中型指環(huán)蟲的體外培養(yǎng)方法的建立

鄭瑞珠， 羅楊志， 張生元，， 喻運珍，， 張立強， 艾桃山，

(1.武漢中博水產(chǎn)生物技術(shù)有限公司，湖北武漢 430070； 2.武漢市農(nóng)業(yè)科學技術(shù)研究院水產(chǎn)科學研究所，湖北武漢 430207)

指環(huán)蟲是一類引發(fā)魚類寄生蟲疾病的重要病原[1]，指環(huán)蟲種類繁多，主要寄生于魚鰓部，對魚的致病力有較大的種屬差異性[2]。中型指環(huán)蟲(Dactylogyrusintermedius)是寄生于鯽(Carassiusauratus)、鯉(Cyprinuscarpio)鰓部一種較常見的指環(huán)蟲，國內(nèi)外均有報道，該蟲的寄生不僅會破壞鰓的完整性[3]、刺激黏液分泌亢進、引起鰓絲黏連及壞死，導致魚類呼吸加速[4-6]，還能和其他種屬的寄生蟲共同侵染同一宿主的魚并引起致病細菌和真菌的繼發(fā)性感染，造成魚類“爛腮病”臨床癥狀，引起養(yǎng)殖魚類大量死亡[2]。

指環(huán)蟲的驅(qū)蟲藥主要有甲苯咪唑、吡喹酮、阿維菌素、辛硫磷等，由于這些藥物長期大規(guī)模地使用，導致指環(huán)蟲產(chǎn)生了不同程度的抗藥性，新藥研制已迫在眉睫。而目前，指環(huán)蟲驅(qū)蟲藥物的篩選主要通過觀察魚鰓上指環(huán)蟲數(shù)量的方法[7-12]，但因指環(huán)蟲的感染、發(fā)育受環(huán)境影響較大[13]，且指環(huán)蟲必須寄生在魚鰓或幼魚鰭條上[2]，離體無法長期存活，這些因素極大地限制了該方法的實用性，因此合適的指環(huán)蟲體外培養(yǎng)模型對指環(huán)蟲的研究及其防治技術(shù)研究具有重要的應用價值和意義。目前，還沒有指環(huán)蟲體外培養(yǎng)的研究報道，本試驗將以金魚(Carassiusauratus)鰓部的中型指環(huán)蟲為研究對象，從培養(yǎng)液、抗生素及寄生載體3方面摸索中型指環(huán)蟲體外培養(yǎng)條件，研究其在體外培養(yǎng)的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗魚 本試驗金魚均購自于湖北省武漢市武昌區(qū)八一路花鳥市場，養(yǎng)在武漢市農(nóng)科院水產(chǎn)所山南魚池，試驗前均養(yǎng)在盛有24 h曝氣的自來水中。

1.1.2 細胞 本試驗所用鯉魚上皮瘤細胞(epithelima popuasum cuprini，EPC)為華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)學院贈予。

1.1.3 培養(yǎng)基和主要試劑 M199培養(yǎng)基(1×，withL-glutamine & 15 mmol/L HEPES)，購于HyClone公司；胎牛血清(FBS)和細胞胰酶消化液(1×，0.25% Trypsin-EDTA)，購于Gibco公司；其他化學試劑，均購于進口或國產(chǎn)分析純。

細胞培養(yǎng)液：將M199細胞培養(yǎng)基與胎牛血清按9 ∶1(體積比)混勻，然后加入1‰抗生素氨芐青霉素和鏈霉素，青霉素工作濃度為100 U/mL，鏈霉素的工作濃度為100 μg/mL。

稀釋液：無菌條件下，細胞培養(yǎng)液用滅菌的生理鹽水(兩棲類動物生理鹽水為0.65%的NaCl溶液)稀釋。

1.1.4 試驗儀器 細胞培養(yǎng)皿、24孔板，均購于NEST公司；細胞培養(yǎng)瓶，購于NUNC公司；細胞培養(yǎng)箱，購于Thermo公司；解剖鏡SMZ745T，購于Nikon公司，數(shù)碼倒置顯微鏡Dsz2000x，購于重慶留輝科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 EPC細胞培養(yǎng) 無菌條件下，將經(jīng)傳代培養(yǎng)的EPC細胞重懸于細胞培養(yǎng)液中，調(diào)整細胞密度為1.0×106個/mL，取1 mL接種于24孔板中，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度25 ℃，通氣5% CO2。待細胞貼壁形成單層細胞后，棄去細胞培養(yǎng)液，用生理鹽水洗2遍，加入1.5 mL稀釋液，備用。

