萬(wàn)古霉素緩釋微球復(fù)合自體濃縮紅骨髓對(duì)治療 兔橈骨骨缺損的臨床研究

甘維 朱柔霖 劉雪萍 張立巖 劉斌

[摘要] 目的 探討萬(wàn)古霉素緩釋微球復(fù)合自體濃縮紅骨髓對(duì)治療兔橈骨骨缺損的臨床研究。 方法 選取2017年1～6月我院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)的48只新西蘭大白兔，雌雄皆可，體重2.5～3 kg，分別飼養(yǎng)，隨機(jī)分為三組，每組16只。A組采用自體濃縮紅骨髓治療方式，B組采用自體濃縮紅骨髓與纖維蛋白膠的治療方式，C組采用萬(wàn)古霉素緩釋微球復(fù)合自體濃縮紅骨髓的治療方式。比較三組的血清CRP水平、紅細(xì)胞沉降率以及三組兔術(shù)后不同時(shí)間段X線的評(píng)分。 結(jié)果 術(shù)后3 d、7 d，B組兔血清的CRP水平與A組比較顯著較低，而C組的CRP水平與B組比較顯著降低（P<0.05）;術(shù)后1 d、3 d及4周A組的ESR與B、C組比較顯著較高;術(shù)后7 d A、B組的ESR與C組比較顯著較高;術(shù)后2周B組的ESR與C組比較顯著較高，而A組又顯著高于B組（P<0.05）;術(shù)后2周、4周以及8周B組及C組的X線評(píng)分顯著高于A組（P<0.05），術(shù)后12周三組X線的評(píng)分比較無(wú)顯著差異（P>0.05）。結(jié)論 在對(duì)兔橈骨骨缺損進(jìn)行治療的過(guò)程中，采用萬(wàn)古霉素緩釋微球復(fù)合自體濃縮紅骨髓的治療方式，有利于改善血清CRP水平以及紅細(xì)胞沉降率，同時(shí)濃縮紅骨髓主要取自自體，安全可靠，具有較好的組織相容性，對(duì)于骨缺損愈合的情況有積極的促進(jìn)作用，因此在臨床治療中具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

[關(guān)鍵詞] 萬(wàn)古霉素緩釋微球;復(fù)合自體濃縮紅骨髓;兔橈骨骨缺損

[中圖分類號(hào)] R687.3? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2019）33-0038-05

[Abstract] Objective To investigate the clinical study of vancomycin sustained-release microspheres combined with autologous concentrated red bone marrow in the treatment of rabbit radius defects. Methods From January 2017 to June 2017， 48 New Zealand white rabbits who were raised in the Animal Experimental Center of our hospital were selected. They were either male or female， raised separately and weighed between 2.5-3 kg. They were randomly divided into three groups， with 16 rabbits in each group. Group A was given autologous concentrated red bone marrow for treatment. Group B was given autologous concentrated red bone marrow combined with fibrin glue for treatment. Group C was given vancomycin sustained-release microspheres combined with autologous concentrated red bone marrow for treatment. The serum CRP levels， erythrocyte sedimentation rate， and the X-ray scores at different time points after surgery were compared between the three groups of rabbits. Results At 3 d and 7 d after surgery， the serum CRP levels in group B were significantly lower than those in group A， and the CRP level in group C was significantly lower than that in group B（P<0.05）; the ESR in group A was significantly higher than that in group B and C at 1 d， 3 d and 4 weeks after surgery; the ESR in group A and group B was significantly higher than that in group C at 7 d after surgery; the ESR in group B was significantly higher than that in group C at 2 weeks after surgery， while that in group A was significantly higher than that in group B（P<0.05）; the X-ray scores in group B and group C were significantly higher than those in group A at 2 weeks， 4 weeks and 8 weeks after surgery（P<0.05）. There were no significant differences in the X-ray scores among the three groups at 12 weeks after surgery（P>0.05）. Conclusion In the treatment of rabbit radius defects， the method of vancomycin sustained-release microspheres combined with autologous concentrated red bone marrow is beneficial to improving serum CRP levels and erythrocyte sedimentation rate. At the same time， the concentrated red bone marrow is mainly taken from the autologous tissues， which is safe and reliable， and has good tissue compatibility. It has a positive effect on promoting the healing of bone defects and therefore has a higher application value in clinical treatment.

