卵泡發(fā)生過程中能量代謝需求及調(diào)控機制的研究進展

屠豪炎，雷小燦，霍 鵬，樂江華，張 順

1桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，廣西桂林 5410012遵義醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，貴州遵義 563100 桂林醫(yī)學院 3公共衛(wèi)生學院 4附屬醫(yī)院產(chǎn)科，廣西桂林 541001

卵泡發(fā)生起始于原始卵泡的募集，以卵泡排卵或者卵泡閉鎖而終止。卵泡發(fā)育從形態(tài)學上分為原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡、三級卵泡和成熟卵泡，從動態(tài)學上分為原始卵泡的發(fā)育和啟動募集、初級和次級卵泡的發(fā)育、優(yōu)勢化卵泡的選擇、卵泡閉鎖、排卵和黃體生成[1]。女性1個典型的生理周期中約有1000個卵泡開始生長，但是僅有1～2個卵泡最終完成排卵，1名女性的整個生命周期中大約有450～500個卵泡發(fā)生排卵，而在初情期開始到絕經(jīng)期大約有250 000個卵泡發(fā)生閉鎖。

卵泡發(fā)育與女性生育力密切相關(guān)，據(jù)相關(guān)統(tǒng)計表明，我國不孕癥發(fā)生率為10%～15%，并且呈逐年上升趨勢[2]，其中卵泡發(fā)育不良和排卵障礙占該病發(fā)生的20%～40%[3]，然而因卵泡發(fā)育不良所造成不孕癥占不孕癥患者總數(shù)的27%，重復率高達63.8%[4]。文獻報道顆粒細胞能量代謝的異常是造成女性卵泡發(fā)生異常、生育力下降的重要原因[5-6]，因此明確其調(diào)控機制，找到療效確切、方便可行的治療靶點成為學者們共同關(guān)注的熱點問題。本文將著重從卵泡發(fā)生過程中的能量代謝需求及調(diào)控機制的研究現(xiàn)狀進行綜述。

正常卵泡發(fā)生中的能量供求

正常卵泡發(fā)生過程中的能量需求主要依靠顆粒細胞通過其細胞膜上葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(glucose transporter，GLUT)攝取周圍組織中的葡萄糖，經(jīng)糖酵解途徑生成丙酮酸和乳酸作為主要能量來源。隨著卵泡直徑和卵泡液的增加，卵泡液中的乳酸含量亦逐漸增加，而葡萄糖的含量與卵泡直徑呈負相關(guān)，卵泡直徑越大葡萄糖濃度越低[7]，同樣乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)的活性和水平亦有此趨勢[8]。Boland等[9]發(fā)現(xiàn)發(fā)育中的卵泡具有很高的糖酵解活性，當用高濃度的葡萄糖、丙酮酸和乳酸聯(lián)合培養(yǎng)顆粒細胞時，其增殖能力顯著提高[10]。山羊卵母細胞中糖酵解速率是氧化磷酸化的1.5倍，而卵丘卵母細胞復合體中糖酵解速率是氧化磷酸化的3倍之多[11]，特別在低氧狀態(tài)下，卵泡中糖酵解相關(guān)基因GLUT1、GLUT3、己糖激酶(hexokinase，HK)、丙酮酸激酶M2(pyruvate kinase M2，PKM2)和LDH的表達顯著上調(diào)[12-13]。研究提示，卵母細胞不能直接利用糖酵解進行供能，從原始卵泡開始，顆粒細胞就表現(xiàn)出較強的糖酵解活性[14]，顆粒細胞中磷酸果糖激酶(phosphofructokinse，PFK)及LDH的表達顯著高于卵母細胞，在竇卵泡中表達最強，其糖酵解產(chǎn)生的終產(chǎn)物丙酮酸和乳酸可作為卵母細胞的主要能量來源[15]。研究發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)的卵母細胞培養(yǎng)基中加入丙酮酸和乳酸，可通過改善細胞內(nèi)部的氧化還原狀態(tài)和能量供應顯著抑制卵母細胞老化的進程[16]。因此，闡明卵泡顆粒細胞糖酵解途徑生成的丙酮酸和乳酸的調(diào)控過程對卵泡發(fā)育和卵母細胞生長起著重要作用。

