登革熱動物模型研究進(jìn)展

陳 倩，鮑琳琳，王 衛(wèi)

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所，新發(fā)再發(fā)傳染病動物模型研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，衛(wèi)健委人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

理想的登革病毒感染動物模型是登革熱防治研究的基礎(chǔ)平臺之一。研究表明，登革病毒可感染部分實(shí)驗(yàn)動物，如實(shí)驗(yàn)小鼠和恒河猴等，但要建立動物模型，均存在一些缺陷。例如，登革病毒可感染免疫缺陷小鼠，出現(xiàn)部分重癥登革熱的臨床癥狀，如出血熱、血管滲漏等，但需進(jìn)一步驗(yàn)證免疫反應(yīng)的產(chǎn)生情況[1-3]。登革病毒可在非人靈長類動物(non-human primates, NHP)體內(nèi)有效復(fù)制，并誘發(fā)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，但不出現(xiàn)明顯的臨床表現(xiàn)。因此，了解每種登革病毒感染動物模型的優(yōu)、缺點(diǎn)，揚(yáng)長避短，努力開展登革熱動物模型研究，才能有效支持登革熱發(fā)病機(jī)理、抗病毒藥物和疫苗的臨床前評價(jià)等研究。本文通過介紹登革病毒感染動物模型的最新進(jìn)展，闡明其制備方法和研究意義，為今后登革病毒感染疾病的預(yù)防與控制研究提供基礎(chǔ)信息。

1 登革熱動物模型研究進(jìn)展

1.1 小鼠模型

為建立登革病毒感染模型，進(jìn)行登革熱發(fā)病機(jī)制研究及防治策略評價(jià)，科研人員最初使用登革病毒感染免疫健全小鼠?；诟蓴_素(IFN)對登革病毒復(fù)制的影響，又相繼使用了IFN受體敲除小鼠、I-IFN受體敲除小鼠、條件性I-IFN受體敲除小鼠、及人源化小鼠等。由于動物的免疫系統(tǒng)不盡相同，其臨床表現(xiàn)也不同，具體如下。

1.1.1 免疫健全小鼠模型

研究表明，登革病毒可感染野生型小鼠，即免疫健全小鼠，如A/J、BALB/c、C57BL/6等品系，雖然只出現(xiàn)暫時(shí)的病毒復(fù)制[2]。有報(bào)道指出，DENV-2病毒感染A/J小鼠后第2天，動物出現(xiàn)輕微的病毒血癥，能通過RT-PCR方法檢測出來[4]。DENV-2病毒感染C57BL/6小鼠，外周血液中病毒含量呈峰狀，感染后第1天病毒含量增加，第3天達(dá)到高峰，第5天呈下降趨勢。與其他受到感染的動物相比，DENV-2病毒感染BALB/c小鼠后，其血液中病毒滴度相對較低，很難檢測出來[5]。因此，登革病毒在不同品系小鼠內(nèi)的復(fù)制水平不盡相同。此外，小鼠的日齡也會影響登革病毒的感染和復(fù)制，登革病毒顱內(nèi)接種野生型乳鼠，可表現(xiàn)出外周病毒血癥[6]。因此，登革病毒感染免疫健全小鼠只能建立感染模型，無法建立致病模型。

1.1.2 AG129小鼠模型

鑒于干擾素(IFN)在抗病毒中的作用，推測IFN可抑制登革病毒感染。為此，研究者利用缺乏IFNɑ/β、IFNγ受體的AG129小鼠構(gòu)建了登革病毒感染模型。登革病毒感染AG129小鼠后，病毒復(fù)制水平較高，不僅出現(xiàn)病毒血癥、血小板減少和血漿滲漏等典型重癥登革熱的臨床癥狀，還會產(chǎn)生細(xì)胞因子風(fēng)暴引起的免疫病理反應(yīng)等，因而成為登革病毒感染模型的常用動物。此外，為進(jìn)一步完善該模型，科研人員還使用登革病毒在小鼠體內(nèi)進(jìn)行代及適應(yīng)，分別建立了DENV1-DENV4感染AG129小鼠模型。如Gregg N. Milligan等建立的DENV-2感染AG129小鼠的致死模型。他使用一種在AG129小鼠體內(nèi)可產(chǎn)生神經(jīng)癥狀的DENV-2病毒株P(guān)L046，在蚊子細(xì)胞和AG129小鼠之間交替?zhèn)鞔?，模擬蟲媒病毒的生命周期，產(chǎn)生的新病毒株命名為D2S10。該小鼠模型能很好地模擬登革熱的臨床表現(xiàn)，且不會產(chǎn)生神經(jīng)癥狀。由于AG129小鼠微弱的固有免疫反應(yīng)，登革病毒臨床株(如S221和D2Y98P等)也能產(chǎn)生的很好的感染效果。其中以C0360/94(DENV-3病毒株)及703-4(DENV-4毒株)分別感染AG129小鼠，均會產(chǎn)生神經(jīng)癥狀[7-9]。為明確不同血清型病毒對AG129小鼠的影響，Vanessa V. Sarathy在AG129小鼠及其他小鼠模型中對DENV-4(TVP-376)與DENV-2(D2S10)的易感性進(jìn)行了比較。發(fā)現(xiàn)TVP-376病毒株感染小鼠會導(dǎo)致高病毒載量，然而，與D2S10和C0360/94不同，TVP-376病毒株感染小鼠不會引起血小板減少[10-13]。此后，又有報(bào)道描述了DENV-1非適應(yīng)株(West Pacific 74)感染AG129小鼠模型，采用相同感染方法，可使小鼠致死。然而，West Pacific 74病毒株可使小鼠產(chǎn)生延遲致死性感染，且血管滲漏不明顯，與其他模型具有差異[14]。

