽酸等升高，并降低牛磺酸結(jié)合型膽酸含有量。

目前，在臨床前肝臟生物標(biāo)志物研究中主要通過制造肝毒性動物模型，然后對其差異代謝物進(jìn)行分析，主要通過差異代謝物及代謝通路異常的途徑，與其他研究方法相互印證的方法尋找肝臟的特異標(biāo)志物。通過代謝組學(xué)技術(shù)探索生物標(biāo)志物不僅可彌補(bǔ)現(xiàn)有診斷方法不足，還能預(yù)測其發(fā)生風(fēng)險，對藥物性肝損傷進(jìn)行病情評估等具有重要意義。但代謝組學(xué)技術(shù)篩選特異性生物標(biāo)志物的過程繁瑣復(fù)雜，尤其在代謝通路分析及標(biāo)志物驗(yàn)證過程中對現(xiàn)有代謝物數(shù)據(jù)庫要求高，由于代謝物受環(huán)境、個體差異等因素的影響較多，故難以找到穩(wěn)定可靠的共有生物標(biāo)志物，目前發(fā)現(xiàn)的藥物性肝損傷生物標(biāo)志物尚處在實(shí)驗(yàn)研究階段。因此，建立與藥物性肝損傷密切相關(guān)的通用標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫將是今后代謝組學(xué)技術(shù)研究相關(guān)生物標(biāo)志物的重要內(nèi)容之一。

2 藥物性肝損傷損傷機(jī)制研究

根據(jù)Hy｀s法則，目前藥物性肝損傷主要分為肝細(xì)胞型、膽汁淤積型、混合型，其損傷機(jī)制復(fù)雜多樣，為診斷和治療帶來困難。代謝組學(xué)技術(shù)可通過對代謝物變化的分析探究肝損傷作用機(jī)制和靶點(diǎn)，為考察其肝損傷機(jī)制和影響的代謝通路提供新的方向。

阿霉素通過影響苯丙氨酸等代謝產(chǎn)物的合成和代謝，擾亂氨基酸、脂質(zhì)、嘌呤代謝、能量代謝、生物轉(zhuǎn)化等代謝過程，從而造成肝損傷[31］；他莫昔芬造成肝細(xì)胞氧化應(yīng)激，導(dǎo)致糖代謝和能量代謝異常，使脂肪酸重新在肝內(nèi)轉(zhuǎn)換淤積而造成肝損傷；氟他胺通過使細(xì)胞氧化應(yīng)激，導(dǎo)致體內(nèi)產(chǎn)生過量膽紅素而造成黃疸[32］；氯丙嗪使線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能降低，肝臟抗氧化應(yīng)激受損，繼而導(dǎo)致糖酵解和三羧酸循環(huán)的改變等造成膽汁淤積，75 mg／kg劑量較37.5、53 mg／kg劑量可使代謝成分明顯分開，其結(jié)果與病理及蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)論一致，為闡明該藥物肝毒性機(jī)制提供線索[33］。

馬致潔[34］通過對何首烏患者血清進(jìn)行代謝分析，尋找到40個差異代謝物，其機(jī)制主要是由于氧化應(yīng)激及影響膽汁酸的分泌而造成的肝損傷和膽汁淤積，同時用大鼠血清和L-02細(xì)胞進(jìn)行了驗(yàn)證，為解釋該藥材造成肝毒性的機(jī)制和類型提供動物和分子水平的依據(jù)。通過給予大鼠臨床等效及20倍劑量雷公藤，可引起肝內(nèi)免疫介導(dǎo)肝毒性及脂質(zhì)過氧化損失，導(dǎo)致6-磷酸葡萄糖胺、溶血磷脂、色氨酸、胍基乙酸、3-吲哚丙酸、可的松和泛醌等代謝物異常，造成氨基酸代謝等途徑發(fā)生紊亂[35］。蒼耳子可引起小鼠肝臟嚴(yán)重脂質(zhì)過氧化，其損傷機(jī)制主要與其影響肝細(xì)胞能量代謝有關(guān)[36］。給予小鼠1.35、0.15 g／kg雄黃后，其血清和尿液代謝PCA譜均有明顯區(qū)分，并具有劑量效應(yīng)關(guān)系，差異代謝物顯示毒性機(jī)制主要與其干擾能量代謝和氨基酸代謝相關(guān)，結(jié)果與生化檢測分析一致[37］。重樓皂苷作為臨床抗癌和抗炎的有效藥物，其副作用和肝臟毒性也被報道，然而傳統(tǒng)指標(biāo)對其并未有靈敏的指示。Man等[38-39］基于GC-MS對其代謝譜分析研究，發(fā)現(xiàn)在350 mg／kg劑量下重樓皂苷可降低線粒體氧化還原能力及CYP1A2、CYP2E1、UGTs mRNA水平，從而抑制糖酵解、脂肪酸氧化及三羧酸循環(huán)，同時導(dǎo)致肝脂肪變性的產(chǎn)生。首次驗(yàn)證了其肝臟毒性并對其機(jī)制進(jìn)行了探索。

