2，2′，4，4′，5-五溴聯(lián)苯醚(BDE-99)對巴夫藻和塔瑪亞歷山大藻的致毒脅迫效應(yīng)

王洪斌， 成 群， 熊文超， 胡業(yè)慶， 謝冰倩， 李士虎

(1.淮海工學(xué)院海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇連云港 222005； 2.江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇連云港 222005)

2，2′，4，4′，5-五溴聯(lián)苯醚(BDE-99)是一種多溴聯(lián)苯醚(PBDEs)，也是一種溴代阻燃劑。PBDEs擁有極為優(yōu)異的阻燃性能、熱穩(wěn)定性等，因此被廣泛用作電子電路、建筑家具、塑料制品、紡織等行業(yè)中。但是，這些產(chǎn)品在使用、焚燒和降解等過程中，不與PBDEs共價(jià)結(jié)合，這時(shí)PBDEs就會(huì)揮發(fā)到自然環(huán)境中[1-2]，之后經(jīng)過大自然的各類循環(huán)進(jìn)入海洋，并最終在沉積物和生物體體內(nèi)積累[3]。大量研究和實(shí)證表明，PBDEs的化學(xué)結(jié)構(gòu)與多氯聯(lián)苯(PCBs)極為相似，具有難降解、高脂溶性等特點(diǎn)，是一種新型的持久性有機(jī)污染物。2004年，歐洲部分國家已禁止八溴聯(lián)苯醚等PBDEs的投放使用。2006年，歐盟頒布明令禁止歐盟各國在電子商品中使用多溴聯(lián)苯醚[4]。

我國為發(fā)展中國家，每年使用多溴聯(lián)苯醚用作阻燃劑等也十分多。隨著PBDEs用量的增加，在大氣、沉積物或污泥、魚類、人體血液和脂肪組織、母乳等中均能檢測到其存在，而在水、沉積物和生物體中含量最高的是以BDE-47、BDE-99、BDE-100為主的低溴聯(lián)苯醚。

藻類作為海洋和陸地上的初級(jí)生產(chǎn)者，其價(jià)值在近幾十年來被越來越多的研究人員和學(xué)者看重。關(guān)于藻類的研究更是不勝其數(shù)，其中微藻的生態(tài)價(jià)值已經(jīng)滲透到工業(yè)、農(nóng)業(yè)等各方面。BDE-99一旦進(jìn)入水體，開始“入侵”的對象就是浮游藻類。在“侵入”后便在食物鏈中傳播，進(jìn)入水體和人體，從而危害生物體健康。

本研究選用常見的巴夫藻(Pavlocaviridis)和塔瑪亞歷山大藻(Alexandriumtamarense)為供試材料，以它們的生長量等為檢測參數(shù)，分析塔瑪亞歷山大藻和巴夫藻對不同濃度梯度BDE-99的致毒脅迫的響應(yīng)，從而研究BDE-99對海洋微藻的毒性效應(yīng)，以期證明多環(huán)芳烴化合物會(huì)對水環(huán)境帶來嚴(yán)重的破壞性，揭示海洋微藻在水環(huán)境污染治理及修復(fù)中的潛在應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

巴夫藻和塔瑪亞歷山大藻藻種均由淮海工學(xué)院海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院藻類實(shí)驗(yàn)室保存；本試驗(yàn)中所用海水均取于江蘇省連云港市連島海域漲潮時(shí)，海水鹽度為31.00‰～32.00‰，經(jīng)醋酸纖維素薄膜過濾后，于121 ℃高壓滅菌 20 min 后備用；BDE-99購自上海源葉生物有限公司(純度為98%)；二甲基甲酰胺(DMF)購自生工生物工程(上海)股份有限公司；酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、過氧化氫酶(CAT)和丙二醛(MDA)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；微藻培養(yǎng)采用通用的f/2營養(yǎng)液(自配)；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 微藻培養(yǎng)及微藻細(xì)胞破碎 在250 mL錐形瓶中加入150 mL f/2營養(yǎng)液和10 mL藻種，混合均勻，置于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行封閉式培養(yǎng)，光照度為3 000 lx，培養(yǎng)溫度為(22±1) ℃，光—暗周期為12 h—12 h。培養(yǎng)過程中每天定時(shí)搖動(dòng)3次，搖瓶過程中隨機(jī)調(diào)換位置，以免光照不均勻。