1.1.3 I型干擾素受體敲除小鼠

由于I型干擾素(I-IFN)對登革病毒復(fù)制產(chǎn)生主要影響，因而科研人員開始使用I型干擾素受體敲除小鼠用于登革病毒感染研究。Susana Orozco等使用105、106或107pfu D2S10及其衍生毒株D220，靜脈接種6～8周齡的IFN-α/β受體敲除的C57BL/6小鼠，并觀察至第14天，發(fā)現(xiàn)D220在IFN-α/β受體敲除小鼠中的致死率高于其親代株。在非抗體依賴性增強(qiáng)的條件下，與之前使用D2S10病毒株感染缺乏IFN-α/β和γ受體的AG129小鼠的模型相比，使用低劑量感染免疫受損較低的IFN-α/β受體敲除小鼠，并產(chǎn)生登革熱類似癥狀是一種改進(jìn)[13]。

1.1.4 條件性敲除I型干擾素受體小鼠

缺乏I型和II型干擾素受體或僅缺乏I型IFN受體的小鼠對登革毒株易感，但感染模型的免疫系統(tǒng)嚴(yán)重受損，限制了該模型的廣泛應(yīng)用。Roland Züst等通過條件性敲除部分免疫細(xì)胞的I型IFN受體獲得新的模型——條件性敲除I型干擾素受體小鼠，該小鼠具有免疫保護(hù)且對登革病毒敏感。如在CD11c+樹突細(xì)胞和LysM+巨噬細(xì)胞上敲除IFNAR后，小鼠可被登革病毒感染并致死；而僅在CD11c+或LysM+細(xì)胞上敲除IFN受體后，小鼠易受感染，但感染一段時(shí)間后小鼠體內(nèi)的病毒血癥會被消除，從感染中完全恢復(fù)。與IFNAR-/-小鼠相比，條件性敲除IFNAR小鼠對登革病毒感染具有快速且強(qiáng)烈的CD8+T細(xì)胞反應(yīng)。此外，在CD11c+或LysM+細(xì)胞上缺乏IFNAR的小鼠也具有足夠的免疫活性，對DENV-2亞單位候選疫苗可以產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答。這些數(shù)據(jù)表明，在登革病毒免疫研究和疫苗候選物篩選方面，條件性IFNAR表達(dá)缺陷的小鼠是一種改進(jìn)模型[15-16]。

1.1.5 人源化小鼠模型

NOD/SCID等免疫缺陷小鼠缺乏T細(xì)胞、B細(xì)胞，且NK細(xì)胞功能缺陷、抗原呈遞細(xì)胞發(fā)育和功能缺陷，溶血性補(bǔ)體缺乏，為人類造血細(xì)胞和組織的重建提供了良好的平臺[17]?？蒲腥藛T將登革病毒的靶細(xì)胞或其前體細(xì)胞注入免疫缺陷小鼠，構(gòu)建人源化小鼠。該動物具有人的部分細(xì)胞，可以使小鼠更好地感染上登革病毒，并引發(fā)人類部分針對登革病毒的特異性免疫應(yīng)答。Jaiswal等[18]表明，使用臍帶血造血干細(xì)胞移植的NOD-scidIL2rγnull(NSG)小鼠支持登革病毒感染。來自HLA-A2轉(zhuǎn)基因NSG小鼠的人T細(xì)胞在用登革病毒多肽刺激后可產(chǎn)生IFN-γ和TNF-α。這些小鼠還產(chǎn)生針對登革病毒包膜蛋白的IgM抗體[18]。使用DENV-2臨床株感染人源化NSG小鼠(接種了人臍帶血CD34+細(xì)胞)表現(xiàn)出登革熱疾病的臨床癥狀(如發(fā)熱、病毒血癥、紅斑和血小板減少癥等)[19]。研究還證明，登革病毒可感染人源化小鼠的骨髓、脾和血液中人的細(xì)胞，使其分泌有效的細(xì)胞因子和趨化因子[20]。

