甘藍(lán)型油菜ALS基因啟動(dòng)子克隆及其瞬時(shí)表達(dá)分析

熊冬琴， 黃子棟， 彭 琦， 張 維， 張潔夫，3， 浦惠明，3， 陳 松，3

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，江蘇南京 210014； 2.農(nóng)業(yè)部長(zhǎng)江下游棉花與油菜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210014；3.江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京 210014；4.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇句容 212400)

油菜是世界上最主要的油料作物之一，也是我國(guó)重要的油料作物。我國(guó)油菜面積、總產(chǎn)量約占世界的1/3，是最大的油菜生產(chǎn)國(guó)。油菜油約占我國(guó)食用油市場(chǎng)的50%，是我國(guó)最主要的食用植物油。鑒于油菜在油料作物中的重要地位，油菜科學(xué)的研究一直受到學(xué)者們的高度重視。過去幾十年來，油菜遺傳改良已經(jīng)取得顯著成果，高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)雙低油菜品種在生產(chǎn)上已經(jīng)占據(jù)主導(dǎo)地位。近幾年來，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)與分子生物學(xué)研究的飛速發(fā)展，一些生物技術(shù)在油菜基礎(chǔ)與應(yīng)用研究中也得到了廣泛應(yīng)用，如在油菜的分子標(biāo)記輔助育種、高密度遺傳圖譜構(gòu)建、重要性狀基因的遺傳定位與克隆，以及基因工程改良等研究領(lǐng)域都取得了顯著進(jìn)展。

有關(guān)油菜啟動(dòng)子的研究近幾年來不斷有報(bào)道。景寅利用反向PCR方法擴(kuò)增獲得肌醇半乳糖苷合成酶基因(BnGOLS1)的啟動(dòng)子，能驅(qū)動(dòng)β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因在油菜組織中表達(dá)[1]；朱斌等用PCR擴(kuò)增方法獲得甘藍(lán)型油菜MAPK7基因家族的啟動(dòng)子[2]；王軒鵬等根據(jù)基因組序列獲得甘藍(lán)型油菜RabGDI3基因的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子能驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因gus僅在花藥中特異性表達(dá)，是組織特異性啟動(dòng)子[3]；陽(yáng)永學(xué)等通過PCR克隆獲得油菜半胱氨酸蛋白酶家族基因BnCP51的啟動(dòng)子序列，通過轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證該啟動(dòng)子僅在花蕾、花藥器官中表達(dá)，也是一種器官特異性表達(dá)啟動(dòng)子[4]；邵鐵梅等基于油菜基因組信息，利用PCR方法克隆到油菜油體蛋白基因的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子具有種子特異性表達(dá)特性，這也是繼油菜Napin啟動(dòng)子后的又一個(gè)油菜種子特異性表達(dá)的啟動(dòng)子[5]；肖旦望等用PCR方法擴(kuò)增獲得油菜溶血磷脂酰轉(zhuǎn)移酶基因(LPAT)啟動(dòng)子[6]。隨著相關(guān)研究的進(jìn)一步開展，會(huì)有越來越多的油菜啟動(dòng)子被發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用。

植物中乙酰乳酸合成酶(ALS)是催化分支氨基酸如纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成第一步的酶。研究發(fā)現(xiàn)，抑制植物細(xì)胞內(nèi)的ALS活性，會(huì)阻礙支鏈氨基酸(纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸)的生物合成，從而抑制植物細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)，嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致植物死亡。基于這個(gè)原理，一些化學(xué)公司陸續(xù)開發(fā)出了一系列ALS抑制劑類的除草劑并在生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用。此外，ALS基因也受到生物學(xué)家的普遍關(guān)注，一些植物或作物的ALS基因被克隆[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，ALS基因編碼序列發(fā)生堿基突變，則產(chǎn)生對(duì)ALS抑制類除草劑的抗性[9-10]。目前在油菜基因組中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的ALS基因有3個(gè)，即BnALS1、BnALS2、BnALS3[11]。有關(guān)油菜ALS基因的研究多集中在其抗除草劑的機(jī)制上，而關(guān)于ALS基因啟動(dòng)子的研究及應(yīng)用則鮮有報(bào)道。

