結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移裸鼠模型的建立

李華馳，熊治國，謝 敏，談 凱，殷 濤，馮茂輝

(1. 湖北省腫瘤醫(yī)院胃腸外科，武漢 430079；2. 武漢大學(xué)中南醫(yī)院胃腸外科，武漢 430000)

結(jié)腸癌血行轉(zhuǎn)移最常見的靶器官是肝，約50%以上的患者最終會出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移[1]。目前根治性手術(shù)切除是唯一能根治結(jié)腸癌的方法，但手術(shù)切除后仍有20%～50%患者出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移，5年生生存率低于10%[2]。因此結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后的最主要因素。研究和建立結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的動物模型，對于結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的防治具有重要意義。目前裸鼠造模方法主要有脾注射法、門靜脈注射法、盲腸原位種植、肝注射等[3]。他們的優(yōu)缺點及適用范圍仍有爭論。本實驗采用脾注射法模擬結(jié)腸癌細(xì)胞經(jīng)血行轉(zhuǎn)移至肝的途徑和過程，采用保脾法及切牌法兩種方式構(gòu)建裸鼠肝轉(zhuǎn)移模型，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細(xì)胞

鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT26購自武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心，人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116由腫瘤生物學(xué)行為湖北省重點實驗室提供。

1.1.2 實驗動物

SPF級雄性Balb/c 裸鼠15只，體重20～24 g, 6～8周齡，SPF級雄性Balb/c 小鼠5只,體重20～24 g，6～8周齡，均購自武漢大學(xué)動物實驗中心[SCXK(鄂)2016-0016]，均放置于武漢大學(xué)A3實驗室飼養(yǎng)并于武漢大學(xué)動物試驗中心進行實驗[SYXK(鄂) 2018-0004]。根據(jù)生物安全及生物倫理指導(dǎo)原則，實驗動物飼養(yǎng)和實驗過程中均按實驗動物3R原則給予人道的關(guān)懷。本研究實驗動物福利倫理委員會的批準(zhǔn)號：201801006。

1.2 主要試劑與儀器

1640培養(yǎng)基(Hyclone公司)、MEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)、胎牛血清(Hyclone公司)、青-鏈霉素雙抗(Beyotime公司)、PBS緩沖液(Gibco公司)。YN-02R1型全自動染色機(深圳市永年科技有限公司)、YN-02B1型組織包埋機(深圳市永年科技有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HCT116、CT26細(xì)胞使用含10% FBS的1640培養(yǎng)基于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)傳代，取對數(shù)生長期的癌細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，臺盼藍(lán)染色測定細(xì)胞活力>95%，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5×107/mL。

1.3.2 實驗分組

分為4組:將15只Balb/c裸鼠分為3組，每組5只，另外5只Balb/c小鼠單獨成組。A組：將HCT116細(xì)胞注射入Balb/c裸鼠脾并保留脾建模；B組：將HCT116細(xì)胞注射入Balb/c裸鼠脾并切除脾建模；C組：將CT26細(xì)胞注射入Balb/c裸鼠脾并保留脾建模；D組：將HCT116細(xì)胞注射入Balb/c小鼠脾并保留脾建模。

1.3.3 裸鼠肝轉(zhuǎn)移建模方法

(1)保脾法：小鼠稱重后麻醉，麻醉成功后，用膠帶固定小鼠四肢于手術(shù)臺上，使用碘酒皮膚消毒，鋪無菌孔巾，于左側(cè)腋后線肋緣下行縱行切口，長約0.5～1 cm，剪開腹膜,進腹后于左腹腔外側(cè)找到脾，牽出腹腔外，用1 mL注射器從脾下極貼近脾包膜向上進針，將測定細(xì)胞濃度為2.5×107/mL的HCT116、CT26細(xì)胞懸液0.2 mL緩慢注射于脾內(nèi)，約3～5 min，見注射部位變紅、腫脹后拔針，立即用酒精棉球按壓針眼直至無活動性出血，依次間斷縫合腹膜、皮膚，關(guān)腹。