[Key words] Vancomycin sustained-release microspheres; Combined autologous concentrated red bone marrow; Rabbit radius defects

在目前的骨科治療中，大段骨缺損情況的治療及修復(fù)仍為醫(yī)學(xué)研究中的重要內(nèi)容[1]。自體的松質(zhì)骨由于其同時(shí)具有骨的生成、誘導(dǎo)以及傳導(dǎo)的能力，因此被認(rèn)為是植骨治療中的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但該項(xiàng)取骨方式的骨量較少，并且不適宜對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育期的兒童進(jìn)行治療;同種異體骨的骨源是目前治療的重大難題，同時(shí)具有一定的免疫排斥的情況，不利于患者的治療[2-3]。骨形態(tài)中蛋白情況的出現(xiàn)能夠誘導(dǎo)并且募集未分化的間充質(zhì)細(xì)胞向軟骨以及骨細(xì)胞的分化，同時(shí)具有正位以及體內(nèi)異位的能力，自體紅骨髓中含有的骨源性的干細(xì)胞也具備成骨的功能，但容易導(dǎo)致體內(nèi)流失情況的出現(xiàn)，因此單獨(dú)將其應(yīng)用于治療的效果并不明顯[4-5]。本次研究主要通過(guò)對(duì)兔橈骨骨缺損情況的實(shí)驗(yàn)，探討萬(wàn)古霉素緩釋微球復(fù)合自體濃縮紅骨髓治療的有效性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1～6月我院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)的48只新西蘭大白兔，雌雄皆可，體重2.5～3 kg，分別飼養(yǎng)，隨機(jī)分為三組，每組16只。均在無(wú)菌的條件下制造所有動(dòng)物骨雙側(cè)橈骨骨缺損的模型，A組采用自體濃縮紅骨髓治療方式，B組采用自體濃縮紅骨髓與纖維蛋白膠的治療方式，C組采用萬(wàn)古霉素緩釋微球復(fù)合自體濃縮紅骨髓的治療方式，三組動(dòng)物治療后均允許且負(fù)重在籠中進(jìn)行自由活動(dòng)，并同時(shí)進(jìn)行肌肉注射40 IU/d的青霉素，連續(xù)注射3 d。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的具體制備方法為：采用10%的水合氯醛按照4 mL/kg的比例對(duì)所選用的新西蘭兔進(jìn)行腹腔麻醉，顯露橈骨近端的備皮，依據(jù)沈霖造模法使其雙側(cè)橈骨的中上段顯露，采用3 mm的斯氏針鉆孔至動(dòng)物的髓腔，將動(dòng)物體內(nèi)少量的骨髓進(jìn)行抽離之后注入濃度為5%的魚(yú)肝油酸鈉5 μL，將2×109 cfu/mL的金黃色葡萄球菌懸液注入動(dòng)物的髓腔內(nèi)5 μL。采用無(wú)菌骨蠟將空洞進(jìn)行密封，最后縫合動(dòng)物的皮膚。1個(gè)月之后利用細(xì)菌培養(yǎng)、X線片以及病理組織的培養(yǎng)等確定動(dòng)物是否有感染的情況出現(xiàn)。

1.2 方法

1.2.1 A組? 采用自體濃縮紅骨髓（RBM）治療方式，RBM具體制備的方法為：采用濃度為3%的戊巴比妥鈉進(jìn)行靜脈麻醉，依照30 mg/kg的速度推進(jìn)，在無(wú)菌條件下取兔的俯臥位，采用16G的骨穿針進(jìn)行髂骨穿刺，抽取1 mL的骨髓，采用1000 r/min的速度進(jìn)行10 min的離心操作，然后抽取0.2 mL的底層濃縮紅骨髓用以對(duì)兔的植入。

1.2.2 B組? 采用自體濃縮紅骨髓與纖維蛋白膠的治療方式，自體濃縮紅骨髓的治療方式與A組相同，纖維蛋白膠工程骨的構(gòu)建方式為：將纖維蛋白膠用抑肽酶按照80 mg/mL進(jìn)行溶解，將自體濃縮紅骨髓加入其中，使用過(guò)程中加入催化劑的溶液，等待約20 s后即呈現(xiàn)為凝膠狀態(tài)。

1.2.3 C組? 采用萬(wàn)古霉素緩釋微球復(fù)合自體濃縮紅骨髓的治療方式，在無(wú)菌的條件下取其一側(cè)約為1 g的髂骨，將骨膜以及軟組織去除，采用球形的磨鉆將其處理成骨泥，然后將其與240 mg的萬(wàn)古霉素緩釋微球進(jìn)行充分的混合備用。

