薇甘菊頸盲蝽谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶PmGSTd1基因克隆及表達分析

張傳光 ，澤桑梓，朱家穎，季梅，劉凌，張乃明

1. 云南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，云南 昆明 650201；2. 云南省林業(yè)有害生物防治檢疫局，云南 昆明 650051；3. 云南省林業(yè)科學院，云南 昆明 650204；4. 西南林業(yè)大學，云南 昆明 650224

薇甘菊（Mikania micrantha）被認為世界上最具侵略性的雜草之一（Ming et al.，2017），也是唯一一種全國林業(yè)檢疫有害植物（徐小偉等，2014）。澤桑梓等（2013）首次報道了云南瑞麗1種專食薇甘菊的昆蟲，后被鑒定為盲蝽科（Miridae）新種——薇甘菊頸盲蝽[Pachypeltis micranthus Mu et Liu(Hemiptera: Miridae)]（Yiran et al.，2017），是控制云南省瑞麗市薇甘菊極為重要的一種本土天敵昆蟲（澤桑梓等，2017）。

薇甘菊頸盲蝽專食薇甘菊的生物學特性是昆蟲與寄主植物在進化過程中相互協(xié)同選擇的結(jié)果（Will et al.，2006；Walling，2008）。如入侵中國云南的薇甘菊揮發(fā)油內(nèi)普遍存在 β-cadinene、allo-aromadendrene、β-caryophyllene 及 5-(1, 1-dimethylethyl)-2, 3-1H-Inden-1-one等多碳化合物（季梅等，2012；孫盟等，2013），而生長在原產(chǎn)地秘魯?shù)霓备示諜z測不到這些物質(zhì)（Ni et al.，2007），此外，薇甘菊合成的化學防御素——縮合單寧也顯著高于本地物種（倪廣艷等，2014）。由此說明，為適應新的生境環(huán)境，薇甘菊次生代謝物的質(zhì)和量都發(fā)生了改變。研究發(fā)現(xiàn)，被薇甘菊頸盲蝽取食后薇甘菊葉片中的防御性酶——過氧化物酶（POD）和苯丙氨酸酶（PAL）的活性下降，多酚氧化酶（PPO）活性提高（季梅等，2014；李勝等，2018），說明在被頸盲蝽取食后薇甘菊很快作出了防御反應。植物防御性次生物質(zhì)對昆蟲產(chǎn)生不利影響，甚至可以對昆蟲產(chǎn)生毒殺作用，而昆蟲則通過對植物次生物質(zhì)的忌避取食、解毒代謝等多種機制，對寄主植物產(chǎn)生適應性（陳澄宇等，2015）。昆蟲胞質(zhì)谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferases，GSTs）是一個多功能的超家族酶類（Jakobsson et al.，2010），在代謝內(nèi)源和外源性有毒物質(zhì)中起著重要作用（Vontas et al.，2001；Enayati et al.，2010；Yu et al.，2018）。

有關昆蟲 GST的研究主要集中在對農(nóng)藥的抗性和代謝解毒機制方面，對食物源有毒物質(zhì)代謝機制方面的研究報道相對較少（李亞紅，2014）。本研究旨在克隆薇甘菊頸盲蝽GST基因，研究其在不同部位的表達差異，為進一步解析微甘菊頸盲蝽與宿主植物相互作用機理奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

薇甘菊頸盲蝽采自云南省瑞麗市，瑞麗屬南亞熱帶季風性氣候，全年分旱雨兩季，基本無霜，年平均氣溫21 ℃，年降水量1394.8 mm，年平均日照2330 h。

采樣點位于瑞麗市姐勒水庫沿岸，將徒手捕捉的薇甘菊頸盲蝽成蟲置于網(wǎng)袋中，隨后挑選活力充沛的雌、雄個體各100頭，分別用手術刀切分為觸角、殘體、翅膀、足4部分，將所有觸角、翅膀、足各制成1個混合樣品，任意挑選10個殘體作為1個樣品，共得到8個樣品，然后將樣品迅速保存至液氮中，帶回實驗室。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及GST基因的克隆

