1株鄰苯二甲酸二丁酯降解內(nèi)生菌的分離鑒定及降解特性

柴陽陽， 程江峰， 余向陽

(1.青島科技大學(xué)海洋科學(xué)與生物工程學(xué)院，山東青島 266042； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所，江蘇南京 210014)

鄰苯二甲酸酯(phthalate ester，PAEs)又稱酞酸酯，被普遍應(yīng)用于保鮮膜、膠水、藥品、服裝、化妝品等產(chǎn)品的生產(chǎn)中[1-2]。由于大多數(shù)PAEs以范德華力或氫鍵的方式結(jié)合到塑料制品中，所以在塑料制品的生產(chǎn)使用過程中很容易釋放到環(huán)境中，目前在大氣、土壤、河流、食品、生物中都有檢出，已經(jīng)成為一種嚴(yán)重的污染物[3-4]。鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)作為塑化劑中一種重要的增塑劑，對(duì)人體以及其他生物具有致畸、致癌、致突變的作用，引起了我國、美國和歐盟的重視，被列為優(yōu)先控制的污染物[5]。

近幾年來，由于DBP的普遍使用，環(huán)境中到處都能檢測到DBP的殘留，給人類健康生活帶來了隱患[6]。環(huán)境中DBP的水解、光解速度特別慢，而一些微生物可以代謝DBP，半衰期僅為1～3 d，因此，微生物降解被認(rèn)為是治理DBP污染的主要途徑[7]。Xu等報(bào)道了1株假單胞菌B-1在10 mg/L DBP濃度條件下4 d能降解96%的DBP[8]。Li等在2006年發(fā)現(xiàn)1株紅球菌，對(duì)100 mg/L DBP降解率達(dá)55%[9]。金雷等分離到的H-2在3 d內(nèi)對(duì)100 mg/L DBP的降解率達(dá)87.6%[10]。當(dāng)前，國內(nèi)外已有大量DBP降解菌的報(bào)道，如節(jié)桿菌(Arthrobactersp.)、假單胞菌(Pseudomonassp.)、抗輻射菌(Deinococcussp.)、紅球菌(Rhodococcussp.)、分枝桿菌(Mycobacteriumsp.)、大頭茶菌(Gordoniasp.)、農(nóng)桿菌(Agrobacteriumsp.)等[11-17]，目前，所發(fā)現(xiàn)的DBP降解菌主要集中在體外降解，而對(duì)植物內(nèi)生菌的報(bào)道尚未發(fā)現(xiàn)。

筆者從污染土壤的植株中分離獲得1株植物內(nèi)生菌HBT4，采用生理生化試驗(yàn)以及16S rDNA分析鑒定菌種，測定其對(duì)DBP的降解特性及影響因素，旨在為進(jìn)一步研究內(nèi)生菌對(duì)植株中DBP的降解及增強(qiáng)植株的抗逆性和治理環(huán)境污染提供借鑒和材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植株 酸模(RumexacetosaL.)采自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院內(nèi)被塑化劑污染的試驗(yàn)田中。

1.1.2 主要試劑 鄰苯二甲酸二丁酯(上海麥克林生化科技有限公司，含量>98.5%)；分析純乙酸乙酯(成都市科龍化工試劑廠)；色譜純乙腈(德國Darmstadt)；細(xì)菌DNA提取試劑盒(美國OMEGA公司)；16S rDNA序列擴(kuò)增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；2×TaqPCR Master Mix由DBI Bioscience公司提供。

1.1.3 培養(yǎng)基 無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基(1 L)：0.4 g MgSO4·7H2O，0.2 g FeSO4·7H2O，0.2 g K2HPO4，0.2 g(NH4)2SO4，0.08 g CaSO4，用去離子水定容至1 000 mL，pH值為7.0～7.2。

LB液體培養(yǎng)基(1 L)：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g。固體培養(yǎng)基分別在上述液體培養(yǎng)基中加瓊脂15～20 g/L，pH值為7.0。

1.1.4 儀器設(shè)備 MX-F型漩渦混合器及D1008型離心機(jī)(SCILOGEX公司)，Life Pro基因擴(kuò)增儀(杭州博日科技有限公司)，DYY-6C型電泳儀(北京市六一儀器廠)，STARTER 2100型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)(奧豪斯儀器有限公司)，a-1506型紫外分光光度計(jì)(上海奧析科學(xué)儀器有限公司)，Agilent Technologies 1200高效液相色譜儀(美國安捷倫科技公司)。