疾病狀態(tài)下卵泡發(fā)生的能量供求關(guān)系及對卵泡發(fā)育的影響

多囊卵巢綜合征對卵泡發(fā)生能量代謝的影響多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)是女性常見的生殖內(nèi)分泌代謝性疾病，主要臨床表現(xiàn)為無排卵或稀發(fā)排卵造成的月經(jīng)紊亂、高雄激素血癥、肥胖、卵巢呈多囊樣改變，從而導致不孕[17]。Harris等[18]發(fā)現(xiàn)PCOS患者卵泡的生長同正常組相比需要更多的丙酮酸來維持，同時，磁共振檢測PCOS患者卵泡液中的代謝產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)，乳酸、丙酮酸的含量較正常女性顯著減少[6]。本課題組尚未發(fā)表的前期研究顯示，PCOS大鼠卵巢中GLUT1的表達顯著升高、HK的表達顯著降低，提示PCOS大鼠對葡萄糖的利用能力下降；同時單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白(monocarboxylate transporter2/4，MCT2/4)和LDH、PFK、PKM等限速酶基因的表達下調(diào)，暗示了卵巢中丙酮酸和乳酸濃度的顯著下降，其基因表達結(jié)果同文獻報道的葡萄糖聚集、丙酮酸和乳酸生成減少的表現(xiàn)相一致[19]。Lin等[20]對正常及PCOS患者卵泡液研究發(fā)現(xiàn)，胰島素可以促進正常組卵巢顆粒細胞乳酸形成，而PCOS中則無明顯改變，且體外實驗結(jié)果也表明，高水平睪酮(T)抑制小鼠卵巢顆粒細胞的乳酸生成[21]。以上研究均表明，PCOS患者卵泡生長一方面需要更多的丙酮酸和乳酸刺激才能正常發(fā)育，另一方面高雄激素和胰島素抵抗又降低乳酸的含量，兩方面共同作用表現(xiàn)為維持正常卵泡發(fā)育的代謝物質(zhì)供給遠遠小于需求。

早發(fā)性卵巢功能不全早發(fā)性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，POI)是指女性在40歲以前出現(xiàn)卵巢功能減退，主要表現(xiàn)為月經(jīng)異常(閉經(jīng)、月經(jīng)稀發(fā)或頻發(fā))、促性腺激素水平升高[促卵泡素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)>25 U/L]、雌激素水平波動性下降。而卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)是指女性40歲以前出現(xiàn)閉經(jīng)、促性腺激素水平升高(FSH>40 U/L)和雌激素水平降低，并伴有不同程度的圍絕經(jīng)期癥狀，是POI的終末階段[22]。卵巢顆粒細胞和卵母細胞中線粒體的含量豐富，能夠調(diào)節(jié)顆粒細胞及卵母細胞的ATP水平，為其發(fā)育提供能量。研究發(fā)現(xiàn)，POF患者線粒體DNA(mitochondrial deoxyribonucleic acid，mtDNA)含量比正常人低，且mtRNA突變可以影響細胞內(nèi)氧化磷酸化水平，降低電子呼吸鏈的傳遞，從而影響顆粒細胞凋亡及卵泡發(fā)育[23]。卵泡的閉鎖與顆粒細胞的凋亡密切相關(guān)，線粒體膜通透性增加及活性氧的增多均會導致顆粒細胞凋亡，當大量卵泡發(fā)生閉鎖就會引發(fā)POF。近年研究發(fā)現(xiàn)，線粒體融合蛋白在線粒體中有著重要作用，而Mfn2在卵母細胞成熟中起著重要的調(diào)控作用。應用大鼠POF模型的研究發(fā)現(xiàn)，Mfn2與POF有一定的相關(guān)性，通過降低線粒體膜電位，影響線粒體供能，減少ATP形成，導致卵泡發(fā)育障礙可產(chǎn)生POF[24]。但關(guān)于卵泡發(fā)生過程中能量代謝紊亂與POI的發(fā)病機制和治療方案的研究還鮮見報道。