參照Trizol試劑說明書，對樣品進行研磨，提取總 RNA，采用紫外分光光度計對提取到的總RNA進行質(zhì)量檢測，并儲存于-80 ℃冰箱中備用。

以提取的總RNA為模板，用SMART? RACE cDNA amplification kit（Clontech）反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈。根據(jù)實驗室前期對薇甘菊頸盲蝽cDNA文庫測序獲得的GST片段序列，設計5′RACE和 3′RACE 特異性引物（5′-TCCAACGGAGTT AAACGAC-3′和 5′-CCATCTTGATTGGCAGTTTT G-3′），以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，參照RACE試劑盒說明書，PCR擴增該基因的3′端和5′端序列。PCR反應條件為：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。用1%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行檢測。利用凝膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進行回收純化，TA克隆接入 pGEM?-T-easy載體（Promega），藍白斑篩選，挑取陽性克隆送至昆明碩擎生物科技有限公司進行測序（Zhu et al.，2014）。

1.2.2 序列分析

用 ORFfinder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）將 GST的核苷酸序列翻譯成氨基酸序列；用 ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）對蛋白進行基本進化性質(zhì)分析；SignalP 4.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）對信號肽進行預測；用ClustalX 1.83進行多序列比對分析進化樹（Thompson et al.，2002），MEGA 7.0 軟件構(gòu)建NJ（neighbor-joining）分子系統(tǒng)進化樹（Kumar et al.，2016）。

1.2.3 熒光定量PCR

用Trizol試劑提取各樣品總RNA，將各樣品總RNA定量至1 μg，利用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板。根據(jù)實驗前期克隆獲得的GST cDNA序列，設計特異性引 物 （ 5′-AACCAATGATTATGGGGGGA-3′和5′-ACTCAACGCCTCAAGTGTCG-3′），對該基因在薇甘菊頸盲蝽不同性別、不同部位中的表達量進行熒光定量 PCR分析。以 18S RNA為內(nèi)參基因（ 5′-TTTCAAATGTCTGCCTTATC-3′和 5′-TGTGG TAGCCGTTTCTC A-3′），每個樣品重復3次。PCR反應條件為：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性10 s，55 ℃退火20 s，39個循環(huán)。熒光定量PCR結(jié)果采用2-ΔΔCT法進行計算，根據(jù)該方法把表達量最低的樣品表達量值定義為1（Livak et al.，2001）。

運用 Excel對數(shù)據(jù)進行整理，IBM SPSS Statistics進行方差分析和S-N-K多重比較，Origin Pro 2016進行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 PmGSTd1的生物信息學分析

2.1.1 PmGSTd1編碼氨基酸的理化性質(zhì)

PmGSTd1 cDNA全長為977 bp，ORF為720 bp，5′端非編碼區(qū) 166 bp，3′端非編碼區(qū) 78 bp（圖 1）。該基因編碼 240個氨基酸，N端 1-18號氨基酸（MKHSLALLAIAFLQTAIA）為信號肽（圖1雙劃線部分），可以推測其為 1個分泌蛋白；另外，3′端存在一個可能的AATAAA加尾信號（圖1下劃線部分）。PmGSTd1編碼氨基酸的理化性質(zhì)如表 1所示，PmGSTd1編碼240個氨基酸，分子質(zhì)量為27.28 kD；該蛋白呈弱疏水性，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；等電點為8.41，說明此蛋白在pH=8.41的溶液中最不穩(wěn)定，溶解度最小。

2.1.2 PmGSTd1序列及保守進化分析

不同物種的GST基因序列均有高度的同源性，Blast結(jié)果表明，PmGSTd1與其他昆蟲 delta家族GST之間相似度均大于 40%，與溫帶臭蟲 Cimex lectularius、砂白蟻Cryptotermes secundus、德國小蠊Blattella germanica、金鳳蝶Papilio machaon的GST同源性分別為56%、51%、51%、46%（圖2），且均具有保守的谷胱甘肽結(jié)合位點（G-site）（圖1）。