目前，藥物性肝損傷損傷機(jī)制主要有①通過影響肝細(xì)胞進(jìn)而造成代謝通路紊亂及代謝物異常；②通過影響肝內(nèi)代謝通路造成代謝異常，進(jìn)而造成肝臟損傷；③通過導(dǎo)致肝細(xì)胞或肝功能損傷而致使代謝物失調(diào)，代謝物淤積進(jìn)一步造成肝臟損傷幾種途徑，兩者往往相互影響，從而加重對肝臟的損傷。代謝組學(xué)技術(shù)可為探索藥物性肝損傷的機(jī)制提供了新的思路和方向，它以內(nèi)源性小分子為目標(biāo)化合物來研究藥物致肝損傷作用特點(diǎn)和規(guī)律，與基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)相比更能描述藥物引起的毒性機(jī)制及毒性與時間的相關(guān)性，并能為藥物的安全性評價提供數(shù)據(jù)參考。但目前對藥物性肝損傷的研究主要停留在個別藥物中，由于損傷機(jī)制差別等原因難以找到共同差異代謝物，而對于共同生物標(biāo)志物的篩選及代謝物組的考察也逐漸成為研究熱點(diǎn)。

3 減毒及肝損傷修復(fù)作用研究

隨著代謝組學(xué)技術(shù)在醫(yī)藥研究領(lǐng)域的不斷發(fā)展和深入，它在聯(lián)合用藥、增效減毒方面也有一些應(yīng)用。通過代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，清絡(luò)通痹方中等效劑量的生地黃和三七可分別通過調(diào)控甘氨膽酸和硫胺素等代謝產(chǎn)物來減輕雷公藤的肝臟毒性；占雷公藤劑量1／3的甘草主要通過影響甘油磷脂代謝，從而達(dá)到配伍減毒雷公藤的功效[40-41］。

對乙酰氨基酚作為最常用的解熱鎮(zhèn)痛藥，其肝毒性也同樣被廣泛關(guān)注。Fukuhara等[42］通過1H-NMR對大鼠血清和尿液進(jìn)行內(nèi)源性代謝物譜監(jiān)測，驗(yàn)證苯巴比妥可誘發(fā)和加重對乙酰氨基酚的肝臟毒性，其氧化應(yīng)激可明顯影響N-乙酰基-對苯醌的代謝；Kyriakides等[17］通過對乙酰氨基酚和其毒性較小的同分異構(gòu)體glutathionyl進(jìn)行代謝組學(xué)分析和病理觀察，證實(shí)乙酰氨基酚主要通過對氨基酸代謝的擾亂來影響線粒體和糖代謝，導(dǎo)致能量中斷，從而造成肝損傷，而glutathionyl未產(chǎn)生變化，證明它對乙酰氨基酚有減毒作用，可作為其替代藥物，另外給予9、36 g生藥／kg的柴胡均可通過調(diào)節(jié)糖代謝、脂質(zhì)代謝和能量代謝的可以改善 500 mg／kg對乙酰氨基酚的肝臟損傷[43］。

代謝組學(xué)技術(shù)在藥物保肝作用機(jī)制研究方面也有所應(yīng)用。例如，1.6 g／kg巖黃連可恢復(fù)30 mg／kg四氯化碳所致的丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝、甘油三酯代謝的異常[44］；聯(lián)苯雙酯可將馬兜鈴酸、大黃素等造成肝損傷的代謝異?；謴?fù)到正常水平[45］；王小娟[46］對川楝子及其主要提取部位與白芍配伍后的肝臟毒性進(jìn)行NMR技術(shù)分析后發(fā)現(xiàn)，該藥材主要毒性部位為乙酸乙酯提取物，它與白芍按1∶2比例配伍時能在一定程度上減輕其肝臟毒性。

目前，基于單味中藥肝臟毒性的研究較多。利用代謝組學(xué)技術(shù)，以復(fù)方制劑為研究對象，從整體上闡釋中藥所致肝損傷及中醫(yī)藥減毒保肝機(jī)制，可為中藥臨床配伍及劑量使用提供科學(xué)參考，對中藥現(xiàn)代化具有積極意義。

4 總結(jié)與展望

代謝組學(xué)技術(shù)由于其研究特點(diǎn)和優(yōu)勢，經(jīng)過多年的探索和應(yīng)用被廣泛用于藥物研發(fā)、毒性評價、臨床疾病診斷等領(lǐng)域。在藥物性肝損傷的早期預(yù)警及防治方面，代謝組學(xué)具備更好的可靠性、預(yù)見性，又能在疾病的早期發(fā)現(xiàn)、機(jī)制研究及藥物安全性評價等方面發(fā)揮重要作用[21］。但目前代謝組學(xué)仍有很多需要完善的地方，如建立一個較完整的代謝物庫仍需要一定時間，而個體差異、環(huán)境等外在因素很容易影響代謝物的變化和差異。另外，由于藥物性肝損傷類型復(fù)雜多樣，所找到的差異代謝物也各有不同，難以僅通過1個或幾個代謝物作為潛在生物標(biāo)志物進(jìn)行診斷。因此，如何建立差異代謝組以更好地適應(yīng)臨床治療和藥物開發(fā)仍是研究熱點(diǎn)。

目前，代謝組學(xué)技術(shù)在藥物性肝損傷的應(yīng)用仍主要集中在臨床前研究，尚無法用于臨床診斷和治療，但已逐漸向臨床研究和應(yīng)用轉(zhuǎn)移，故可嘗試通過該技術(shù)為相關(guān)研究提供幫助。由于藥物性肝損傷機(jī)制復(fù)雜，如何利用代謝組學(xué)技術(shù)將其類型合理分類，分析其主要潛在差異代謝物和毒性機(jī)制，將成為今后相關(guān)研究的重點(diǎn)。隨著質(zhì)譜技術(shù)、大數(shù)據(jù)分析、代謝數(shù)據(jù)庫等的不斷完善，代謝組學(xué)技術(shù)在藥物性肝損傷診斷、毒性機(jī)制及治療中的應(yīng)用也將有會突破性進(jìn)展。