1.2 非人靈長類動物模型

登革病毒感染的自然宿主是人類和伊蚊。雖然非人靈長類動物感染登革病毒后不會產(chǎn)生典型的臨床癥狀，但也會出現(xiàn)病毒血癥及免疫反應(yīng)，因此，NHP動物模型可用于研究感染病毒后的免疫反應(yīng)，或評估候選疫苗[21]。目前，登革研究常用的NHP動物有恒河猴、食蟹猴和新世界猴等[3, 22]。

1.2.1 恒河猴模型(Rhesus macaques)

登革病毒感染恒河猴模型主要用于登革熱疫苗的研發(fā)與評價(jià)。有研究表明，表達(dá)DENV-2的非結(jié)構(gòu)蛋白NS5的登革病毒疫苗，在所有接種的恒河猴體內(nèi)均誘導(dǎo)產(chǎn)生針對DENV-2的中和抗體，但所產(chǎn)生病毒血癥的情況與預(yù)期結(jié)果不同，原因尚不清楚。這是在恒河猴模型中首次嘗試使用重組皰疹病毒載體疫苗來預(yù)防登革熱，并通過此模型來評價(jià)疫苗的免疫反應(yīng)，在未來的實(shí)驗(yàn)中還可進(jìn)一步探索新免疫原的效力和廣度[23]。Stefan Fernandez等使用登革病毒感染恒河猴模型，評估了新的TDENV PIV疫苗候選物的免疫原性及其免疫保護(hù)作用。結(jié)果顯示，具有明礬或佐劑系統(tǒng)的疫苗制劑具有良好的耐受性，在第二次免疫1個(gè)月后仍具有對四種血清型登革病毒強(qiáng)烈且持久的中和抗體應(yīng)答[24]。

1.2.2 狨猴模型

Ananindeua等使用DENV-3感染黑羽狨((Callithrix penicillata)，測定其病毒載量、IgM和IL-6、TNF-α、IL-2、IFN-γ、IL-4等各種細(xì)胞因子及血細(xì)胞參數(shù)，從而進(jìn)行其外周血標(biāo)志物的動力學(xué)研究。對標(biāo)志物的網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，在登革病毒感染早期，黑羽狨體內(nèi)有兩條主要路線具有保護(hù)作用，分別是：ɑ干擾素/淋巴細(xì)胞/血小板，以及病理性的IL-2/IL-6/病毒血癥/單核細(xì)胞/凝血酶原(PT bond)[25]。Meng Ling Moi等在普通狨模型(Callithrix jacchus)中評估了二次異型登革病毒感染，先后使用兩種血清型登革病毒感染狨猴，分析其繼發(fā)感染后的病毒血癥模式和抗體反應(yīng)。結(jié)果表明：繼發(fā)性感染后，狨猴的病毒血癥和抗體反應(yīng)與人類一致，并表明狨猴模型可用于研究登革病毒的原發(fā)性和繼發(fā)性感染[26]。

1.2.3 東非狒狒模型(Olive baboon, Papio anubis)

Iris Valde’s等評估了非人靈長類動物東非狒狒(Papio anubis)作為登革熱感染模型的可能性。使用103PFU和104PFU的2型登革病毒(DENV-2)分別感染東非狒狒和非洲綠猴，在兩種動物體內(nèi)都檢測到較高水平的病毒血癥，以及由中和抗體組成的體液免疫反應(yīng)。雖然感染該病毒的狒狒體內(nèi)陽性病毒的檢出通常比非洲綠猴晚一天，但狒狒為DENV-2的實(shí)驗(yàn)性感染提供了另一種非人靈長類動物模型[3]。

2 動物模型的應(yīng)用

2.1 發(fā)病機(jī)制中的應(yīng)用

流行病學(xué)研究表明，不同血清型DENV導(dǎo)致的繼發(fā)感染，會增加疾病(DF/DHF)的嚴(yán)重性[27]。為了解釋這種流行病學(xué)觀察，主要有兩個(gè)假說：ADE和“T細(xì)胞抗原原罪(Original Antigenic Sin, OAS；亦稱原始抗原過失)”?；赥細(xì)胞的“抗原原罪”假說表明，繼發(fā)性登革病毒感染的增強(qiáng)主要由于非保護(hù)性交叉反應(yīng)性T細(xì)胞的存在。有研究通過使用在IFN-α/βR-/-小鼠體內(nèi)表達(dá)人CD8+T細(xì)胞表位而建立的的HLA*B0702轉(zhuǎn)基因小鼠，比較了血清型特異性和交叉反應(yīng)性T細(xì)胞在DENV感染后，對機(jī)體的保護(hù)與在發(fā)病機(jī)制中的作用。其結(jié)果提示，保護(hù)性CD8+T細(xì)胞對DENV感染具有保護(hù)作用。但交叉反應(yīng)性T細(xì)胞在DHF/DSS發(fā)展的晚期可能具有促進(jìn)發(fā)病的作用。這也說明，交叉反應(yīng)性T細(xì)胞在大多數(shù)繼發(fā)感染病例中是保護(hù)性的，但是一些未知因素導(dǎo)致其在DHF/DSS患者中將T細(xì)胞的功能從保護(hù)性轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏⌒訹28-29]。