用雙氧水以及生理鹽水進(jìn)行傷口的反復(fù)沖洗后，分別將三組兔采用上述三種的治療方式植入，操作完成后逐層縫合，并將術(shù)后的兔進(jìn)行分籠喂養(yǎng)。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 三組兔血清C-反應(yīng)蛋白（CRP）的水平比較? 分別在動(dòng)物術(shù)前及術(shù)后1 d、3 d、7 d、2周、4周抽取動(dòng)物耳緣處的4 mL靜脈血，取其中的2 mL以蛋白分析儀利用免疫散射比濁法檢測(cè)三組不同時(shí)間段的血清CRP水平。

1.3.2 三組兔的紅細(xì)胞沉降率（ESR）比較? 使用剩余的2 mL利用3.8%的枸櫞酸鈉，在抗凝后將其加入到血沉管中進(jìn)行1 h的垂直豎立，之后觀察紅細(xì)胞下沉的距離即為紅細(xì)胞的沉降率。

1.3.3 髓腔的改建情況、骨移植區(qū)密度的變化以及骨痂生長(zhǎng)的情況? 分別在三組兔手術(shù)后的2、4、8以及12周每組各處死2只進(jìn)行雙前肢X線側(cè)位片檢查，主要觀察內(nèi)容為髓腔的改建情況、骨移植區(qū)密度的變化以及骨痂生長(zhǎng)的情況，X線片的評(píng)分依據(jù)Lane-sandhu的骨移植組織學(xué)進(jìn)行評(píng)估比較。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料用（x±s）表示，三組間不同時(shí)間點(diǎn)血清CRP、ESR、X線片評(píng)分及組織學(xué)評(píng)分比較采用單因素方差分析，若差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則再采用LSD-t法進(jìn)行組間兩兩比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組兔術(shù)前及術(shù)后血清CRP水平比較

術(shù)前三組兔的血清CRP水平無(wú)顯著差異（P>0.05），術(shù)后3 d、7 d，B組兔血清的CRP水平與A組比較顯著較低，而C組的CRP水平與B組比較顯著降低（P<0.05），見(jiàn)表1。

2.2 三組兔術(shù)前及術(shù)后ESR比較

術(shù)前三組兔的ESR水平無(wú)顯著差異（P>0.05），術(shù)后1 d、3 d及4周A組的ESR與B、C組比較顯著較高;術(shù)后7 d A、B組的ESR與C組比較顯著較高;術(shù)后2周B組的ESR與C組比較顯著較高，而A組又顯著高于B組（P<0.05），見(jiàn)表2。

2.3 三組兔術(shù)后不同時(shí)間X線評(píng)分比較

術(shù)后2周、4周以及8周B組及C組的X線評(píng)分顯著高于A組（P<0.05），術(shù)后12周三組X線評(píng)分比較無(wú)顯著差異（P>0.05），見(jiàn)表3。

3討論

隨著科技的進(jìn)步以及組織工程學(xué)的不斷發(fā)展，人們逐漸發(fā)現(xiàn)在對(duì)骨缺損的情況進(jìn)行修復(fù)的過(guò)程中采用復(fù)合生長(zhǎng)因子的人工骨修復(fù)能夠顯著縮短修復(fù)治療的時(shí)間，并且將多種生長(zhǎng)因子進(jìn)行聯(lián)合使用能夠取得較為顯著的修復(fù)效果[6-7]。在傳統(tǒng)的治療中無(wú)論是從動(dòng)物身上提取生長(zhǎng)因子還是基因重組均需要耗費(fèi)較長(zhǎng)的時(shí)間，同時(shí)制作的價(jià)格較為昂貴，外源性的生長(zhǎng)因子在大多數(shù)情況下存在一定的免疫排斥反應(yīng)，導(dǎo)致修復(fù)的效果不佳，不利于患者預(yù)后[8]。而紅骨髓中包含誘導(dǎo)性以及定向性的骨祖細(xì)胞，具備形成成骨細(xì)胞的能力[9]。近年來(lái)國(guó)外學(xué)者通過(guò)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行骨愈合的實(shí)驗(yàn)中表明自體骨髓移植能夠加速骨的愈合，具有成骨的功能。

