造影劑腎病動物模型研究進展

張志明，林開陽，林茂強，徐家豪，嚴晗，陳漢川，王孫鎣，陳希男，劉東輝，郭延松

(福建醫(yī)科大學省立臨床醫(yī)學院，福州 350000)

隨著現(xiàn)代影像放射檢查技術和介入手段的廣泛發(fā)展，造影劑的應用日益增多，發(fā)生造影劑腎病(contrast-induced nephropathy，CIN)也隨之增多。CIN是急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)的主要原因之一，CIN患者不僅預后差，而且并發(fā)癥發(fā)生率高，總住院時延長。目前CIN的發(fā)病機制仍然不清楚，缺乏有效的預防手段，因此對CIN發(fā)病機制的研究是目前研究的熱點。動物模型的構建是研究CIN發(fā)病機制的基礎，但動物模型制備缺乏公認的方法。本文對CIN進行簡單概述，并對CIN動物模型研究進展做一綜述。

1 CIN概述

CIN被定義為造影劑接觸后48 ～ 72 h 血肌酐絕對值較基礎值升高≥0.5 mg/dL(44.22 μmol /L)或相對升高≥25%, 并排除其他可能引起腎損害的原因[1]。它是醫(yī)院獲得性急性腎損傷第三大主要原因，占據(jù)了所有醫(yī)院獲得性腎損傷的11%[2]。CIN的發(fā)病機制目前尚不完全明確，可能與血流動力學的改變、直接的腎小管細胞的損傷、活性氧的產(chǎn)生有關[3]。已經(jīng)證實了造影劑增加了滲透負荷，減少了腎血流量，誘導了腎動脈收縮。這種條件促進了活性氧的產(chǎn)生，造成了缺血性腎小管損傷，這可以被認為是直接腎小管毒性的原因[4]。

CIN的危險因素包括了慢性腎病、糖尿病、低血壓、造影劑的體積、充血性心力衰竭、高齡和貧血[5-8]。CIN目前尚缺乏有效的治療手段，加強對CIN病因和發(fā)病機制的研究，開發(fā)出更有效的防治措施是極其重要的。而CIN動物模型能較好地復制疾病狀態(tài)，是進行相關研究的第一步?，F(xiàn)從實驗動物、CIN動物模型的具體構建方法(預處理和造影劑的使用)等方面闡述CIN動物模型的構建。

2 CIN動物模型的構建

2.1 實驗動物

CIN動物模型常用大鼠(大多數(shù)為8 ～ 10周齡，200 ～ 220 g，雄性Sprague-Dawley大鼠)，大鼠同源性較好，應用較多。其他少見動物有狗、家兔、豬。臨床中CIN的患者大多伴隨有心血管疾病、糖尿病和慢性腎病，因此個別模型所選用的是一些患有高血壓、糖尿病、慢性腎病的動物[9]。

2.2 CIN動物模型具體構建方法

CIN在具有危險因素患者身上更加普遍和嚴重[10]。另外，多數(shù)實驗動物特別是正常大鼠能夠耐受高劑量的造影劑而對腎功能不會產(chǎn)生明顯的影響[11]，即使用多種高劑量的造影劑后，動物對造影劑腎毒性的敏感性仍然很低[12]。因此，大多數(shù)CIN模型制備主要分為兩個步驟：先對動物進行預處理形成一種潛在的腎病理改變，然后再使用造影劑進行造模。動物預處理的方式多樣，包括：腎小管毒性藥物使用、腎血管收縮藥物使用、脫水處理、進行部分腎切除、糖尿病大鼠誘導、腎血管結扎等。

2.2.1 腎毒性藥物預處理誘導CIN動物模型

在臨床上，慶大霉素極易引起腎小管受損，嚴重者可導致AKI。 19世紀70年代，就已經(jīng)報道在使用慶大霉素治療的患者中發(fā)生AKI[13]。大劑量慶大霉素進入血液后，絕大部分呈游離狀態(tài)，在體內(nèi)不進行生物轉(zhuǎn)化，大部分以原型從腎小球濾出，只有小部分在近端小管重吸收，因此腎小管中慶大霉素濃度比血漿高數(shù)十倍。在使用慶大霉素治療的患者中，主要的不良反應包括腎小管壞死和腎小球濾過率(GFR)下降[14-15]。19世紀90年代，也有過使用慶大霉素每天預處理進行CIN動物模型制作的報道[16-17]。目前使用慶大霉素每天預處理的注射劑量有50 mg/(kg·bw)[18]、60 mg/(kg·bw)和70 mg/(kg·bw)[19]。

甘油為高滲性物質(zhì)，甘油肌注導致的實驗動物性急性腎小管損傷(ATN)的表現(xiàn)與臨床上某些ATN相似，它同時具備了腎缺血和腎毒性作用[20]。小鼠經(jīng)過甘油預處理后血清尿素氮和肌酐明顯上升，光鏡觀察可以看到腎小管上皮細胞壞死脫落，管腔中存在大量管型。目前使用甘油預處理的濃度為25%，注射劑量為10 mL/(kg·bw)[21-23]。