1.2.2 中型指環(huán)蟲的收集 用MS-222將金魚麻醉后，超凈工作臺下用75%乙醇擦拭魚體表面，取下鰓片用無菌水輕柔地漂洗2次，放在盛有少量無菌生理鹽水的培養(yǎng)皿中，在解剖鏡下將中型指環(huán)蟲成蟲從魚鰓上剝離。

1.2.3 中型指環(huán)蟲體外培養(yǎng)液摸索

1.2.3.1 細胞培養(yǎng)液對中型指環(huán)蟲的影響 取25個從魚鰓剝離的指環(huán)蟲，分為5 組，每組5 個指環(huán)蟲，置于等倍稀釋(2倍)不含抗生素的稀釋液中培養(yǎng)，溫度為25 ℃，每隔24 h顯微鏡下觀察1次。

1.2.3.2 抗生素對中型指環(huán)蟲的影響 取55 個從魚鰓剝離的指環(huán)蟲，分為11 組，每組5 個指環(huán)蟲，置于抗生素濃度逐步稀釋的細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)，溫度25 ℃，每隔24 h顯微鏡下觀察1次，其中，抗生素的工作濃度為100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 鏈霉素為1×。

1.2.3.3 中型指環(huán)蟲的培養(yǎng)液摸索 取55 個從魚鰓剝離的指環(huán)蟲，分為11組，每組5個指環(huán)蟲，置于逐步稀釋的稀釋液中培養(yǎng)，溫度為25 ℃，每隔24 h顯微鏡下觀察1次。

1.2.4 中型指環(huán)蟲與EPC細胞共培養(yǎng) 將“1.2.2”節(jié)中剝離的蟲體轉(zhuǎn)至“1.2.1”節(jié)中24孔板于細胞培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)，溫度25 ℃，每24 h于倒置顯微鏡下觀察1次。

2 結(jié)果與分析

2.1 細胞培養(yǎng)液對中型指環(huán)蟲的影響

由表1可知，細胞培養(yǎng)液(無抗生素)稀釋后雖然可以延緩細菌繁殖速度，但最終還是無法控制，仍需添加抗生素；推測高濃度的細胞培養(yǎng)液可能不適合指環(huán)蟲的生長。

表1 細胞培養(yǎng)液(無抗生素)對中型指環(huán)蟲的影響

2.2 抗生素對中型指環(huán)蟲的影響

由表2可知，未經(jīng)生理鹽水稀釋的細胞培養(yǎng)液(無論是否添加抗生素)對中型指環(huán)蟲的生存均有傷害；抗生素濃度在0.3×～1.0×時，均有較好的抑菌效果。

表2 抗生素濃度對指環(huán)蟲的影響

2.3 中型指環(huán)蟲的培養(yǎng)液摸索

由表3可知，體外培養(yǎng)條件適宜的為試驗第6、7組，但考慮到高濃度抗生素和高濃度細胞培養(yǎng)液對中型指環(huán)蟲的不利影響，故選擇第6組為之后中型指環(huán)蟲體外培養(yǎng)的培養(yǎng)液(細胞培養(yǎng)液與生理鹽水體積比為5∶5，抗生素工作濃度為50 U/mL青霉素及50 μg/mL鏈霉素)。

表3 不同濃度稀釋液對中型指環(huán)蟲的影響

2.4 中型指環(huán)蟲與EPC細胞共培養(yǎng)

“2.3”節(jié)中，與生理鹽水相比，中型指環(huán)蟲可以在稀釋液中存活2 d，但仍時間不夠長，推測中型指環(huán)蟲離體培養(yǎng)的難點不僅是營養(yǎng)因素，還存在缺乏寄生載體的原因。

為了模擬魚鰓表面，選擇培養(yǎng)至形成單層細胞的鯉魚上皮細胞(EPC)作為寄生載體，設(shè)計以下試驗：取30 個從魚鰓剝離的中型指環(huán)蟲，分為6 組，包括4 個對照組和2 個試驗組，每組5 個指環(huán)蟲，25 ℃培養(yǎng)，每隔24 h于顯微鏡下觀察中型指環(huán)蟲的狀態(tài)。由表4可知，比較對照組1、2，發(fā)現(xiàn)在沒有EPC細胞作為寄生載體時，即便培養(yǎng)體系中添加培養(yǎng)液，5% CO2仍會造成指環(huán)蟲的死亡；比較對照組3、4，發(fā)現(xiàn)在有或無5% CO2下，培養(yǎng)液可長期維持EPC細胞的形態(tài)不變；對比試驗組1、2，發(fā)現(xiàn)中型指環(huán)蟲可以黏附在EPC細胞上，EPC細胞可作為中型指環(huán)蟲體外培養(yǎng)的寄生載體，并且在無5% CO2環(huán)境下的EPC細胞上附著存活更長時間。此外，圖1為光鏡下中型指環(huán)蟲與EPC細胞體外共培養(yǎng)的形態(tài)觀察圖，80倍目鏡下拍攝，圖2為光鏡下中型指環(huán)蟲體外作尺蠖運動的形態(tài)觀察截圖，80倍目鏡下拍攝，圖2-A～圖2-L分別為光鏡下中型指環(huán)蟲體外作尺蠖運動0～11 s時形態(tài)觀察截圖。