通過對登革病毒感染動物模型的研究，使用DENV1-4感染IFNɑ/β、IFNγ受體缺乏的AG129小鼠產(chǎn)生的致死性模型可以用來了解登革熱的發(fā)病機(jī)制，但該模型的一個(gè)缺點(diǎn)是，在使用小鼠適應(yīng)性毒株時(shí)，會產(chǎn)生神經(jīng)癥狀，且即使在這些干擾素受體敲除小鼠中，大多數(shù)登革病毒分離株也不會誘導(dǎo)DHF樣癥狀，只有一部分登革病毒分離株在此背景下提供致死性感染，說明病毒序列在動物模型建立中具有不同的組織嗜性。人源化小鼠模型的應(yīng)用可使登革病毒體內(nèi)感染人細(xì)胞，并引發(fā)人特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)[30]。使用這些動物模型可以促進(jìn)對登革熱發(fā)病機(jī)制的理解與研究[31]。免疫健全小鼠模型表現(xiàn)出對登革病毒感染具有抗性，因?yàn)樗鼈兊南忍烀庖呦到y(tǒng)能夠有效地清除全部病毒，但通過使用小鼠適應(yīng)性毒株或不同的人工感染途徑，例如顱內(nèi)或腹腔注射，可增強(qiáng)毒株的致病力，使該模型能用于發(fā)病機(jī)制的研究及治療藥物和疫苗的測試[6, 32-33]。

2.2 疫苗研究中的應(yīng)用

雖然非人靈長類動物模型(NHP)不會產(chǎn)生登革熱的典型癥狀，但仍可用于研究病毒感染后的免疫反應(yīng)以及評估候選疫苗。其中，東非狒狒在遺傳和生理上與人類非常相似，在病毒血癥期間能夠提供足夠的血液來測試評估登革熱疫苗的參數(shù)，因而已廣泛用于評價(jià)新型疫苗的有效性[3]。目前有研究使用恒河猴模型來評價(jià)減毒活疫苗候選物的抗體反應(yīng)及保護(hù)作用，以及候選TDENV PIV疫苗制劑的免疫原性和保護(hù)效力，因此可用該模型進(jìn)行疫苗的臨床前研究[24]。

2.3 抗病毒藥物測試中的應(yīng)用

Natalia Frias-Staheli等證明，人源化小鼠易受登革病毒臨床分離株感染，產(chǎn)生病毒特異性的適應(yīng)性免疫應(yīng)答，并對抗病毒藥物治療有反應(yīng)。雖然需要對該模型進(jìn)一步改進(jìn)，但已證明，人源化BLT小鼠是研究登革病毒感染和發(fā)病機(jī)制及抗病毒藥物和候選疫苗臨床前測試的合適模型[34]。有研究表明，可使用骨髓細(xì)胞亞群Ifnar表達(dá)缺失的模型小鼠(LysM Cre+Ifnarf1/f1)篩選新的治療性藥物；該模型出現(xiàn)出包括血管滲漏，血液濃縮，血小板減少和肝損傷等病理表現(xiàn)，可以很好地再現(xiàn)部分人類感染登革病毒后的疾病癥狀，從而為藥物的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)[35]。

3 討論

隨著登革病毒感染率和發(fā)病率不斷上升，登革熱的防治已迫在眉睫。雖然研究者們一直致力于探究登革熱的感染機(jī)制，研發(fā)抗病毒藥物與預(yù)防性疫苗，但一直沒有很好的動物模型能夠完全再現(xiàn)人類感染登革病毒后的臨床癥狀及病理變化?，F(xiàn)有登革病毒感染小鼠模型及非人靈長類動物模型表現(xiàn)出部分典型的病毒血癥、抗體反應(yīng)及臨床與病理表現(xiàn)，可用于登革熱致病機(jī)理、疫苗及抗病毒藥物的測試與研究，但這些動物模型仍具有對病毒不敏感、病毒復(fù)制水平低、病理表現(xiàn)異化或臨床表型不明確等缺點(diǎn)，還需要繼續(xù)深入研究，推動動物模型不斷成熟和完善，從而支撐登革熱致病機(jī)制和多價(jià)疫苗的研究。