量取20 mL待測藻液，于5 000 r/min離心10 min，棄上清，將沉淀物加入10 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH值為 7.8)中，采用超聲波破碎藻細(xì)胞(破碎條件：功率為195 W，超聲波工作時(shí)間為3 s，間歇時(shí)間為7 s，超聲波破碎強(qiáng)度為65%，總工作時(shí)間為10 min)，鏡檢無完整細(xì)胞后，于 5 000 r/min 離心10 min，取上清液用于檢測ACP、AKP、CAT活性及MDA含量。

1.2.2 DMF對微藻生長量的影響 BDE-99溶液用DMF配制，BDE-99母液濃度為5 μg/mL，使用時(shí)根據(jù)需要稀釋；在研究BDE-99對海洋微藻的影響時(shí)，可能會(huì)受到DMF的干擾。在藻類生長至對數(shù)生長期時(shí)，分別在巴夫藻、塔瑪亞歷山大藻試驗(yàn)組中加入0、50、100、200、400、800 μL DMF溶液；用吸光度法(檢測波長為680 nm)檢測其生長量，24 h測定1次，直至120 h，試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行。

1.2.3 BDE-99對微藻生長量的影響 在微藻對數(shù)期添加不同濃度梯度的BDE-99，根據(jù)文獻(xiàn)[5]，分別在巴夫藻和塔瑪亞歷山大藻試驗(yàn)組中加入0、50、100、200、400、800 μL BDE-99的DMF溶液，對應(yīng)濃度分別為0、1.67、3.34、6.68、13.36、26.72 μg/L；用吸光度法(檢測波長為680 nm)檢測其生長量，24 h測定1次，直至120 h，試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行。

1.2.4 ACP、AKP、CAT活性和MDA含量的測定 在微藻對數(shù)期分別添加0、6.68 μg/L濃度的BDE-99，對其ACP、AKP、CAT活性和MDA含量進(jìn)行測定，時(shí)間間隔為24 h，直至120 h，試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行。ACP、AKP、CAT活性和MDA含量的測定按照試劑盒的說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 DMF對2種海洋微藻生長量的影響

由圖1可以看出，2種海洋微藻的生長量均呈現(xiàn)快速增長的趨勢，DMF各添加量試驗(yàn)組與對照組的生長量幾乎相等，增長趨勢一致，可見DMF添加量增加對巴夫藻及塔瑪亞歷山大藻的生長沒有抑制作用，DMF作為BDE-99溶劑對本研究結(jié)果無明顯影響。

2.2 BDE-99對2種海洋微藻生長量的影響

如圖2所示，隨著處理時(shí)間增加，1.67 μg/L BDE-99試驗(yàn)組的巴夫藻生長得最好，說明低濃度的BDE-99對巴夫藻有一定的刺激生長作用，120 h 時(shí) 26.72 μg/L BDE-99試驗(yàn)組的巴夫藻生長受到最大抑制，抑制率為73%，與對照組相比，經(jīng)t檢驗(yàn)分析，差異極顯著(P<0.01)。除1.67 μg/L BDE-99試驗(yàn)組外，BDE-99對巴夫藻的抑制作用具有明顯的劑量效應(yīng)。隨著BDE-99濃度的增加，對塔瑪亞歷山大藻生長的抑制強(qiáng)度增大。與巴夫藻不同的是，除了1.67 μg/L BDE-99試驗(yàn)組外，其他各個(gè)濃度試驗(yàn)組對塔瑪亞歷山大藻生長的抑制作用均很強(qiáng)，3.34、6.68、13.36、26.72 μg/L BDE-99 試驗(yàn)組對塔瑪亞歷山大藻生長抑制率分別為64%、78%、74%、74%，與對照組相比，經(jīng)t檢驗(yàn)分析，差異極顯著(P<0.01)。