本研究旨在克隆油菜ALS基因的啟動(dòng)子區(qū)域序列，并通過轉(zhuǎn)基因瞬時(shí)表達(dá)驗(yàn)證其啟動(dòng)子活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 生物試劑 引物由南京擎科生物科技有限公司合成；限制性內(nèi)切酶系NEB公司產(chǎn)品(NEB Ipswich，UK)；高保真DNA聚合酶5×TransStart FastPfu PCR 試劑、凝膠回收試劑盒EasyPure?Quick Gel Extraction Kit、T/A克隆載體pEASY-T1Kit均為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；MS培養(yǎng)基系青島海博生物有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 試驗(yàn)材料 油菜材料為江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所選育的抗除草劑品系M342；轉(zhuǎn)基因受體材料為本氏煙(Nicotianabenthamiana)，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種質(zhì)資源與生物技術(shù)研究所張保龍研究員提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 啟動(dòng)子序列克隆與啟動(dòng)子分析 根據(jù)油菜的BnALS基因序列，通過美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)檢索其相應(yīng)的油菜基因組序列，提取BnALS基因編碼區(qū)5′末端上游大約1 000個(gè)堿基的序列，通過專業(yè)網(wǎng)站(http：//molbiol-tools.ca/Promoters.htm)進(jìn)行啟動(dòng)子預(yù)測(cè)分析。然后選取上游富含啟動(dòng)子元件的1 000 bp左右的序列，設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物，并添加限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，在上游引物的5′末端添加限制性內(nèi)切酶HindⅢ的酶切位點(diǎn)，在下游引物的5′末端添加NcoⅠ的酶切位點(diǎn)，引物為PF(5′-AAGCTT GTGGAGCTGATCTTACCGACCGAAC-3′)/PR(5′-CCATGGGGTTAGAGGAGAGAGAGATGATGAA-3′)。

1.2.2 啟動(dòng)子序列擴(kuò)增、克隆、測(cè)序及分析 采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取油菜M342葉片的基因組DNA。以此為模板，用高保真DNA聚合酶擴(kuò)增油菜BnALS基因啟動(dòng)子區(qū)域的堿基序列。擴(kuò)增體系：10 μL 5×Trans Start FastPfu Buffer，1 μL基因組DNA，1 μL 10 μmol/L PF，1 μL 10 μmol/L PR，5 μL 2.5 mmol/L dNTPs，1 μL Trans Start FastPfu DNA聚合酶，用ddH2O補(bǔ)足總體積到50μL。PCR程序：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃，5 min。用瓊脂糖凝膠電泳檢查擴(kuò)增產(chǎn)物，膠回收純化1 kb左右的PCR產(chǎn)物并克隆到T/A載體pEASY-T1上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，獲得重組質(zhì)粒pEASY-P，挑取陽(yáng)性克隆送南京擎科生物科技有限公司測(cè)序。

通過Plant CARE網(wǎng)站(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare /html/)對(duì)克隆到的油菜BnALS基因上游序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1.2.3 啟動(dòng)子功能驗(yàn)證表達(dá)載體構(gòu)建 將第1.2節(jié)克隆到的啟動(dòng)子序列重組到pCAMBIA1304載體上GUS基因的5′端，這樣就構(gòu)成了由BnALS基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的1個(gè)完整的GUS基因表達(dá)框。分別提取克隆載體pEASY-P質(zhì)粒和由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存的植物表達(dá)載體pCAMBIA1304質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶HindⅢ、NcoⅠ雙酶切質(zhì)粒DNA，回收從pEASY-P質(zhì)粒切下的大小約為1 000 bp的片段，通過連接酶的作用，將啟動(dòng)子序列重組到目標(biāo)載體pCAMBIA1304的相應(yīng)酶切位點(diǎn)上。雙酶切反應(yīng)體系：總體積為50 μL，其中含有5 μL緩沖液、30 μL質(zhì)粒DNA溶液、2 μLHindⅢ、2 μLNcoⅠ、16 μL H2O，于37 ℃放置6 h或過夜。酶切后，通過瓊脂糖凝膠電泳，回收相應(yīng)的片段，進(jìn)行連接反應(yīng)，連接酶反應(yīng)體系：總體積為20 μL，含有5 μL線性化載體DNA、5 μL啟動(dòng)子DNA溶液、2 μL T4連接酶緩沖液、2 μL T4連接酶、6 μL H2O，于 16 ℃ 過夜。將連接反應(yīng)產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，在含有卡那霉素(Kan)的LB培養(yǎng)基上于37 ℃培養(yǎng)過夜。