1.2 DBP降解菌的篩選與純化

分別將植株的根、莖、葉用自來水沖洗干凈，自然風(fēng)干后進(jìn)行表面消毒，先用75%乙醇浸泡2～3 min，再用1%NaClO漂洗2～5 min，然后用無菌水清洗3次，收集最后1次無菌水的沖洗液，吸取100 μL涂布至空白LB平板中，放置在 30 ℃ 條件下倒置培養(yǎng)3 d，檢查表面消毒是否徹底。將表面消毒的植物樣品于滅菌研缽內(nèi)研磨，將汁液濃度分別稀釋至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，分別吸取100 μL汁液均勻涂布于LB平板上，并將所得菌株進(jìn)行分離純化。然后分別將菌株接種于一定濃度DBP無機(jī)鹽培養(yǎng)液中，37 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)，定時(shí)測定DBP的殘留濃度，選取降解率高的細(xì)菌保存待用。

1.3 分離菌株的鑒定

1.3.1 生理生化測定 菌株形態(tài)以及生理生化特性測定參照東秀珠等的《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[18]。

1.3.2 細(xì)菌16S rDNA的測序與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 菌株基因組的鑒定采用16S rDNA序列分析的方法，首先用試劑盒法提取細(xì)菌的基因組DNA作為模板，利用16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，正向引物為27F(5′-AGAGTTTGATCMTG GCTCAG-3′)，反向引物為1492R(5′-GGTTACCTTGTTACG ACTT-3′)。PCR反應(yīng)體系為2×TaqPCR Mix 10 μL，引物27F與1 492R各0.5 μL，DNA模板4 μL，雙蒸水5 μL。

PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性1 min，56 ℃ 退火1 min，72 ℃延伸2 min，30次循環(huán)；72 ℃延伸 10 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物的純化和測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，引物為27F與1492R，測序方式為雙向測序。將測序結(jié)果同GenBank數(shù)據(jù)庫中的基因序列進(jìn)行BLAST比對(duì)以獲得相似性較高的相關(guān)菌株，用MEGA 6.06軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 生長曲線測定

挑取斜面菌種接種于100 mL富集培養(yǎng)液中，37 ℃、150 r/min 振蕩培養(yǎng)，定時(shí)采樣測D600 nm。

1.5 菌株的降解特性研究

1.5.1 菌株對(duì)DBP的降解及生長規(guī)律 將分離純化后的菌株接種于富集培養(yǎng)基中，在37 ℃、150 r/min下避光培養(yǎng) 24 h，將菌株的菌液離心分離獲取菌體，再用0.85%無菌生理鹽水沖洗3次，調(diào)整菌液D600 nm為1.0。然后將 1 mL 上述菌液接種到50 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基(DBP含量為10 mg/L)中，測定初始D600 nm和DBP含量，于37 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)，并設(shè)置1組不加入菌液的無機(jī)鹽培養(yǎng)基作為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。分不同時(shí)間取樣測定D600 nm及DBP殘留量。

1.5.2 DBP高效降解菌的降解條件優(yōu)化

1.5.2.1 溫度 將菌株的菌液離心分離獲取菌體，再用無菌生理鹽水沖洗3次，調(diào)整菌液D600 nm為1.0。吸取1 mL分別接種到50 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基(DBP含量為10 mg/L)中，在溫度分別為25、30、35、40 ℃的搖床于150 r/min培養(yǎng)3 d，以不加菌作為對(duì)照，用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)測定DBP的含量，同時(shí)用紫外分光光度計(jì)測定D600 nm。所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值，數(shù)據(jù)采用Excel 2013軟件進(jìn)行分析處理。

1.5.2.2 pH值 用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl調(diào)節(jié)無機(jī)鹽培養(yǎng)基的pH值分別為4、5、6、7、8、9，滅菌后添加DBP至其質(zhì)量濃度為10 mg/L，按2%接菌量接入D600 nm=1.0的菌懸液，于37 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)3 d，取樣測定培養(yǎng)液中DBP的殘留量和D600 nm。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.5.2.3 接菌量 于無機(jī)鹽培養(yǎng)基中分別按0.5%、2%、5%、10%的接菌量接入菌懸液。添加DBP至其質(zhì)量濃度為10 mg/L，調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH值為7.0～7.2，于37 ℃、150 r/min 下避光培養(yǎng)，分別于接菌初始和0.5、1、2、3 d取樣測定培養(yǎng)液中DBP殘留量。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.5.2.4 DBP初始濃度 將無機(jī)鹽培養(yǎng)基中DBP的初始質(zhì)量濃度分別設(shè)為2、5、10、20、50 mg/L，按2%的接菌量接入D600 nm=1.0的菌懸液，于37 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)5 d，取樣測定培養(yǎng)液中DBP的殘留量和D600 nm。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.6 DBP的提取分析方法