2.3 BDE-99對2種海洋微藻CAT活性的影響

按照第1.2.4節(jié)的方法，添加6.68 μg/L濃度的BDE-99處理2種微藻，0～120 h后的CAT活性變化見圖3?？梢钥闯?，在同一時(shí)間條件下，BDE-99對2種微藻CAT活性的影響有差異，巴夫藻CAT活性在處理24 h后開始升高，96 h達(dá)到最高值，與對照組相比，增加了47%，經(jīng)t檢驗(yàn)分析，差異顯著(P<0.05)，120 h后幾乎恢復(fù)至對照組水平；對于塔瑪亞歷山大藻，在同一時(shí)間條件下，自用BDE-99處理后24 h起，CAT活性即有增加，增加趨勢同巴夫藻，96 h達(dá)最高值，與對照組相比，增加31%，經(jīng)t檢驗(yàn)分析，差異顯著(P<0.05)，120 h恢復(fù)至對照組水平，略低于對照組。

2.4 BDE-99對2種海洋微藻AKP活性的影響

按照第1.2.4節(jié)的方法，用BDE-99處理2種微藻，0～120 h后AKP的活性變化見圖4。 可以看出， 隨著BDE-99暴露時(shí)間的增加，巴夫藻、塔瑪亞歷山大藻的AKP活性先逐漸升高，巴夫藻的AKP活性于BDE-99處理72 h后達(dá)最高值，與對照組相比，升高43%，經(jīng)t檢驗(yàn)分析，差異顯著(P<0.05)，以后逐漸降低，處理120 h后恢復(fù)至對照組水平；塔瑪亞歷山大藻的AKP活性變化趨勢同巴夫藻，AKP活性在處理后48 h達(dá)到最大值，與對照組相比，升高40%，經(jīng)t檢驗(yàn)分析，差異顯著(P<0.05)，處理48 h以后逐漸降低，處理后120 h恢復(fù)至對照組水平。

2.5 BDE-99對2種海洋微藻ACP活性的影響

用BDE-99處理2種微藻0～120 h的ACP活性變化見圖5?？梢钥闯觯S著BDE-99暴露時(shí)間的增加，2種微藻的ACP活性變化趨勢不明顯，巴夫藻、塔瑪亞歷山大藻的ACP活性均于BDE-99處理72 h達(dá)到最高值，與對照組相比，升高15%，經(jīng)t檢驗(yàn)分析，差異不顯著，以后逐漸降低，120 h后恢復(fù)至對照組水平。

2.6 BDE-99對2種海洋微藻MDA含量的影響

用BDE-99處理2種微藻0～120 h的MDA含量變化見圖6?？梢钥闯觯S著培養(yǎng)時(shí)間的增加，2種微藻的MDA含量整體上逐漸升高，特別是塔瑪亞歷山大藻的升高趨勢非常明顯，巴夫藻則在120 h達(dá)最高值，與對照組相比，提高56%，經(jīng)t檢驗(yàn)分析，差異極顯著(P<0.01)；塔瑪亞歷山大藻同樣在BDE-99處理后120 h達(dá)最高值，與對照組相比，提高95%，經(jīng)t檢驗(yàn)分析，差異極顯著(P<0.01)。

3 討論

胡恒等進(jìn)行了BDE-99等5種PBDEs對亞心型扁藻和鹽生杜氏藻的毒性試驗(yàn)，結(jié)果顯示：對照組的2種微藻生長較好，當(dāng)加入不同濃度的BDE-99后，2種微藻的生長均受到不同程度的抑制，高濃度的BDE-99等抑制鹽生杜氏藻生長的作用特別明顯[6]。BDE-99等對鹽生杜氏藻的生長呈現(xiàn)特殊的“興奮作用”[7-8]。在本研究中，BDE-99對2種海洋微藻的致毒脅迫也呈現(xiàn)出類似結(jié)果，低濃度(1.67 μg/L)的BDE-99對2種微藻均有刺激生長作用，高濃度的BDE-99有強(qiáng)烈的抑制作用并具有明顯的劑量效應(yīng)，26.72 μg/L BDE-99 的試驗(yàn)組對巴夫藻、塔瑪亞歷山大藻生長的抑制率分別為73%、74%。2種微藻對BDE-99處理表現(xiàn)出相似的時(shí)間-劑量效應(yīng)：隨著BDE-99濃度的增大，抑制作用顯著增強(qiáng)。綠色巴夫藻表現(xiàn)為隨著處理濃度的增大，出現(xiàn)緩慢生長的趨勢，波動(dòng)性較大，抑制作用較低。由此可見，BDE-99對各種海洋微藻的致毒脅迫效應(yīng)存在種屬差異。