上述這些藥物的腎小管毒性突出，往往出現(xiàn)廣泛的腎小管上皮變性，與CIN所致腎小管毒性難以鑒別，目前較少使用。

2.2.2 腎血管收縮預處理誘導CIN動物模型

(1)腎血管收縮藥物預處理誘導CIN動物模型

造影劑、吲哚美辛、N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME，一氧化氮合成酶抑制劑),單獨使用幾乎不能造成腎功能不全，只能造成微小的形態(tài)學損傷。無論是在造影劑之前使用吲哚美辛或L-NAME，還是不使用造影劑只聯(lián)合使用吲哚美辛和L-NAME都不能對腎髓袢升支粗段造成持續(xù)性損傷。聯(lián)合使用吲哚美辛或L-NAME預處理后才能形成顯著的腎衰竭，肌酐清除率下降25%，將近一半的髓袢升支粗段壞死[24]。

一氧化氮(nitric oxide，NO)和前列腺素是內(nèi)皮源性血管舒張因子，生理狀態(tài)下持續(xù)釋放來維持血管的擴張狀態(tài)，腎內(nèi)這些擴血管物質(zhì)的產(chǎn)生對保持腎灌注及供氧較差的髓質(zhì)的血流灌注和供氧是重要的，NO和前列腺素在腎對造影劑的反應中有重要的保護作用。在腎疾病狀態(tài)下這些血管活性物質(zhì)的合成減少將使患者更加容易發(fā)展成為造影劑腎病[24]。

造影劑與前列腺素合成酶抑制劑(吲哚美辛)聯(lián)合使用時，可顯著降低腎小球濾過率，然而吲哚美辛本身并不能降低腎功能[25]。運用吲哚美辛可抑制前列腺素的合成，可能使腎傾向于發(fā)生急性腎衰竭(acute renal failure，ARF)[26]和髓質(zhì)缺氧損傷[25]，它被試圖作為一種放大造影劑的腎損傷的方式。吲哚美辛在磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)中溶解，注射劑量為(10 mg/kg)。之所以選擇這種劑量，是因為人們發(fā)現(xiàn)它能有效抑制前列腺素合成，而且對正常大鼠腎功能損傷最小[27]。L-NAME(N-硝基-L- 精氨酸甲酯)能抑制NO的合成，動物模型中L-NAME的注射劑量也為10 mg/(kg·bw)。目前腎血管收縮藥物誘導CIN動物模型的建模方式為吲哚美辛注射15，20或者30 min后注射L-NAME[28-31]。

這一預處理的優(yōu)點是操作迅速，避免了其他預處理的慢長預備和手術步驟，而且目前CIN主流的機制是：腎血管收縮，腎髓質(zhì)缺氧。但是腎血管收縮藥物的間隔給藥時間目前尚未統(tǒng)一，而且這是一種AKI前提下誘導CIN模型，并不能模擬CIN患者慢性腎功能不全、糖尿病、脫水等實際情況，實驗結論缺乏說服力。

(2)脫水預處理誘導CIN動物模型

慢性失水已經(jīng)被證實是造影劑腎病的危險因素[27]。Larson等[32]在脫水的狗身上證實了腎素血管緊張素系統(tǒng)的地位。在已經(jīng)存在的腎素血管緊張素系統(tǒng)中，研究者證實了脫水能夠放大造影劑引起的血管收縮和舒張反應[33]。脫水增加腎血管對造影劑的敏感性，這個原理被用作了CIN動物模型的制備[34]。脫水的處理方式主要為動物禁水和肌肉注射呋塞米10 mg/(kg·bw)。動物禁水的時間大部分為24 h，少部分為48 h和72 h。但是單純的動物脫水幾乎不會影響大鼠的血容量，甚至脫水會讓動物減少食物的獲取，進而降低肌酐和尿素氮水平[35]。

脫水預處理能夠激活腎素血管緊張素系統(tǒng)，導致腎血管收縮，模擬CIN發(fā)病機制腎髓質(zhì)缺氧。然而單純使用脫水進行預處理的模型可能只引起輕微的腎損傷[36]，因此脫水預處理常與其他預處理方式相結合。

腎血管收縮預處理與CIN發(fā)病機制相貼近，但成功率尚不明確，我們課題組曾采用該預處理方式建立CIN模型，但成功率低，為提高成功率，近年來文獻報道采用腎部分切除預處理誘導CIN模型。

2.2.3 腎部分切除預處理誘導CIN動物模型

慢性腎功能不全本身就是引起造影劑腎病的一種危險因素[37]。大鼠部分腎被切除之后，殘余腎單位將出現(xiàn)高灌注和高濾過狀態(tài)，這是導致腎小球硬化和殘余腎單位進一步喪失的主要原因。長期的腎單位的減少會增加大鼠對造影劑損傷的易感性[38]。劉曉城等[39]曾報道過此類慢性腎功能不全動物模型的制備方法，主要分為兩個步驟：先進行右側腎的完全切除，1周后行左側腎上下側切除，保留其中間的1/3，第8周時慢性腎功能不全的動物模型建立成功。然而對于CIN動物模型，常選擇在腎切除5/6后的第6周給予注射造影劑，因為此時的腎功能最穩(wěn)定[40-42]。

