色譜實(shí)驗(yàn)室中高效液相色譜柱的管理

趙 明， 王安冬， 祝永衛(wèi)， 郭梅芳， 楊金福

(北京工業(yè)大學(xué) 國(guó)有資產(chǎn)與實(shí)驗(yàn)室管理處，北京 100124)

高效液相色譜技術(shù)是一種高效能分離分析手段，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于藥物[1]、食品[2]、環(huán)境[3]、材料[4]等方面的分析檢測(cè)。在高效液相色譜分離系統(tǒng)中，擔(dān)負(fù)著分離作用的色譜柱是整個(gè)色譜系統(tǒng)的核心，色譜柱的類型和效能決定了被分析物的類型和分離分析效果的好壞[5]。色譜柱的正確使用和維護(hù)管理十分重要，使用和維護(hù)不當(dāng)將導(dǎo)致色譜柱柱效降低，進(jìn)而縮短使用壽命甚至損壞。為使色譜柱能夠充分有效地發(fā)揮其分離作用，同時(shí)形成科學(xué)有序的管理方法，提高實(shí)驗(yàn)室管理水平，本文從色譜柱的儲(chǔ)存管理、使用管理以及維護(hù)管理三個(gè)角度出發(fā)，對(duì)色譜實(shí)驗(yàn)室中色譜柱的管理進(jìn)行探討和歸納。

1 色譜柱儲(chǔ)存管理

1.1 色譜柱信息庫(kù)的建立

對(duì)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)所有的色譜柱應(yīng)按詳細(xì)類型統(tǒng)一管理。建立色譜柱檔案信息庫(kù)[6-7]，信息庫(kù)中需要收錄的色譜柱信息應(yīng)包括購(gòu)置日期、購(gòu)置途徑、色譜柱品牌、型號(hào)、單價(jià)、填料、粒徑、尺寸、耐受酸堿度范圍、耐受溫度范圍、耐受壓力范圍、適用對(duì)象、保存方法以及注意事項(xiàng)等，并同時(shí)保存色譜柱包裝內(nèi)的說(shuō)明書。

此外，建立每根色譜柱的使用檔案。嚴(yán)格記錄色譜柱的使用情況，需要記錄的內(nèi)容包括使用日期、使用者、流動(dòng)相和樣品信息、運(yùn)行壓力、運(yùn)行時(shí)間以及是否出現(xiàn)特殊問(wèn)題等，并將代表性色譜圖保留。要求色譜柱使用者如實(shí)并及時(shí)登記使用情況，以便追溯并可掌握色譜柱狀態(tài)，便于管理。

新購(gòu)色譜柱與報(bào)廢色譜柱都應(yīng)及時(shí)做好記錄備案。

1.2 色譜柱儲(chǔ)存條件

每次使用色譜柱后需按照說(shuō)明書的要求沖洗色譜柱，尤其是使用含有酸或鹽成分的流動(dòng)相時(shí)更需充分沖洗，最后將色譜柱保存在相應(yīng)的溶液中(如一般C18色譜柱可保存至乙腈中)。卸下色譜柱后將兩端用堵頭擰好，放置色譜柱包裝盒中，以免柱填料干裂或被污染。

設(shè)置色譜柱專用櫥柜或儲(chǔ)存在專用冰箱4 ℃冷藏室，按色譜柱類別分組放置，將色譜柱包裝盒中標(biāo)注信息的一端朝外。輕拿輕放，避免碰撞震動(dòng)，保持儲(chǔ)存環(huán)境避光、干燥，保持低溫或室溫。

2 色譜柱使用管理

2.1 正確選擇色譜柱

選擇合適的色譜柱是實(shí)現(xiàn)物質(zhì)分離分析的前提。目前常用的色譜柱可根據(jù)色譜分離機(jī)制分為以下幾種類型[8-9]，如表1所示。開展色譜實(shí)驗(yàn)時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?shí)驗(yàn)對(duì)象等正確、合理地選擇色譜柱，一方面能夠提高實(shí)驗(yàn)效率，取得正確可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，另一方面合理使用色譜柱也是對(duì)其功能的保護(hù)。