圖1 PmGSTd1 cDNA序列及推測的氨基酸序列Fig. 1 The cDNA and deduced protein sequence of PmGSTd1

表1 PmGSTd1理化性質(zhì)Table1 Physical and chemical properties of PmGSTd1

系統(tǒng)進化樹顯示，薇甘菊頸盲與溫帶臭蟲Cimex lectularius（Cimicidae：Hemiptera）GST 基因的同源性處于同一分支上，進化關系最近（圖3），說明這2個delta GST可能起源于同一個祖先基因。

2.2 熒光定量PCR分析

GST基因在薇甘菊頸盲蝽不同部位皆有表達，總體而言，其在雄蟲各部位的表達量均顯著高于雌蟲（殘體除外），雄蟲翅膀、觸角、足部、殘體中的表達分別是雌蟲相應部位的4.49倍、2.11倍、1.68倍、1.33倍。雌蟲和雄蟲GST在各部位的相對表均以足部表達量為最高，且顯著高于翅膀、觸角及殘體中的表達量（圖4）。

就雌蟲而言，GST在翅膀中的表達量顯著低于其他部位，而觸角和殘體中的表達量基本相當，分別是翅膀表達量的1.99倍和2.20倍。就雄蟲而言，GST在殘體中的表達水平顯著低于其他部位，觸角與翅膀中的表達水平基本相當，分別是殘體中表達量的1.43倍和1.53倍。

圖2 薇甘菊頸盲蝽PmGSTd1與其他昆蟲GST多序列比對Fig. 2 Multiple alignment of PmGSTd1 from Pachypeltis micranthus and other insects保守性極高和保守性較高的殘基位點分別用黑色陰影和灰色陰影表示Residues identical or similar are highlighted in black and grey respectively. Cim：溫帶臭蟲 Cimex lectularius，XP_014249034.1；Cry，砂白蟻Cryptotermes secundus，XP 023712416.1；Bla：德國小蠊 Blattella germanica，AEV23880.1；Pap，金鳳蝶 Papilio machaon，XP 014359621.1；Pac：薇甘菊頸盲蝽 Pachypeltis micranthus

圖3 PmGSTd1基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of PmGSTd1Pap，金鳳蝶 Papilio machaon，XP 014359621.1；Pol，玉帶鳳蝶 Papilio polytes，XP 013142316.1；Myz，桃蚜 Myzus persicae，XP 022166553.1；Mel，高粱蚜 Melanaphis sacchari，XP 025204059.1；Cim，溫帶臭蟲 Cimex lectularius，XP 014260234.1；Cry，砂白蟻 Cryptotermes secundus，XP 023712416.1；Api，意大利蜜蜂 Apis mellifera，XP 006563394.1；Tri，赤擬谷盜 Tribolium castaneum，XP 015834775.1；Pac，薇甘菊頸盲蝽 Pachypeltis micranthus。物種拉丁名后為該序列GenBank登錄號。GenBank accession number is followed by species name

圖4 PmGSTd1基因在不同部位中的表達量Fig. 4 Relative expression level of PmGSTd1 at different partsFA，雌蟲觸角；FB，雌蟲殘體；FL，雌蟲足；FW，雌蟲翅膀；MA，雄蟲觸角；MB，雄蟲殘體；ML，雄蟲足；MW，雄蟲翅膀。不同字母表示在5%水平上差異顯著FA, antenna of female; FB, residual body of female; FL, leg of female; FW, wing of female; MA, antenna of male; MB, residual body of male; ML, leg of male; MW, wing of male. Different letters mean significant differences at 5% level