在對(duì)骨缺損的感染情況進(jìn)行控制的過(guò)程中，應(yīng)用敏感抗生素是該治療的前提，尤其是局部抗生素的應(yīng)用，局部藥物的濃度較高，而全身血液中藥物的濃度相對(duì)較低，所以能夠?qū)Ω腥镜那闆r進(jìn)行有效地控制，同時(shí)避免毒副作用，利于患者治療[10-11]。近年來(lái)受多種因素的影響，導(dǎo)致慢性骨髓炎病菌出現(xiàn)的情況易發(fā)生較大改變，并且大部分的金黃色葡萄球菌對(duì)慶大霉素產(chǎn)生耐藥的情況。而萬(wàn)古霉素是在目前的治療中耐藥菌較少的抗生素的一種，主要應(yīng)用于革蘭陽(yáng)性菌，如鏈球菌、表皮葡萄球菌以及金黃色葡萄球菌等[12]。萬(wàn)古霉素是一種碳水化合物性質(zhì)的抗生素，能夠有效抑制細(xì)菌細(xì)胞壁中的蛋白合成，從而促使細(xì)菌細(xì)胞膜的滲透性發(fā)生實(shí)質(zhì)性的改變，從而對(duì)RNA的生物合成情況進(jìn)行有效抑制，因此不容易與其他類的抗生素產(chǎn)生交叉耐藥的情況，更加不容易導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性情況的出現(xiàn)[13-14]。根據(jù)有關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，萬(wàn)古霉素在兔骨髓的應(yīng)用中并不會(huì)影響基質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化以及增殖的情況，對(duì)骨缺損修復(fù)的情況不會(huì)產(chǎn)生任何影響的同時(shí)能夠發(fā)揮其抗感染的功能[15]。在個(gè)體免疫的活性當(dāng)中，ESR以及血清CRP水平是對(duì)急性感染情況進(jìn)行評(píng)估的重要指標(biāo)，并且感染的情況與CRP水平呈現(xiàn)正相關(guān)性，而ESR則是表示血漿與血紅細(xì)胞分離直至沉降至試管底部的速率[16-17]。在本次研究中經(jīng)過(guò)對(duì)三組兔橈骨骨缺損情況采用不同治療方式的比較顯示：術(shù)后3 d、7 d，B組兔血清的CRP水平與A組比較顯著較低，而C組的CRP水平與B組比較顯著降低（P<0.05）;術(shù)后1 d、3 d及4周A組的ESR與B、C組比較顯著較高;術(shù)后7 d A、B組的ESR與C組比較顯著較高;術(shù)后2周B組的ESR與C組比較顯著較高，而A組又顯著高于B組（P<0.05）。從各組之間ESR以及CRP水平的變化中發(fā)現(xiàn)，抗生素在局部中的應(yīng)用均能在兔骨缺損感染的情況中發(fā)揮積極的功能。ESR隨著骨缺損清創(chuàng)術(shù)材料的植入其表達(dá)的水平增加，但增加的情況不如CRP迅速，在感染的情況得到控制后，ESR與CRP比較恢復(fù)到正常值所需要的時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)[18]。因此，感染情況是否得到有效控制可以通過(guò)CRP水平的檢測(cè)情況顯示，而ESR雖然能夠表達(dá)感染的情況，但不能將其用作敏感指標(biāo)[19-20]。在本次研究中經(jīng)過(guò)對(duì)三組X線片的評(píng)估比較顯示：術(shù)后2周、4周以及8周B組及C組的X線評(píng)分顯著高于A組（P<0.05），術(shù)后12周三組X線的評(píng)分比較無(wú)顯著差異（P>0.05）。在早期感染情況的存在導(dǎo)致A組骨質(zhì)塑形的情況相對(duì)較慢，而B(niǎo)組藥物的半衰期時(shí)間較短，在前期能夠顯著降低由于感染情況而對(duì)成骨造成的損傷，由于后期動(dòng)物的抵抗力情況相對(duì)較強(qiáng)，緩釋藥物的情況與修復(fù)的情況基本相同，因此在術(shù)后12周三組的X線評(píng)分無(wú)顯著的差異。

綜上所述，在對(duì)兔橈骨骨缺損進(jìn)行治療的過(guò)程中，采用萬(wàn)古霉素緩釋微球復(fù)合自體濃縮紅骨髓的治療方式，有利于改善血清CRP水平以及紅細(xì)胞沉降率，同時(shí)濃縮紅骨髓主要取自自體，安全可靠，具有較好的組織相容性，對(duì)于骨缺損愈合的情況有積極的促進(jìn)作用，因此在臨床治療中具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 向柄彥，李鵬，柏帆，等.載萬(wàn)古霉素緩釋微球納米羥基磷灰石/殼聚糖支架聯(lián)合自體紅骨髓可修復(fù)慢性骨髓炎兔的骨缺損[J].中國(guó)組織工程研究，2019，23（6）：29-34.

[2] 王輝，王茜，張輝，等.帶蒂筋膜瓣包裹國(guó)產(chǎn)多孔鉭修復(fù)兔橈骨節(jié)段性骨缺損實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)修復(fù)重建外科雜志，2017，36（10）：53-60.

[3] 張一，田曉濱，佘榮峰，等.膜誘導(dǎo)技術(shù)結(jié)合抗生素硫酸鈣顆粒治療下肢感染性骨缺損[J].中華骨科雜志，2017， 37（9）：513-519.