1.2.4 煙草轉(zhuǎn)基因試驗(yàn) 為了進(jìn)一步驗(yàn)證所克隆啟動(dòng)子的生物學(xué)功能，將構(gòu)建的表達(dá)載體pCAMBIA1304-P轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105，利用葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)染煙草。具體試驗(yàn)過程如下：

1.2.5 農(nóng)桿菌的準(zhǔn)備 挑取攜帶載體pCAMBIA1304-P的農(nóng)桿菌EHA105的單菌落，接種于5 mL含有20 mg/L利福平(Rif)和50 mg/L Kan的LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。取活化過夜的農(nóng)桿菌，按1 ∶50的比例稀釋到含有 20 mg/L Rif和50 mg/L Kan的YEB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至D600 nm約為0.6～0.8。于6 000 r/min離心5 min，收集菌體，用1/2 MS液體培養(yǎng)基洗滌1次菌體，并將其稀釋至D600 nm為0.30～0.35。

1.2.6 煙草葉盤的遺傳轉(zhuǎn)化 選取苗齡約為30 d的煙草無菌苗，在無菌條件下用手術(shù)刀切取大小約為0.8 cm2的煙草葉片為外植體，投入已經(jīng)準(zhǔn)備好的農(nóng)桿菌菌液中，振蕩侵染 5 min 后，取出并用濾紙吸干附著于葉片表面的殘液，然后放在共培養(yǎng)基(1×MS，3%蔗糖，1%瓊脂粉，2.0 mg/L BA，0.5 mg/L IAA，pH值為5.8)上的暗處，溫度設(shè)為25 ℃，共培養(yǎng)48 h。

1.2.7 轉(zhuǎn)基因煙草苗的再生 將共培養(yǎng)后的煙草外植體轉(zhuǎn)到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(配方為1×MS+3%蔗糖+2.0 mg/L BA+0.5 mg/L IAA+500 mg/L羧芐青霉素+20 mg/L潮霉素+1%瓊脂粉，pH值為5.8)上進(jìn)行芽誘導(dǎo)培養(yǎng)，每隔2～3周繼代1次。繼代用的培養(yǎng)基同芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基。待不定芽長(zhǎng)出后，且芽長(zhǎng)為1.0～1.5 cm時(shí)，將芽切下?lián)Q到生根培養(yǎng)基(配方為1×MS+3%蔗糖+0.5 mg/L IAA+500 mg/L羧芐青霉素+20 mg/L潮霉素+1%瓊脂粉，pH值為5.8)上誘導(dǎo)生根。

1.2.8 轉(zhuǎn)基因煙草植株的PCR鑒定 取轉(zhuǎn)基因處理的再生煙草苗葉片，用CTAB法提取基因組DNA，另取非轉(zhuǎn)基因煙草苗葉片DNA作為陰性對(duì)照。用特異性引物進(jìn)行PCR鑒定。引物序列：PGF，5′-CGTTCACAAACTCATTCATCATCTC-3′；PGR，5′-TTTGATGCCGTTCTTTTGCTTGTCG-3′。20 μL 擴(kuò)增反應(yīng)體系：10 μL 2×Tag master mix，1 μL DNA模板，1 μL 引物PGF，1 μL引物PGR，7 μL H2O。反應(yīng)程序：94 ℃ 4 min，94 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 40 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.9 GUS活性檢測(cè) 用北京Solarbio生物科技有限公司生產(chǎn)的GUS染色液試劑盒定性檢測(cè)GUS基因的表達(dá)活性。將轉(zhuǎn)基因煙草PCR陽(yáng)性單株幼苗完整取出，去除根部的瓊脂，用無菌水清洗后，將植株浸泡在GUS顯色液中，于室溫下放置3～6 h后，用無水乙醇進(jìn)行脫色處理，鏡檢拍照。以非轉(zhuǎn)基因幼苗作為對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 油菜ALS基因啟動(dòng)子序列的克隆與分析