(2)切脾法：麻醉、消毒及入腹步驟同保脾法，進腹后于左腹腔外側(cè)找到脾，牽出腹腔外，用1 mL注射器從脾下極貼近脾包膜向上進針，將測定細(xì)胞濃度為2.5×107/mL的HCT116細(xì)胞懸液0.2 mL緩慢注射于脾內(nèi)，約3～5 min，見注射部位變紅、腫脹后拔針，輕揉脾，擠壓癌細(xì)胞經(jīng)脾靜脈進入肝，5～10 min后結(jié)扎脾血管并切除脾，依次間斷縫合腹膜、皮膚，關(guān)腹。

1.3.4 觀察指標(biāo)

術(shù)后將四組小鼠置入溫箱中保暖，腹腔注射0.1 mL濃度為1%的哌拉西林，蘇醒后給予葡萄糖鹽水飼養(yǎng)，繼續(xù)在SPF3級實驗室IVC內(nèi)獨立飼養(yǎng)。待小鼠自然死亡后觀察肝表面轉(zhuǎn)移癌結(jié)節(jié)數(shù)目、大小、位置， 雙肺、腹腔受累情況，有無腹腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腹水。切除整個肝，稱重后切除轉(zhuǎn)移灶組織，用10%福爾馬林固定后石蠟包埋，連續(xù)組織切片，行HE染色，常規(guī)病理學(xué)檢查，以明確肝轉(zhuǎn)移情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般情況對比

手術(shù)后各組動物一般情況對比見表1。

表1 模型小鼠一般情況對比

2.2 生存時間

對各組的平均生存時間進行方差分析，統(tǒng)計數(shù)據(jù)進行方差分析，F(xiàn)=26.36。A組生存時間平均為(26.6±3.4) d；B組(P<0.05)生存時間顯著高于A組平均為(36.8±4.2) d；C組(P<0.05)顯著低于B組，與A組無顯著性差異(P>0.05)生存時間平均為(20.2±2.6) d；D組顯著高于其他三組(P<0.05)，平均生存時間為(45.6±2.8) d。見圖1。

注：*P<0.05。圖1 各組鼠的平均生存時間Note. *P<0.05.Figure 1 Mean survival time of the mice in each group

2.3 肝轉(zhuǎn)移率及肝轉(zhuǎn)移灶情況

統(tǒng)計數(shù)據(jù)進行方差分析，F(xiàn)=15.39。A組：肝轉(zhuǎn)移率為100%；結(jié)節(jié)數(shù)目為(4.6±0.4)個/每只，尺寸為(0.12±0.08) cm3；B組：肝轉(zhuǎn)移率為40%，顯著低于A組(P<0.05)，結(jié)節(jié)數(shù)目為(8.3±0.6)個/每只，顯著高于A組(P<0.05)，尺寸(0.08±0.05) cm3無顯著差異；C組：肝轉(zhuǎn)移率為100%顯著高于B組(P<0.05)，尺寸為(2.25±0.4) cm3，顯著高于A組和B組(P<0.05)，結(jié)節(jié)數(shù)目為(12.6±2.3)個/每只，顯著高于A組和B組(P<0.05)；D組未見肝癌轉(zhuǎn)移。見圖2。

2.4 脾原位腫瘤及其他部位轉(zhuǎn)移情況

統(tǒng)計數(shù)據(jù)進行方差分析，F(xiàn)=12.36。A組脾注射部位均成瘤，大小約(1.11±0.3) cm3；C組脾注射部位均成瘤，大小約(1.4±0.3) cm3顯著高于A組(P<0.05)。D組小鼠脾無瘤體形成。A組腹腔轉(zhuǎn)移率100%；B組腹腔轉(zhuǎn)移率40%；C組腹腔轉(zhuǎn)移率100%，A組和C組均顯著高于B組(P<0.05)。心、肺、腦、腎均未見轉(zhuǎn)移灶。見圖3。

2.5 病理學(xué)檢查

A組高倍鏡下可見大量成片癌細(xì)胞聚集成團，成巢狀，細(xì)胞核體積大，深染，核分裂相多見，胞漿少。B組高倍鏡下癌細(xì)胞聚集成團，并形成癌結(jié)節(jié)，細(xì)胞異型性明顯，細(xì)胞核深染，可見核分裂像。C組在高倍鏡下可見成片腫瘤細(xì)胞聚集，伴明顯壞死，癌細(xì)胞核深染，分化差，有明顯的異形性，部分可見核分裂象。D組無肉眼可見轉(zhuǎn)移及種植，組織病理學(xué)檢查也未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶。見圖4。

