羊抗人ApoB高效價抗血清制備方法的建立與優(yōu)化

徐志偉， 徐小波， 于建寧， 劉偉忠

(1.江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學研究所，江蘇句容212400；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院畜牧研究所/農(nóng)業(yè)部種養(yǎng)結(jié)合重點實驗室，江蘇南京 210014)

載脂蛋白(apolipoprotein，簡稱Apo)是指血漿脂蛋白中的蛋白質(zhì)部分，Apo既是脂蛋白的構(gòu)成部分，又具有穩(wěn)定脂蛋白的功能，同時能修飾并影響與脂代謝有關(guān)的酶活性[1]。ApoB與膽固醇組成低密度脂蛋白(low density lipoprotein，簡稱LDL)，能識別LDL受體，介導LDL代謝[2-3]，所以ApoB在維持體內(nèi)血脂恒定、脂類代謝與轉(zhuǎn)運中發(fā)揮重要作用。因此，人ApoB的檢測在糖尿病、冠狀動脈綜合征等心血管疾病的診斷和臨床治療方面具有重要意義[4-5]?？赏ㄟ^測定ApoB反映低密度脂蛋白指標，而且ApoB/ApoA1的值是動脈粥樣硬化等疾病預測和診斷的重要參考。測定載脂蛋白及脂蛋白對分析心血管類疾病的狀態(tài)很有價值[4]。然而用于檢測ApoB的試劑盒尚不成熟，其難點是制備高效價和高特異性的免疫血清，目前通過大動物免疫獲得血清中的抗體效價一般都不高，提高抗體效價的研究是很有價值的。

本試驗研究用人ApoB抗原免疫湖羊，通過不同免疫劑量、不同免疫途徑及不同羊年齡的比較，形成并優(yōu)化羊抗人ApoB高效價抗血清的制備方法，以期為規(guī)?；a(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗羊與試驗期 試驗在江蘇省句容市行香羊場實施，試驗期(含預試7 d)為2017年5月8日至2017年6月20日。選擇該羊場健康湖羊公羊，幼年羊10頭(6～10月齡，平均7.4月齡，平均體質(zhì)量42.4 kg)；成年羊70頭(15～22月齡，平均18.6月齡，平均體質(zhì)量50.9 kg)；老年羊10頭(28～42月齡，平均35.1月齡，平均體質(zhì)量62.9 kg)。為利于羊身體健康和獲得好的試驗效果，采用放牧和舍飼相結(jié)合的飼養(yǎng)方法，白天放牧4 h，上午、下午各2 h，晚上飼喂精料1次，15 d 后開始試驗。

1.1.2 抗原與佐劑 ApoB抗原購自元升生物科技(上海)有限公司，純度為96%；完全弗氏與不完全弗氏佐劑購自Sigma公司。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 不同免疫劑量比較 將30頭成年羊按月齡和體質(zhì)量平均分為3組；免疫途徑為皮下多點注射，注射點分別為腹股溝3個點、肘部2個點、頜下1個點、背側(cè)2個點、耳后1個點，2側(cè)共計18個點；抗原量分別為第1組0.2 mg/(次·頭)，第2組0.4 mg/(次·頭)，第3組1.0 mg/(次·頭)，無論抗原量多少，均統(tǒng)一用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，簡稱PBS)+完全弗氏與不完全弗氏佐劑乳化成2 mL量；免疫程序：共計5次免疫，第1次、第2次間隔15 d，第2次至第5次均間隔7 d。

1.2.2 不同免疫途徑比較 試驗羊分組與不同免疫劑量比較試驗相同，免疫劑量均為0.4 mg/(次·頭)；免疫程序同“1.2.1”節(jié)；免疫途徑：第1組為肌肉多點注射，后腿肌肉群3個點、前腿肌肉群2個點、頜下1個點、背側(cè)2個點、耳后1個點，2側(cè)共18個點；第2組為皮下多點注射同“1.2.1”節(jié)；第3組為皮內(nèi)+淋巴多點注射，第1次免疫18個點位置同“1.2.1”節(jié)(皮下改成皮內(nèi))；第2次免疫18點的同時，另加2側(cè)腹股溝淋巴結(jié)，共20個點；第3～7次免疫仍然免疫18個點。

1.2.3 不同羊年齡比較 試驗羊分為3組，分別為幼年羊組、成年羊組、老年羊組，每組10頭羊；免疫劑量為 0.4 mg/(次·頭)；免疫途徑和免疫程序同“1.2.1”節(jié)。

1.3 免疫羊觀察與抗體監(jiān)測

每天觀察羊的動態(tài)，采食情況，精神狀況，作好記錄。每組試驗羊隨機抽取5頭羊，在免疫前、二免前、三免前、五免后5 d分別采血并采用酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，簡稱ELISA)法進行抗體檢測，作好記錄。