表1常見(jiàn)色譜柱分類

色譜柱類型分離原理適用對(duì)象填料反相色譜柱用鍵合非極性基團(tuán)的載體填充而成的色譜柱,根據(jù)物質(zhì)極性差異進(jìn)行分離。固定相的極性小于流動(dòng)相的極性。適用于大多數(shù)化合物,如蛋白質(zhì)、肽、氨基酸、核酸、甾體、脂類、脂肪酸、糖類、生物堿等含有非極性基團(tuán)的化合物。十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)、辛烷基硅烷鍵合硅膠(C8)、苯基鍵合硅膠等。正相色譜柱用硅膠或鍵合極性基團(tuán)的硅膠填充而成的色譜柱,根據(jù)物質(zhì)極性差異進(jìn)行分離。固定相的極性大于流動(dòng)相的極性。(也可使用含水流動(dòng)相,即HILIC)適用于非極性至中等極性的中小分子化合物的分離,如脂溶性維生素、甾體激素等。硅膠、氨基鍵合硅膠、氰基鍵合硅膠等。離子交換色譜柱以離子交換樹脂或化學(xué)鍵合離子交換劑為固定相,利用被分離組分離子交換能力的差別或選擇系數(shù)的差別而實(shí)現(xiàn)分離。適用于離子或可離解的化合物,如無(wú)機(jī)離子、有機(jī)酸、核苷酸、氨基酸、抗生素、蛋白質(zhì)等。有機(jī)共聚物樹脂、硅膠微球離子交換劑、螯合樹脂等。分子排阻色譜柱根據(jù)凝膠孔隙的孔徑大小與高分子樣品分子的線團(tuán)尺寸間的相對(duì)關(guān)系,對(duì)溶質(zhì)進(jìn)行分離。大分子的物質(zhì)保留弱。用于分析多肽、蛋白質(zhì)、核酸、多糖、聚乙烯、聚氯乙烯等。葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、高交聯(lián)度苯乙烯-二乙烯基苯共聚物。手性拆分色譜柱由具有光學(xué)活性的單體,固定在硅膠或其他聚合物上制成手性固定相,通過(guò)引入手性環(huán)境使對(duì)映異構(gòu)體間呈現(xiàn)物理特征的差異,從而實(shí)現(xiàn)光學(xué)異構(gòu)體的拆分。光學(xué)異構(gòu)體纖維素、環(huán)糊精、大環(huán)抗生素、蛋白質(zhì)等。

2.2 規(guī)范實(shí)驗(yàn)耗材和試劑的使用

為避免色譜柱污染和堵塞，要求流動(dòng)相均為色譜級(jí)別，并使用0.45 μm或更小孔徑的濾膜濾過(guò)，尤其當(dāng)流動(dòng)相中含有緩沖鹽時(shí)，過(guò)濾尤為重要。配制好的流動(dòng)相使用前需超聲排除液體內(nèi)氣體。

過(guò)濾時(shí)需注意區(qū)分微孔濾膜的水油系，水相需使用水系濾膜，有機(jī)相需使用油系濾膜，二者不可混用，以防止濾膜溶解而造成的污染，影響檢測(cè)結(jié)果。

盛放流動(dòng)相的容器和液相色譜儀器中的在線過(guò)濾器應(yīng)定期清洗或更換，以避免容器污染和過(guò)濾器超載。

2.3 規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作

在使用高效液相色譜儀進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格按規(guī)范操作，以使得色譜柱充分發(fā)揮分離作用。實(shí)驗(yàn)操作者，尤其是儀器管理人員，應(yīng)養(yǎng)成正確的操作習(xí)慣。