3 討論

腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是非隨機性的，具有明顯器官特異性，如乳腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移靶器官多為肺、骨、肝，前列腺癌的骨轉(zhuǎn)移，結(jié)腸癌最常見的侵襲轉(zhuǎn)移靶器官為肝、肺[4]。侵襲轉(zhuǎn)移是腫瘤患者最主要的死亡原因。因此建立一種操作簡便、穩(wěn)定性高、模擬性好的結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型，對研究結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生機制具有十分重要的意義。

注：a：肝轉(zhuǎn)移率；b：肝結(jié)節(jié)數(shù)；c：結(jié)節(jié)平均尺寸。*P<0.05。圖2 肝轉(zhuǎn)移率及肝轉(zhuǎn)移灶情況Note. a, Liver metastasis rate. b, Number of liver cancer nodules. c, Mean size of liver cancer nodules.* P<0.05.Figure 2 Liver metastasis rate and liver metastases

注：a：腹腔轉(zhuǎn)移率；b：腫瘤平均尺寸。*P<0.05。圖3 脾原位腫瘤及其他部位轉(zhuǎn)移情況Note. a, Peritoneal metastasis rate. b, Mean tumor size.*P< 0.05.Figure 3 The splenic orthotopic tumors and other metastatic sites

注：A～D：分別為A、B、C、D組病理切片。圖4 裸鼠肝病理組織切片(HE染色，× 10)Note. A-D, Pathological sections from Groups A, B, C and D, repectively.Figure 4 Histopathological changes in the mouse liver tissues. HE staining

目前裸鼠造模方法主要有脾注射法、門靜脈注射法、盲腸原位種植、肝注射等，各有優(yōu)缺點。門靜脈注射法肝轉(zhuǎn)移率高達80%～100%，但其操作困難，且易發(fā)生門靜脈癌栓，導(dǎo)致癌栓外溢造成腹腔內(nèi)播散性轉(zhuǎn)移，死亡率高。肝注射法操作簡單，肝成瘤率高，但周圍極少發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移的瘤體結(jié)節(jié)，不能模擬結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特性[5]。盲腸原位種植被認(rèn)為最能模擬結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的造模方法，但肝轉(zhuǎn)移成瘤率低，在發(fā)生肝轉(zhuǎn)移前因原位種植部位瘤體生長過快，瘤體過大造成腸梗阻而導(dǎo)致小鼠過早死亡[6]。1984年Kozlowski提出癌細(xì)胞脾注射法是研究結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的最佳模式[7]。脾注射癌細(xì)胞建模模擬了結(jié)腸癌術(shù)后肝血行轉(zhuǎn)移肝的過程，造模成功率較高。原因是將足夠數(shù)量的結(jié)腸癌細(xì)胞注射到脾內(nèi),利用脾血流豐富的特點,通過門靜脈進入肝后即可形成轉(zhuǎn)移灶。Kozlowski利用放射性核素標(biāo)記腫瘤細(xì)胞并追蹤癌細(xì)胞的分布，結(jié)果顯示注射后30 min內(nèi)有77%的癌細(xì)胞寄居于肝，且注射后24 h仍有27%的癌細(xì)胞保留在肝，說明通過脾注射能使大部分癌細(xì)胞進入肝，從而保證肝成瘤率。