本研究設(shè)計(jì)添加固定濃度(6.68 μg/L)BDE-99處理2種微藻，隨著培養(yǎng)時(shí)間的遞增，2種微藻的ACP活性變化趨勢不明顯，巴夫藻和塔瑪亞歷山大藻的ACP的活性均于處理后72 h達(dá)到最高值，與對照組相比，分別提高18%、15%。隨著BDE-99暴露時(shí)間的增加，巴夫藻、塔瑪亞歷山大藻的AKP活性逐漸升高，巴夫藻于BDE-99處理后72 h達(dá)到最高值，與對照組相比提高了43%，塔瑪亞歷山大藻的AKP活性變化趨勢同巴夫藻，AKP活性在BDE-99處理后48 h達(dá)到最大值，與對照組相比，提高了40%。在同一時(shí)間條件下，BDE-99對2種微藻CAT活性的影響有差異，處理后96 h巴夫藻、塔瑪亞歷山大藻的CAT活性分別增加47%、31%；2種微藻體內(nèi)的CAT活性增加與BDE99的暴露時(shí)間呈正相關(guān)趨勢，CAT活性在高位持續(xù)至處理后96 h，ACP、AKP、CAT活性的變化反而說明2種海洋微藻對BDE-99的致毒脅迫產(chǎn)生應(yīng)激響應(yīng)，在短時(shí)間內(nèi)刺激ACP、AKP和CAT活性升高，特別是CAT活性的劇烈變化程度明顯，結(jié)果與生長量的變化一致。

張智華等指出，小新月菱形藻的CAT活性和MDA含量在蒽菲芘作用下會(huì)有不同程度的升高，細(xì)胞損傷加劇[9]。任加云等指出，進(jìn)入生物體中的污染物在分解代謝過程中能夠形成多種中間產(chǎn)物，并產(chǎn)生大量活性氧物質(zhì)，造成生物體的氧化損傷，一些抗氧化防御系統(tǒng)能夠轉(zhuǎn)化超氧陰離子自由基，從而使得機(jī)體免受損傷[10-11]。在本研究中，用BDE-99脅迫2種微藻，結(jié)果顯示，2種微藻MDA含量隨著BDE-99暴露時(shí)間的增加而升高，特別是塔瑪亞歷山大藻的升高趨勢非常明顯，巴夫藻在處理后120 h達(dá)到最高值，與對照組相比，提高了56%，經(jīng)t檢驗(yàn)分析，差異極顯著(P<0.01)；塔瑪亞歷山大藻同樣在處理后120 h達(dá)到最高值，與對照組相比，提高了95%，經(jīng)t檢驗(yàn)分析，差異極顯著(P<0.01)。本研究結(jié)果顯示，塔瑪亞歷山大藻對BDE-99的響應(yīng)較巴夫藻強(qiáng)烈，與上述生長量變化結(jié)果一致。本研究設(shè)定時(shí)間為120 h，由于BDE-99對巴夫藻和塔瑪亞歷山大藻致毒效應(yīng)較強(qiáng)，120 h后由于藻體本身的活性減弱，死亡率加劇而導(dǎo)致MDA含量仍然維持在高位。王麗平等也指出，熒蒽脅迫對藻細(xì)胞的膜脂質(zhì)過氧化作用有明顯增強(qiáng)的跡象，藻細(xì)胞的MDA含量對熒蒽毒性較為敏感，是個(gè)潛在的有價(jià)值的參考指標(biāo)[5]。

本研究從浮游藻類的視角，通過研究綠色巴夫藻和塔瑪亞歷山大藻的生長、部分抗氧化酶活性及MDA含量對 BDE-99 的致毒脅迫的響應(yīng)，旨在揭示多環(huán)芳烴化合物對水環(huán)境污染的重要性，并研究了海洋微藻在水環(huán)境污染治理及修復(fù)中的潛在應(yīng)用價(jià)值。