3 討論

指環(huán)蟲為卵生單性世代吸蟲，結(jié)合前期研究者對單殖吸蟲的生活史(除少數(shù)寄生在海水魚體上的單殖吸蟲具有中間宿主外，其他單殖吸蟲生活史只有1個宿主)及食性研究(食物為上皮細胞、腺體分泌物、血液中的1種或幾種)[14]，參考人類日本血吸蟲的體外培養(yǎng)方法[15]，選擇鯉魚上皮瘤細胞作為寄生載體，符合上皮細胞特性，且該細胞培養(yǎng)溫度與指環(huán)蟲最適生存溫度一致。M199培養(yǎng)基是培養(yǎng)鯉魚上皮細胞的培養(yǎng)基，富含各種營養(yǎng)成分，并且試驗過程發(fā)現(xiàn)，相同試驗條件下，M199培養(yǎng)基的稀釋液比RPMI1640培養(yǎng)基稀釋液培養(yǎng)出的中型指環(huán)蟲活力更強。本研究在體外模擬指環(huán)蟲在魚鰓上寄生形態(tài)，成功構(gòu)建了中型指環(huán)蟲體外培養(yǎng)的方法及模型，并能讓中型指環(huán)蟲成蟲在體外存活6 d以上。

表4 EPC細胞對中型指環(huán)蟲的影響

注：√表示在培養(yǎng)體系中含有該物質(zhì)；×表示在培養(yǎng)體系中缺乏該物質(zhì)。

本研究在體外中型指環(huán)蟲與EPC細胞的共培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，中型指環(huán)蟲在無5% CO2環(huán)境下，寄生在EPC細胞上的存活時間更長，推測這與指環(huán)蟲在魚鰓表面寄生而非體內(nèi)寄生有關(guān)，推測指環(huán)蟲對氧氣濃度有需求，與指環(huán)蟲耐低氧性較差[16-17]一致。

中型指環(huán)蟲和壞鰓指環(huán)蟲是寄生在金魚魚鰓上的2種寄生蟲，根據(jù)相同的方法在體外進行壞鰓指環(huán)蟲與EPC細胞共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與中型指環(huán)蟲相比，壞鰓指環(huán)蟲較難附著在EPC細胞上，并且存活時間短于中型指環(huán)蟲，推測可能與指環(huán)蟲對宿主有較強的特異性有關(guān)[18]。

本研究在中型指環(huán)蟲與EPC細胞的共培養(yǎng)過程中，觀察到在EPC細胞上附著的中型指環(huán)蟲雖然具有很好的活性，但很少或幾乎不排卵，并保持成蟲形態(tài)直至死亡，這種現(xiàn)象與人體血吸蟲體外培養(yǎng)產(chǎn)卵數(shù)量少且均為不正常卵的結(jié)果[19]類似?，F(xiàn)有研究結(jié)果表明，人工干擾或不利的環(huán)境條件通常會導致單殖吸蟲蟲體集中大量產(chǎn)卵[20]，并且離體條件下的產(chǎn)卵速率通常與在體條件下的不同[14]，推測本研究的體外培養(yǎng)方法雖為中型指環(huán)蟲的生存提供比較好的營養(yǎng)條件及生存環(huán)境，但不能滿足中型指環(huán)蟲生殖的生理需求，因而中型指環(huán)蟲產(chǎn)卵少或不產(chǎn)卵。

該方法的建立解決了指環(huán)蟲必須寄生在魚鰓或幼魚鰭條上[2]，無法離體長期存活的問題。如果可以在體外培養(yǎng)指環(huán)蟲1個世代周期，不僅有利于克服指環(huán)蟲研究采樣難的限制，還能縮短指環(huán)蟲驅(qū)殺藥物創(chuàng)制研究的周期。