1.4 血清制備與抗體效價測定

待血液凝固之后，在超凈工作臺中用無菌滴管把血塊剝離瓶壁，在37 ℃條件下放置1～2 h，放入4 ℃冰箱過夜，血清充分析出后經(jīng)離心沉淀分離出血清，放進-20 ℃低溫冰箱保存。

抗血清效價測定采用常規(guī)的瓊脂擴散方法。設(shè)定標準陽性血清孔和陰性孔，標準陽性血清孔和抗原孔之間出現(xiàn)明顯的致密白色沉淀線，而陰性孔則不出現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同免疫劑量對免疫效果的影響

對0.2、0.4、1.0 mg/(次·頭)3個免疫組，分別于免疫前、二免前、三免前、五免后檢測血清中抗體效價，從表1可以看出，二免疫前，0.2 mg/(次·頭)組抗體效價為1 ∶25～1 ∶26，隨后逐漸升高到1 ∶28；0.4 mg/(次·頭)組明顯高于其他2組，五免后達到1 ∶28～1 ∶29；而1.0 mg/(次·頭)組二免疫前略高于0.2 mg/(次·頭)組，但三免前、五免后明顯低于0.2 mg/(次·頭)組。

表1 不同免疫劑量抗體效價比較

2.2 不同免疫途徑對免疫效果的影響

肌肉多點、皮下多點、皮內(nèi)+淋巴3種免疫途徑的抗體產(chǎn)生規(guī)律見表2，肌肉多點免疫法抗體產(chǎn)生效率最低，二免前大多為1 ∶25，三免前大多為1 ∶26，五免疫后平均達不到 1 ∶27；皮下多點及皮內(nèi)+淋巴的方法免疫效果接近，從二免前開始抗體效價就明顯高于肌肉多點組，至五免后80%的羊抗體效價達到了1 ∶29，且皮下多點與皮內(nèi)+淋巴2組間沒有差異。

2.3 免疫羊年齡對免疫效果的影響

從表3可以看出，6～10月齡的幼年羊與 28～42月齡的老年羊免疫產(chǎn)生抗體的水平接近，二免前、三免前和五免后抗體水平分別為1 ∶25、1 ∶26和1 ∶27左右，且組內(nèi)差異較大，遠不如15～22月齡的成年羊，二免前、三免前和五免后15～22月齡成年羊的抗體水平分別接近1 ∶26、1 ∶27和1 ∶29。

3 結(jié)論與討論

3.1 不同免疫劑量對免疫效果的影響

3個免疫劑量以0.4 mg/(次·頭)免疫效果最好，免疫劑量過低[0.2 mg/(次·頭)]與過高[1.0 mg/(次·頭)]都不利于抗體的產(chǎn)生。通常情況下，免疫劑量太小時因刺激小不易產(chǎn)生免疫應(yīng)答，產(chǎn)生抗體少，隨著劑量加大，抗體水平會不斷提高， 但劑量大到一定程度抗體就不再繼續(xù)增加。本試驗高劑量組出現(xiàn)了抗體水平反而降低的情況，是否是因為高劑量引起了“免疫耐受”或是“免疫抑制”還有待繼續(xù)研究。

表2 不同免疫途徑抗體效價比較

表3 不同年齡免疫羊抗體效價比較

3.2 不同免疫途徑對免疫效果的影響

3種免疫途徑中肌肉注射反應(yīng)較差，皮下多點及皮內(nèi)+淋巴2種途徑效果一致，但皮下注射操作相對比較方便。在半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(CYS-C)免疫試驗中發(fā)現(xiàn)，皮內(nèi)+淋巴的免疫方法效果明顯好于皮下多點(筆者所在團隊做的同期試驗，尚未發(fā)表)，但本試驗未能有同樣效果，這可能是由于CYS-C分子量小，皮內(nèi)+淋巴注射能增加刺激強度，而ApoB分子量較大，皮下注射已達到足夠的刺激強度。

3.3 免疫羊年齡對免疫效果的影響

15～22月齡的成年羊?qū)poB抗原的反應(yīng)強度明顯高于6～10月齡的幼年羊與28～42月齡的老年羊。出現(xiàn)這一結(jié)果的原因可能是幼年羊的免疫功能尚不健全，而老年羊的免疫功能開始退化；另外，幼年羊與老年羊組內(nèi)差異較成年羊大，一方面說明幼年羊6～10月間免疫功能發(fā)育比較快，另一方面說明老年羊組內(nèi)年齡差距太大，28月齡羊功能接近成年羊，而42月齡羊功能已大幅衰退。

綜上所述，本試驗通過不同免疫劑量、不同免疫途徑及不同羊年齡的比較，初步形成了一套以湖羊為對象的羊抗人ApoB高效價抗血清的免疫制備方法，效價接近1 ∶29。但影響免疫效果的因素很多，除了抗原自身性質(zhì)及本研究的因素之外，抗原的注射劑量、注射次數(shù)、間隔時間及抗原佐劑等都會對抗體效價產(chǎn)生影響[6-9]，要真正形成最優(yōu)方法還須要對其他因素及各因素間的互作進行研究與分析。