該預處理模擬了CIN患者慢性腎功能不全的危險因素，而且預處理效果可靠。缺點在于手術過程腎損傷較大，同時需要熟練操作才能降低動物死亡率。

2.2.4 糖尿病預處理誘導CIN動物模型

糖尿病腎病是造影劑腎病的重要危險因素之一。一項1196例患者(包括216例糖尿病腎病患者)的多中心隨機對照研究表明,在糖尿病腎病合并腎功能不全患者中,當血清肌酐大于或等于4.5 mg/dL時, 造影劑對腎功能損傷的發(fā)生率達100%[43]。糖尿病大鼠8周后，腎皮質(zhì)組織MDA(丙二醇)水平與對照組相比顯著升高，在此基礎上給予造影劑，腎皮質(zhì)組織MDA水平又更進一步升高，且差異有顯著性，提示糖尿病腎病本身就可以產(chǎn)生多種腎損傷因子，給予造影劑后腎損傷加重[44]。Cordaro等[45]將鏈脲佐菌素(STZ)溶解在pH 4.5的檸檬酸鈉緩沖液，以60 mg/(kg·bw)的尾靜脈注射進行預處理，24 h后，血糖水平大于250 mg/dL的動物被認為是糖尿病，10 d后注射造影劑建立CIN模型。然而大部分糖尿病預處理誘導CIN模型都是在糖尿病形成8周后，注射造影劑[44]。

糖尿病預處理模型能很好的模擬CIN患者糖尿病背景，缺陷在于慢性病預備周期較長。

2.2.5 其他預處理誘導CIN模型

將大鼠進行高膽固醇膳食及單側結扎腎動脈、輸尿管等建立CIN動物模型，但是這些預處理的方式運用的極少。為了進一步提高造模的成功率，以上的預處理方式常常多種相結合，如：將腎血管收縮預處理與腎部分切除預處理相結合，將腎血管收縮處理與糖尿病預處理相結合。

2.2.6 造影劑的應用

制備CIN動物模型最核心的步驟是造影劑的應用。目前常用造影劑的類型和劑量分別為：高滲離子型造影劑：泛影葡胺[3000 mgI/(kg·bw)]；低滲非離子型造影劑：碘海醇[3500 mgI/(kg·bw)]、碘帕醇[2900 mgI/(kg·bw)]、碘普羅胺[1600 mgI/(kg·bw)]、碘佛醇[3000 mgI/(kg·bw)]；等滲非離子型造影劑：碘克沙醇[3200 mgI/(kg·bw)]。

大部分造影劑的給藥途徑為尾靜脈，少部分使用的頸內(nèi)動脈和腹腔。腹腔給藥方式最簡單，然而與臨床給藥途徑相悖，運用最少。頸內(nèi)動脈造影劑給藥難度最大，與臨床造影劑動脈給藥途徑相似，周英林等人將大鼠脫水16 h后，用碘帕醇以2900 mgI/kg的劑量通過左頸內(nèi)動脈注射的方式成功建模。CIN模型前期主要應用的高滲離子型造影劑，近年來低滲非離子型造影劑和等滲非離子型造影劑應用比例逐漸增加，這與臨床的應用趨勢相適應。

3 CIN動物模型造模成功的依據(jù)

CIN動物模型常常留取基線血和造模后的血肌酐的水平進行對比，在接觸造影劑48 ～ 72 h 血肌酐絕對值較基礎值升高≥0.5 mg/dL (44.22 μmol /L) 或相對升高≥25%，稱之為CIN動物模型造模成功。然而用肌酐判斷CIN動物模型造模成功存在一定的缺陷，大鼠在進入脫水狀態(tài)下常常會自主減少食物的攝取[45]，這就極易影響肌酐的水平，而且肌酐數(shù)值存在一定的滯后性，需在腎小球濾過率下降達到50%以上時，肌酐才會有所上升，此時腎已存在嚴重的病理改變，因此CIN動物模型造模成功可能更多的需要依賴于腎的病理改變來判斷。

4 小結

CIN的發(fā)病機制是腎血管收縮，腎髓質(zhì)缺氧等。目前尚缺乏統(tǒng)一CIN模型的預處理方式。大多數(shù)CIN動物模型的預處理是為了模擬臨床上CIN患者脫水、腎功能不全、糖尿病、高脂血癥等危險因素，其目的為了使腎形成一種易形成CIN動物模型的狀態(tài)。由于人類疾病的復雜性及特異性，動物模型并不能模擬人類CIN的所有特質(zhì)。CIN動物模型在研究CIN發(fā)病機制及并發(fā)癥方面起著關鍵的作用，相信隨著相關研究的不斷深入，將進一步揭示CIN發(fā)生、發(fā)展的規(guī)律，并為CIN的治療提供幫助。