安裝色譜柱時(shí)注意系統(tǒng)流路的方向，色譜柱方向(柱身有箭頭標(biāo)注)應(yīng)與系統(tǒng)流向保持一致。色譜柱一般情況下不可反沖。

實(shí)驗(yàn)前應(yīng)選用適宜的流動(dòng)相，注意流動(dòng)相的pH范圍應(yīng)在說(shuō)明書中標(biāo)注的該色譜柱能夠耐受的pH范圍內(nèi)，以免色譜柱中的固定相被破壞。

實(shí)驗(yàn)時(shí)避免過(guò)高的柱壓，雖然高效液相色譜柱能夠耐受的壓力一般可達(dá)6 000 psi，但過(guò)高的壓力或較大的壓力變化會(huì)縮短色譜柱的使用壽命。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，若出現(xiàn)柱壓過(guò)高，則應(yīng)該盡可能采取小流速，保持柱壓不超過(guò)最大允許的壓力的一半[10]。注意實(shí)驗(yàn)溫度，一般色譜柱最高使用溫度應(yīng)不超過(guò)60 ℃，溫度過(guò)高容易破壞柱內(nèi)填料，降低柱效。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后要及時(shí)用合適的溶劑充分沖洗系統(tǒng)，一般使用20～30倍柱體積。最后根據(jù)說(shuō)明書用相應(yīng)的溶劑保存色譜柱。

2.4 加裝保護(hù)柱

保護(hù)柱也叫做預(yù)柱，其作用是在流動(dòng)相和樣品進(jìn)入色譜柱之前過(guò)濾掉其中的某些雜質(zhì)和不溶物。盡管現(xiàn)在的高校液相色譜儀在流動(dòng)相吸入濾頭和進(jìn)樣閥后部都裝有一定孔徑的過(guò)濾器，但這種過(guò)濾器只能除去不溶性顆粒而無(wú)法除去化學(xué)污染物，因此在分析成分復(fù)雜的混合物或需要大量進(jìn)樣時(shí)，加裝保護(hù)柱是必不可少的措施。選擇保護(hù)柱時(shí)，保護(hù)柱的填料應(yīng)與分析柱保持一致。

3 色譜柱維護(hù)管理

3.1 定期測(cè)定色譜柱柱效

隨著色譜柱使用時(shí)長(zhǎng)增加和分離樣品數(shù)量的增多，其柱效(即色譜柱分離能力)可能有所降低，為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性并及時(shí)掌握色譜柱狀態(tài)，應(yīng)定期對(duì)色譜柱的柱效進(jìn)行考查和評(píng)價(jià)。新購(gòu)置色譜柱的說(shuō)明書中附有該色譜柱的柱效和柱效測(cè)定方法，一般采用尿嘧啶、鄰苯二甲酸二甲酯、硝基苯、萘等物質(zhì)作配置混合標(biāo)準(zhǔn)品，考查經(jīng)色譜柱分離的分離度，計(jì)算理論塔板數(shù)，得到柱效值[11]。每次測(cè)定柱效后應(yīng)詳細(xì)記錄本次柱效測(cè)定的時(shí)間、所用標(biāo)準(zhǔn)品、結(jié)果(理論塔板數(shù)、分離度、對(duì)稱因子等)、色譜圖、測(cè)定者等信息。定期測(cè)定柱效方便掌握色譜柱的狀態(tài)和使用情況，評(píng)價(jià)色譜柱的性能變化。理論塔板數(shù)是反映色譜柱的關(guān)鍵參數(shù)，一般當(dāng)理論塔板數(shù)下降50%時(shí)可認(rèn)定該色譜柱已無(wú)法滿足正常的分離需要，應(yīng)及時(shí)對(duì)其進(jìn)行再生處理。