采用高效液相色譜法向待測溶液中加入等量的乙酸乙酯，于180 r/min搖床振蕩萃取30 min，靜置分層后，吸取 2 mL 上清液于10 mL玻璃離心管中，氮?dú)獯蹈珊笥蒙V純乙腈定容至4 mL(稀釋2倍)，過0.22 μm有機(jī)相濾膜后上機(jī)測定。

HPLC條件：色譜柱為ZORBA×SB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相V乙腈∶V水=90 ∶10；流速為 1.0 mL/min；檢測波長為225 nm；柱溫為室溫；進(jìn)樣量為 20 μL；在上述條件下DBP的保留時(shí)間為4.9～5.0 min。

在上述條件下，溶液中DBP的回收率在92.3%～94.7%。

2 結(jié)果與分析

2.1 DBP降解菌的分離篩選

經(jīng)過分離篩選得到1株DBP降解菌，該菌株能夠以DBP為唯一碳源生長良好，命名為HBT4。該菌株呈半透明、桿狀，中間有凸起，表面褶皺不規(guī)則，質(zhì)地黏稠、邊緣整齊；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，菌落呈現(xiàn)白色、表面干燥、扁平、邊緣整齊。

2.2 菌種鑒定

利用16S rDNA通用引物，以菌株HBT4 DNA為模板PCR擴(kuò)增，測序得到長度為1 440 bp的16S rDNA基因片段，在NCBI(美國國立生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站)上經(jīng)BLAST同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該菌株HBT4(NCBI登錄號(hào)為MF351990)基因序列與芽孢桿菌屬相似度達(dá)99%，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示，菌株HBT4與Bacillussiamensisstrain PD-A10親緣關(guān)系最近。結(jié)合生理生化試驗(yàn)結(jié)果(表1)初步鑒定菌株HBT4為暹羅芽孢桿菌(Bacillussiamensis)。

2.3 生長曲線測定

如圖2所示，菌株HBT4在LB液體培養(yǎng)基中滯留4 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，對(duì)數(shù)生長期持續(xù)約6 h，隨后生長速度有所減緩，到20 h時(shí)菌株HBT4達(dá)到生長高峰，進(jìn)入穩(wěn)定期。生長曲線符合微生物生長規(guī)律。

2.4 菌株HBT4對(duì)DBP的降解特性及生長狀況

由圖3可知，以2%的接菌量接入HBT4，在10 mg/L DBP為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，菌株HBT4以DBP為唯一碳源和能源生長繁殖，在培養(yǎng)2 d時(shí)達(dá)到生長高峰，其對(duì)DBP的降解率達(dá)到65.15%，至培養(yǎng)4 d時(shí)，DBP的殘留量為 0.76 mg/L，降解率達(dá)到91.9%，而在未接菌的處理中，DBP降解率僅為 5.7%。在2～4 d期間，隨著大量DBP被降解利用，菌株逐漸進(jìn)入衰退期，菌株數(shù)量減少，主要原因可能是由于DBP的減少以及菌株自身代謝廢物的累積導(dǎo)致菌株的生存環(huán)境惡化，抑制了菌株的生長繁殖。

表1 菌株HBT4的生理生化特性

注：“+”表示結(jié)果呈陽性；“-”表示結(jié)果呈陰性。

2.5 HBT4對(duì)DBP的降解條件優(yōu)化

2.5.1 溫度的影響 由圖4可知，菌株HBT4對(duì)DBP的降解效果隨著溫度的升高而升高，到達(dá)最高值以后隨著溫度升高而降低，最適生長溫度為35 ℃，降解率達(dá)到87.23%，溫度過高過低都會(huì)影響菌株的生長及降解活性。這與張穎等關(guān)于溫度對(duì)菌株降解DBP的影響中的結(jié)果[19]是一致的，最適溫度是35 ℃，過高過低都抑制了菌株的生長和降解效率。