[4] 邵擎東，汪錚，李宇飛，等.部分間質(zhì)血管-脫細(xì)胞骨基質(zhì)-殼聚糖支架在促進(jìn)兔橈骨骨折愈合中的作用[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2017，34（1）：97-101.

[5] Park CG，Park M，Kim BH，et al. Pattern-coated titanium bone fixation plate for dual delivery of vancomycin and alendronate[J]. Macromolecular Research，2017，25（7）：1-7.

[6] 沈立鋒，劉亦楊，張揚(yáng)，等.組織瓣-載萬(wàn)古霉素硫酸鈣聯(lián)合髂骨一期移植治療脛骨骨髓炎[J].中華顯微外科雜志，2017，40（1）：35-40.

[7] 劉學(xué)光，孫振中，宋升，等.足背動(dòng)脈島狀皮瓣聯(lián)合載萬(wàn)古霉素硫酸鈣治療脛骨遠(yuǎn)端創(chuàng)傷性骨髓炎伴軟組織缺損[J].中國(guó)修復(fù)重建外科雜志，2017，29（5）：123-125.

[8] 榮潔琳，林福星，汪謨貞，等.攜載BMP4基因的核殼結(jié)構(gòu)納米粒子修復(fù)兔橈骨臨界骨缺損的研究[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，47（11）：38-44.

[9] Lamirault G，De Bock E，Sébille Véronique，et al. Sustained quality of life improvement after intracoronary injection of autologous bone marrow cells in the setting of acute myocardial infarction：Results from the BONAMI trial[J]. Quality of Life Research，2017， 26（1）：121-125.

[10] 殷建，王斌，朱超，等.局部注射促血管生成素2調(diào)控自噬促進(jìn)體內(nèi)組織工程人工骨早期血管化和骨缺損修復(fù)的研究[J].中國(guó)修復(fù)重建外科雜志，2018，36（9）：1150-1156.

[11] 陳海濤，安玉光.橈骨骨折模型兔骨折愈合：特異性環(huán)氧化酶2抑制劑與非特異性環(huán)氧化酶抑制劑的比較[J].中國(guó)組織工程研究，2019，23（15）：95-100.

[12] 厲孟，劉銳，高杰，等.Ilizarov技術(shù)修復(fù)創(chuàng)傷后橈骨遠(yuǎn)端畸形并骨缺損[J].中國(guó)修復(fù)重建外科雜志，2018，32（10）：46-51.

[13] Hassani Besheli N，Mottaghitalab F，Eslami M，et al. Sustainable release of vancomycin from silk fibroin nanoparticles for treating severe bone infection in rat tibia osteomyelitis model[J]. ACS Applied Materials & Interfaces，2017，9（6）：5128-5138.

[14] 殷渠東，顧三軍，芮永軍，等.松質(zhì)骨包裹植骨技術(shù)治療長(zhǎng)骨節(jié)段性骨缺損[J]. 中華創(chuàng)傷骨科雜志，2017，19（9）：775-781.

[15] 肖衛(wèi)東，喻愛(ài)喜，潘振宇，等.皮瓣移植聯(lián)合Masquelet技術(shù)治療骨及軟組織缺損[J].中華顯微外科雜志，2018， 41（1）：9-13.

[16] 封帆，王燕鳳，呂圣飛，等.吻合血管腓骨肌皮瓣移植修復(fù)橈骨長(zhǎng)段缺損12例[J].中華顯微外科雜志，2017，40（3）：290-292.

[17] 趙星，余黎，陶圣祥，等.3D打印技術(shù)在嚴(yán)重肱骨遠(yuǎn)端骨缺損治療中的應(yīng)用觀察[J].中國(guó)修復(fù)重建外科雜志，2018，32（12）：45-50.

[18] Argenziano M，Banche G，Luganini A，et al. Vancomycin-loaded nanobubbles：A new platform for controlled antibiotic delivery against methicillin-resistant，Staphylococcus aureus， infections[J]. International Journal of Pharmaceutics，2017，523（1）：176-188.

[19] 梁立碩，賈婉萍，方俊，等.不同濃度摻鎂透鈣磷石骨水泥修復(fù)骨質(zhì)疏松家兔骨缺損及BMP-2表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究[J].科學(xué)技術(shù)與工程，2018，18（8）：187-190.

[20] Dixit M，Singh KB，Prakash R，et al. Functional block of IL-17 cytokine promotes bone healing by augmenting FOXO1 and ATF4 activity in cortical bone defect model[J].Osteoporosis International，2017，28（7）：2207-2220.

（收稿日期：2019-07-03）