脾注射肝轉(zhuǎn)移模型分為保脾法和切脾法。不同點在于切脾法避免脾種植部位成瘤，能較好的模擬結(jié)腸癌腫瘤轉(zhuǎn)移的生物學(xué)行為，成瘤率高，避免了對實驗結(jié)果和小鼠生存期的影響[8]。保脾法建模保留了脾，保存了小鼠固有的抗腫瘤免疫功能。血液中的癌細(xì)胞必須逃逸機體免疫細(xì)胞及活化的細(xì)胞因子的殺傷后才能存活下來，故能轉(zhuǎn)移至肝的癌細(xì)胞是經(jīng)過機體篩選的具有高轉(zhuǎn)移傾向的惡性腫瘤細(xì)胞，所以保脾法更能反映瘤細(xì)胞的惡性程度，更符合臨床轉(zhuǎn)移癌的特性[9]。國內(nèi)有學(xué)者比較了保脾法和切脾法兩種方法造模，實驗結(jié)果表明切脾法比保脾法成瘤率更高[10-11]。值得注意的是，近期Wang等人[12]采用保脾法應(yīng)用SW620-luc細(xì)胞系成功建立了結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移，并指出銀杏葉提取物可進一步促進成瘤率。然而，Wang等人實驗并未進行切脾法與保脾法的比較。在本實驗中，切脾組(B組)造模成功率僅為40%，A組、C組采用保脾法造模，成功率均為100%，肝表面及切面肉眼均可見瘤結(jié)節(jié)。本實驗結(jié)果與宋大遷等實驗結(jié)果想反，分析其原因可能是實際操作時脾注射完成后通常需要按壓止血3～5 min，但按壓脾很容易造成脾注射點再次出血，癌細(xì)胞易隨著血液從注射點流出，導(dǎo)致進入血液中的癌細(xì)胞數(shù)量減少，使造模成功率降低。本實驗中，對比生存期及成瘤情況，A組肝轉(zhuǎn)移瘤右葉多于左葉，平均(4.6±0.4)個/只，生存時間平均為(26.6±3.4)d；B組肝轉(zhuǎn)移瘤較分散，平均(8.3±0.6)/只，顯著高于A組(P<0.05)；生存時間平均為(36.8±4.2)d，顯著高于A組(P<0.05)。這與宋大遷等實驗結(jié)果一致，切脾組腫瘤分布更分散，帶瘤生存期更長。保脾法生存期較切脾組短，原因在于小鼠常較早地死于脾內(nèi)腫瘤。但是模型的成功率顯著低于保脾法(P<0.05)。

另外在建立結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移動物模型的過程中，選擇高轉(zhuǎn)移潛能的癌細(xì)胞株也是關(guān)鍵，最常使用的結(jié)腸癌細(xì)胞包括CT26、HCT116、LOVO、HT29等。Goodwin等人[13]也已報道通過盲腸壁接種CT26細(xì)胞系最終成功建立結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移。本實驗選用人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞及鼠CT26結(jié)腸癌細(xì)胞造模[14-16]。對比A組、C組，兩組裸鼠均可以快速成瘤，造模成功率高達100%。C組裸鼠肝轉(zhuǎn)移數(shù)目明顯多于A組裸鼠(P<0.05)，轉(zhuǎn)移瘤體積更大(P<0.05)，肝右葉被巨大轉(zhuǎn)移灶占據(jù)；A組裸鼠肝腫瘤較為分散，體積較小。分析其原因，可能因為CT26結(jié)腸癌細(xì)胞由于其種屬特異性，在小鼠體內(nèi)更容易逃逸免疫細(xì)胞的攻擊而存活下來，造模成功率較高[17-23]。

在實驗過程中，如果操作不當(dāng)容易造成癌細(xì)胞液外溢從而形成腹腔內(nèi)廣泛轉(zhuǎn)移。結(jié)合B組成瘤率低，因此，我們總結(jié)經(jīng)驗如下：①手術(shù)切口取左側(cè)腋后線肋緣下縱行切口，創(chuàng)傷小，易顯露，不易損傷脾；②注射時禁穿破脾，應(yīng)從脾下級沿脾長軸水平進針，深度保持在0.5 cm左右為宜；③保證注射的細(xì)胞數(shù)量足夠，達到2.5×107/mL，因為進入血液中的癌細(xì)胞必須逃逸機體免疫細(xì)胞及活化的細(xì)胞因子的殺傷后才能存活下來，從而在肝形成轉(zhuǎn)移灶。④注射時間應(yīng)在3～5 min，不易過快，避免脾被膜張力過大而破裂；⑤注射完畢后續(xù)待脾顏色轉(zhuǎn)紅后再拔針，并迅速按壓針眼，避免因脾壓力過大造成瘤細(xì)胞外溢。

綜上所述,本實驗通過比較不同種屬的結(jié)腸癌細(xì)胞造模和不同種類小鼠造模的成功率及優(yōu)缺點，以及比較脾注射保脾法和切脾法的成功率及優(yōu)缺點，發(fā)現(xiàn)使用裸鼠、采用保脾法能獲得較高的造模成功率，能有效模擬人類結(jié)腸癌細(xì)胞經(jīng)血行轉(zhuǎn)移至肝的途徑和過程。