3.2 色譜柱的故障處理

(1) 緩沖鹽堵塞色譜柱。如果流動(dòng)相中含有緩沖鹽，在色譜柱中遇到高濃度有機(jī)試劑易導(dǎo)致鹽析出，形成結(jié)晶，導(dǎo)致色譜柱堵塞，柱壓升高。此時(shí)可用10%甲醇/水沖洗色譜柱，使色譜柱內(nèi)的鹽全部溶解，再逐步換到高濃度甲醇繼續(xù)沖洗。

(2) 色譜柱進(jìn)氣泡。儀器運(yùn)行時(shí)流動(dòng)相跑空、流動(dòng)相用前未超聲排盡氣泡以及儀器用前未排盡管路內(nèi)氣泡等情況均可導(dǎo)致色譜柱進(jìn)入氣泡。色譜柱進(jìn)入氣泡的表現(xiàn)是柱壓不穩(wěn)。此時(shí)可先排空管路中氣泡之后，使用大比例有機(jī)相以小流速如0.2 mL/min長(zhǎng)時(shí)間沖洗，直至柱壓穩(wěn)定，色譜柱排氣泡時(shí)建議后續(xù)不連接檢測(cè)器，以免將氣泡沖進(jìn)檢測(cè)器。

(3) 色譜柱被污染。 柱頭篩板污染堵塞，此時(shí)色譜圖可表現(xiàn)為拖尾(不對(duì)稱)，柱壓升高，在這種情況下應(yīng)反向連接柱子，使用小流速高濃度有機(jī)相沖洗柱子(以C18柱為例)；或?qū)⒅^螺絲擰下，取出柱頭過(guò)濾篩板，將其置于30%所有稀硝酸內(nèi)超聲清洗10 min，再用純水超聲清洗10 min左右，重新裝入色譜柱即可。色譜柱內(nèi)污染，由樣品的沉積引起的污染的C18柱，可用能溶解污染物的流動(dòng)相反向沖柱，沖洗量一般為20～30倍柱體積。

(4) 色譜柱再生。當(dāng)色譜柱柱效較低無(wú)法正常使用時(shí)，可嘗試色譜柱再生。下面介紹幾種常用色譜柱的再生方法[12]。

反相柱的再生：可用90%甲醇、純甲醇和二氯甲烷等有機(jī)溶劑順次沖洗色譜柱，再用相反順序沖洗一遍。每次沖洗量為20～30倍柱體積。

正相柱的再生：可用正己烷、異丙醇、正己烷、甲醇作為流動(dòng)相順次沖洗色譜柱，再用相反順序沖洗一遍。每次沖洗量為20～30倍柱體積。注意溶劑需要完全脫水。

離子交換柱的再生：陽(yáng)離子柱可使用稀酸緩沖液沖洗，陰離子柱可使用稀堿緩沖溶液沖洗。

以上方法并非絕對(duì)，可根據(jù)色譜柱的實(shí)際使用情況，選擇能夠較好溶解柱內(nèi)污染物的溶劑進(jìn)行沖洗，但需要注意的是，再生色譜柱不可能完全恢復(fù)色譜柱柱效。色譜柱再生后需做好記錄，方便管理。

3.3 色譜柱的報(bào)廢

如果色譜柱柱效太低且無(wú)法維修和再生，應(yīng)由管理員標(biāo)記，做好停用記錄，報(bào)廢處理，不可隨意丟棄。

4 結(jié)語(yǔ)

色譜柱的有效管理能夠提高利用率，充分發(fā)揮其使用價(jià)值并可延長(zhǎng)使用壽命，同時(shí)也能在實(shí)驗(yàn)室中形成有序的實(shí)驗(yàn)氛圍，促使實(shí)驗(yàn)人員養(yǎng)成科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)素養(yǎng)，提高實(shí)驗(yàn)室管理水平。本文按照邏輯順序以色譜實(shí)驗(yàn)室中色譜柱的儲(chǔ)存管理、使用管理、維護(hù)管理三個(gè)方面討論歸納了色譜柱管理方法和具體措施，以期能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)色譜柱的高效全面管理。