2.5.2 pH值的影響 由圖5可知，在pH值為4.0～9.0時(shí)，菌株HBT4的生長量先隨pH值的升高而升高，在到達(dá)最適pH值后，菌株生長量隨pH值的繼續(xù)升高而降低。適合菌株培養(yǎng)的pH值為6.0～8.0，其中pH值為7.0時(shí)，DBP降解效果最明顯，降解率達(dá)78.32%。當(dāng)pH值為4.0時(shí)，菌株幾乎不能生長，DBP的降解率不足10%。pH值過高或過低都會(huì)影響菌株的生長，同時(shí)也會(huì)抑制酶活性，影響DBP的降解。

2.5.3 接菌量的影響 由圖6可知，在DBP濃度均為 10 mg/L 的培養(yǎng)基中，隨著初始接菌量的增加，DBP的降解速率明顯提高。在接菌量為0.05%時(shí)，菌株HBT4的滯留期延長，DBP的降解速度緩慢，在培養(yǎng)3 d時(shí)降解率也只有16.9%，接菌量在2%、5%、10%時(shí)，培養(yǎng)3 d的降解率分別為81.8%、92.7%、96.2%。由此表明，隨著接菌量的增加，DBP降解速率逐漸增加，并且隨著底物濃度的不斷降低，降解速率變緩。

2.5.4 DBP初始濃度的影響 由圖7可知，隨著初始底物濃度的增加，生長曲線和降解曲線都呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。

底物濃度為2、5 mg/L時(shí)，由于濃度較低，導(dǎo)致菌株不能大量生長繁殖，從而影響了DBP的降解率，降解率分別為 67.01%、73.19%；底物濃度為10 mg/L時(shí)，降解率達(dá)到最大值，為89.33%；當(dāng)?shù)孜餄舛却笥?0 mg/L時(shí)，由于底物初始濃度較大，對(duì)應(yīng)的降解率隨著底物濃度增加而降低；當(dāng)?shù)孜餄舛葹?0 mg/L時(shí)，菌株仍可以生長，但生長受到抑制，降解率最低，為30.9%。

3 結(jié)論與討論

本研究從污染土壤的酸模植株中分離到1株降解DBP的內(nèi)生菌HBT4，經(jīng)生理生化指標(biāo)及16S rDNA同源性比對(duì)，初步鑒定該菌株為暹羅芽孢桿菌(Bacillussiamensis)。菌株HBT4的生長和降解DBP的最適條件為溫度35 ℃，pH值 7.0，底物濃度10 mg/L，同時(shí)加大接菌量能明顯提高降解效率。已有相關(guān)報(bào)道表明，Bacillussiamensis能分泌表面活性劑至發(fā)酵液，具有生防菌的作用[20]。本研究首次報(bào)道了植物內(nèi)生菌Bacillussiamensis具有DBP的降解功能，進(jìn)一步豐富了該菌株在環(huán)境污染治理方面的用途。

相對(duì)于已報(bào)道的DBP降解菌[8-10]，本研究分離的內(nèi)生菌HBT4對(duì)高濃度DBP的降解效率偏低，這可能與該菌株所在植株中DBP濃度較低、環(huán)境對(duì)菌株的脅迫壓力較小有關(guān)。但植物內(nèi)生菌與宿主植株之間存在復(fù)雜的關(guān)系。一些植物內(nèi)生菌具有抑制和殺滅許多病原微生物、促進(jìn)植株生長、增強(qiáng)宿主植物抗逆境、抗病蟲害等作用[21-22]，而在重金屬污染嚴(yán)重的土壤中植物內(nèi)生菌能夠提高植物對(duì)重金屬的吸附量，具有促進(jìn)植物修復(fù)的作用[23-24]。如今，利用植物內(nèi)生菌治理環(huán)境污染已成為研究熱點(diǎn)，Lodewyckx等利用植物內(nèi)生菌可以加速根際污染物質(zhì)的降解，使植物可以自我修復(fù)[25]；Chen等利用內(nèi)生菌提高了水生植物對(duì)污染水源的修復(fù)效率[26]。HBT4是一株性能良好的DBP降解菌，在消除食品塑料垃圾的PAEs殘留污染方面具有獨(dú)特的應(yīng)用潛力。同時(shí)關(guān)于植物內(nèi)生細(xì)菌HBT4在植物體內(nèi)的定殖以及其在植物體內(nèi)代謝塑化劑及適應(yīng)塑化劑污染中的作用還需進(jìn)一步研究。