3 討論

谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶是一類二聚體多基因家族的多功能蛋白，依據(jù)GSTs調(diào)節(jié)大部分特異性底物所具有的不同催化活性，將 GSTs分為 Delta、Epsilon、Sigma、Omega、Theta、Zeta 家族和未知家族，其中 Delta和 Epsilon家族僅存在于昆蟲中（Ding et al.，2003；Lumjuan et al.，2007；余泉友等，2010；尤燕春等，2013）。將PmGSTd1推導出來的氨基酸序列與NCBI已公布的其他昆蟲GST序列進行比對，然后采用 MEGE7.0軟件中的鄰接法進行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，結(jié)果表明，此次克隆到的PmGSTd1基因與其他昆蟲的GST Delta家族基因的同源性都大于40%，且PmGSTd1谷胱甘肽結(jié)合位點（G-site）處的6個氨基酸殘基（Ser 32，His 73，Thr 74，Val 75，Glu 87，Ser88）的位置非常保守（圖2），所以此次從薇甘菊頸盲蝽體內(nèi)克隆到的PmGSTd1基因?qū)儆贒elta家族（何超等，2017；苗婭等，2018）。另外，PmGSTd1 N端有一個明顯的信號肽結(jié)構(gòu)（圖 1雙劃線部分），可以推測其為 1個分泌蛋白。

昆蟲為避免受到內(nèi)源或外源有毒物質(zhì)的侵害，在長期進化過程中形成了一套代謝此類物質(zhì)的解毒酶系統(tǒng)，GSTs家族便是該酶系統(tǒng)的重要組成之一。其功能主要包括：（1）解毒異源有毒物質(zhì)；（2）保護細胞免受氧化損傷；（3）對內(nèi)源代謝物和外源化合物進行細胞間運輸（Low et al.，2010；Yang et al.，2016）。在新的生境中，薇甘菊防御性次生代謝物的質(zhì)和量都發(fā)生了改變，對于以薇甘菊為唯一食物來源的薇甘菊頸盲蝽而言，Delta家族在面對環(huán)境的選擇壓力中起著重要的作用（Ranson et al.，2002），可讓昆蟲更好地適應寄主植物的次生代謝物質(zhì)。從圖 4可知，PmGSTd1在雄、雌蟲殘體中都有表達，可以推測代謝食物源毒素是 PmGSTd1的功能之一，且雄蟲表達量高于雌蟲，可能與雄蟲取食量更大有關（澤桑梓等，2017）。

昆蟲通過觸角識別環(huán)境中的氣味分子，在長期進化過程中，昆蟲形成了高度靈敏的嗅覺系統(tǒng)以適應環(huán)境和生存（Vogt et al.，2015；Brito et al.，2016），PmGSTd1在雌雄蟲的觸角中都有較高的表達量，且雄蟲觸角中的表達量是雌蟲的2.11倍（圖4），可能是GSTs參與了氣味分子降解（Vogt，2005），以避免或減輕潛在有害化合物對感覺神經(jīng)元造成傷害。此外，GSTs還可以作為結(jié)構(gòu)蛋白分布于昆蟲間接飛翔?。≧anson et al.，2005），而PmGSTd1在雄蟲翅膀中的表達顯著大于雌蟲，這可能是因為雄蟲的飛翔能力明顯強于雌蟲（澤桑梓等，2017）。

4 結(jié)論

（1）薇甘菊頸盲蝽PmGSTd1是屬于GST delta家族的一個分泌蛋白，與溫帶臭蟲（Cimex lectularius）GST的親緣關系最近。

（2）PmGSTd1在雌、雄蟲的各部位均有表達，且均表現(xiàn)為足部的表達量明顯高于其他部位；雄蟲各部位的表達量（殘體除外）均顯著高于雌蟲，雄蟲翅膀、觸角、足部、殘體中的表達分別是雌蟲相應部位的4.49倍、2.11倍、1.68倍、1.33倍。

（3）PmGSTd1基因功能可能包括代謝食物源毒素、降解氣味分子及飛翔肌的結(jié)構(gòu)蛋白。