調(diào)控卵泡發(fā)生過程中能量供求關(guān)系的影響因素

內(nèi)分泌因素卵泡發(fā)育是一個復雜的過程，主要受下丘腦—垂體—性腺軸分泌的生殖激素調(diào)控，垂體分泌FSH和促黃體生成素(luteinizing hormone，LH)作用于卵巢，F(xiàn)SH在促進卵泡生長、成熟，對顆粒細胞增殖、內(nèi)膜細胞分化、卵泡液的分泌均具有促進作用；LH可選擇性誘導排卵前的卵泡生長發(fā)育，并觸發(fā)排卵；刺激顆粒細胞合成雌二醇[25]。研究顯示，F(xiàn)SH在LH協(xié)同作用下可調(diào)控卵泡能量代謝，促進卵泡成熟、排卵。Alvarez等[26]在體外培養(yǎng)豬丘卵母細胞復合體(cumulus-oocyte complexs，COCs)中發(fā)現(xiàn)，在促性腺激素(FSH、LH)作用下，卵丘細胞對葡萄糖的攝取量增加；同樣在體外培養(yǎng)人卵泡顆粒細胞中添加FSH可增加乳酸的生成，提高卵丘細胞的糖酵解速率[26-27]。FSH可以增加大鼠卵巢顆粒細胞GLUT1/GLUT4的表達，從而增加葡萄糖的攝取[28]，且FSH可以通過促進HK、PFK活性上調(diào)，促進乳酸生成，增加腔前卵泡和刺激卵巢中COCs的糖酵解速率[29-30]。FSH和LH在卵泡的發(fā)育過程中側(cè)重于調(diào)控不同的糖酵解限速酶，在小的腔前卵泡(<90 μm)中，LH可上調(diào)PFK活性；而在較大腔前卵泡(90～250 μm)中，F(xiàn)SH主要通過刺激PKM的活性增加卵泡乳酸生成[30]。LH通過結(jié)合卵泡膜細胞(theca cell，TC)上的LH受體，使TC產(chǎn)生雄激素[31]，當發(fā)生PCOS時，機體內(nèi)含有過多的雄激素，阻止優(yōu)勢卵泡發(fā)育，導致卵泡閉鎖及卵子退化[32]。因此，通過結(jié)合生殖內(nèi)分泌和卵泡代謝物含量的檢測，對臨床上判斷PCOS卵泡發(fā)育異常有一定的指導意義。

信號轉(zhuǎn)導通路的調(diào)控近年研究發(fā)現(xiàn)，磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/AKT)和肝激酶B1(liver kinase B1，LKB1)/AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)信號通路相關(guān)因子共同參與調(diào)控卵泡顆粒細胞增殖、卵泡直徑變化、成熟和周期性排卵等過程。報道顯示活化的PI3K可以促進顆粒細胞的增殖和分化，促進卵母細胞的生長及排卵等多個過程，其失活可導致原始卵泡直接從靜止狀態(tài)死亡，但過度激活可使原始卵泡過早發(fā)育及卵泡過快凋亡[21]。

PI3K/AKT是胰島素調(diào)節(jié)糖代謝方向傳遞的關(guān)鍵通路，活化的PI3K通過抑制烯醇式丙酮酸羧激酶(pyruvate carboxykinase，PEPCK)而阻斷糖異生，同時上調(diào)GLUT的表達，增加葡萄糖利用；并通過增強PFK的活性來調(diào)控糖酵解的進程[33]。癌癥相關(guān)研究顯示，抑制PI3K/AKT通路后可顯著降低食管癌細胞的糖酵解速率，同時GLUT和HK蛋白的表達也著降低[34]。Jiang等[35]發(fā)現(xiàn)LKB1/AMPK信號通路也參與了卵泡的發(fā)生，LKB1的缺失可以降低AMPK活性，導致原始卵泡池過早激活，甚至造成POF。相關(guān)研究表明，AMPK(AMP依賴性蛋白激酶)為葡萄糖感受器，LKB1是其上游激酶，多年以來人們認為AMP/ATP比值為AMPK激活的調(diào)控核心，而林圣彩等[36]發(fā)現(xiàn)，LKB1可通過調(diào)節(jié)糖酵解關(guān)鍵酶—醛縮酶的機制激活AMPK。有學者發(fā)現(xiàn)，當AMPK激活后心肌的葡萄糖攝取量增加，激活PFK，增加糖酵解通量，同時減少PEPCK和葡萄糖- 6-磷酸酶(glucose- 6-phosphatase，G6P)的表達來抑制糖異生[37- 38]。本課題組尚未發(fā)表的前期研究顯示，PCOS大鼠卵巢中的AKT和AMPK的表達水平顯著降低，與卵巢中糖酵解相關(guān)限速酶的表達趨勢一致，可以相信一定程度上激活PI3K/AKT及LKB1/AMPK信號通路可調(diào)控顆粒細胞糖酵解的活性并促進卵泡發(fā)育。但目前關(guān)于PI3K/AKT和LKB1/AMPK信號通路在調(diào)控卵泡發(fā)育中的能量代謝的機制還需進一步研究證實。

microRNA對卵泡發(fā)生能量代謝的調(diào)控microRNA(miRNA)是由長約22個核苷酸構(gòu)成的內(nèi)源性非編碼的單鏈小RNA分子。在不同哺乳動物卵巢中，miRNAs都大量表達，并參與調(diào)控卵泡生長、閉鎖、排卵和類固醇生成[39-40]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR- 155可顯著上調(diào)HK、GLUT、PFK、PKM2、LDH的表達；同時，過表達的miR- 155通過靶向激活細胞C/EBPβ(miRNA- 143轉(zhuǎn)錄激活劑)的表達，抑制miR- 143，增加細胞葡萄糖的消耗和乳酸的形成，促進細胞糖酵解代謝[41- 42]。不僅如此，許多miRNA也參與抑制糖酵解通路，研究發(fā)現(xiàn)miR- 93也與GLUT4相關(guān)，在機體中平衡胰島素抵抗起著重要作用，尤其是在PCOS患者中，通過上調(diào)miR- 93的表達來調(diào)節(jié)胰島素從而控制機體對葡萄糖的攝入[43]。miR- 143的過表達被證明在諸多癌癥中，如：結(jié)直腸癌、宮頸癌、前列腺癌等中具有抑制生長作用，它通過抑制HK的表達來抑制葡萄糖的代謝[44]，miR- 326表達增加可以降低PK的表達致使細胞凋亡[45]，miR- 34a通過對LDH的抑制來下調(diào)糖酵解速率，減緩細胞的生長發(fā)育。盡管卵巢中miRNA的功能研究越來越多，但是關(guān)于卵巢中miRNA如何通過調(diào)控卵泡能量代謝參與卵泡發(fā)生，特別是卵泡液外泌體中miRNA作為鑒定卵泡發(fā)育異常指標的研究將成為卵泡發(fā)生領域研究的熱點。

乙?；揎棇β雅莅l(fā)生能量代謝的影響組蛋白乙酰化修飾是表觀轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要機制，主要通過組蛋白乙酰化酶(histone acetylase，HAT)和組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)分別介導乙?；腿ヒ阴；M程，幾乎參與了細胞所有的正?；顒?，調(diào)控生命進程[46]。同時敲除HDAC1及HDAC2則會導致小鼠的生殖功能障礙，各級卵泡數(shù)量減少并且卵泡閉鎖及卵母細胞凋亡數(shù)量增多[47- 48]。研究發(fā)現(xiàn)糖酵解的關(guān)鍵限速酶，如：PKM2、LDHA和PEPCK1受到乙?；恼{(diào)控[49]。PKM2在高糖狀態(tài)下可發(fā)生乙?；?，導致細胞中乳酸集聚，促進腫瘤細胞的增殖和生長[50]；LDH乙?；蠡钚员灰种?，腫瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移受阻，而當LDH發(fā)生去乙酰修飾時，其活力增加，促進癌細胞生長和代謝[51]。Sirtuins家族(SIRT1- 7)屬于高度保守并依賴NAD+的HDAC，研究發(fā)現(xiàn)SIRT1在卵巢中表達量顯著高于其他組織，在卵巢顆粒細胞的表達中顯著高于卵巢其他細胞[52]。SIRT1可使肝臟中糖異生相關(guān)基因過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助激活因子- 1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator- 1-alpha，PGC- 1A)去乙?；?，抑制葡萄糖輸出，上調(diào)PKM及葡萄糖激酶糖酵解基因的表達[53]。SIRT2可使癌細胞中乳酸脫氫酶A(lactate dehydrogenase A，LDHA)發(fā)生去乙?；?，提升Warburg效應，增強癌細胞的增殖和分化[54]。SIRT6被報道可以通過去乙?；揎椊M蛋白H3K9來抑制糖酵解基因，抑制LDH的轉(zhuǎn)錄，將丙酮酸轉(zhuǎn)移至線粒體三羧酸循環(huán)以產(chǎn)生高效ATP[55]。因此，闡明卵泡發(fā)生過程中能量代謝的乙?；揎棛C制對臨床治療因卵泡發(fā)育不良導致的女性不孕具有重要意義。

綜上，能量代謝貫穿卵泡發(fā)生的全過程，在卵泡生長發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。盡管本文已從傳統(tǒng)的內(nèi)分泌、信號傳導通路以及近年來熱門的miRNA、表觀遺傳4個方面初步闡述卵泡發(fā)生過程中能量調(diào)控機制，但各因素協(xié)作調(diào)控分子機制還有待深入研究。相信隨著分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展與進步，探索卵泡發(fā)生過程中能量代謝及其調(diào)控機制，將成為當前生殖醫(yī)學研究的熱點。探討能量代謝產(chǎn)物變化及其調(diào)控機制的關(guān)系，破解其在卵泡發(fā)生過程中的重要作用，可為全面闡述卵泡發(fā)生過程中能量代謝的分子機制奠定理論基礎，并為臨床上治療女性不孕及女性生殖系統(tǒng)疾病提供新的指導。