本研究根據(jù)BnALS基因上游序列設(shè)計(jì)特異性引物，通過PCR擴(kuò)增油菜基因組DNA的方法獲得大小約為1 000 bp的片段，詳見圖1。對(duì)該片段進(jìn)一步克隆、測(cè)序，實(shí)際獲得長(zhǎng)度為1 048 bp的BnALS基因上游序列(序列1)，詳見圖2。

通過Plant CARE網(wǎng)站(http：//bioinformatics.psb. ugent.be/webtools/plantcare/html/)對(duì)克隆到的BnALS基因上游序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示，該序列含有與啟動(dòng)子相關(guān)的多種順式作用元件，如CAAT-box、TATA-box等，表明該序列具有真核細(xì)胞啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)特征。部分順式作用元件的情況見表1。

2.2 啟動(dòng)子功能驗(yàn)證表達(dá)載體的構(gòu)建

為了進(jìn)一步驗(yàn)證所克隆的BnASL基因上游序列是否具有啟動(dòng)子功能，將該序列重組到pCAMBIA1304載體上GUS基因的5′-端，這樣就構(gòu)成了由BnALS基因的上游序列驅(qū)動(dòng)的1個(gè)完整的GUS基因表達(dá)框。分別提取獲得的克隆載體pEASY-P質(zhì)粒和筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存的植物表達(dá)載體pCAMBIA1304質(zhì)粒，并用限制性內(nèi)切酶HindⅢ、NcoⅠ雙酶切質(zhì)粒DNA，回收從pEASY-P質(zhì)粒上切下的大小約為 1 000 bp 的片段，重組到雙酶切線性化的pCAMBIA1304載體上，獲得重組載體pCAMBIA1304-P。重組載體經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切驗(yàn)證，可以得到1個(gè)大小約為1kb的片段，證明啟動(dòng)子序列已經(jīng)重組到目標(biāo)載體上(圖3)。經(jīng)測(cè)序分析可知，所克隆的啟動(dòng)子序列準(zhǔn)確插入相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，無缺失、錯(cuò)配現(xiàn)象，表明該重組載體可以用于轉(zhuǎn)基因功能的驗(yàn)證工作。

表1 ALS啟動(dòng)子序列含有的主要相關(guān)順式作用元件

2.3 煙草轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證所克隆的油菜BnALS基因上游序列的啟動(dòng)子功能，將構(gòu)建的表達(dá)載體pCAMBIA1304-P轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105，利用葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)染煙草。煙草葉片經(jīng)過農(nóng)桿菌侵染、抗性芽誘導(dǎo)、抗性芽生根等階段的再生培養(yǎng)，最終獲得轉(zhuǎn)基因煙草幼苗，其過程詳見圖4。

2.4 轉(zhuǎn)基因煙草植株的PCR鑒定

利用設(shè)計(jì)的特異性PCR引物擴(kuò)增再生幼苗的基因組DNA，鑒定轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性單株。由圖5可以看出，經(jīng)過PCR檢測(cè)，有5株幼苗擴(kuò)增到與質(zhì)粒對(duì)照相同的陽(yáng)性條帶，2株幼苗未擴(kuò)增到相應(yīng)的條帶。

2.5 GUS基因表達(dá)活性檢測(cè)

以PCR結(jié)果為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因再生煙草幼苗及非轉(zhuǎn)基因處理的煙草幼苗對(duì)照，用GUS顯色試劑盒進(jìn)行GUS基因表達(dá)活性的定性檢測(cè)。將煙草幼苗完整取出，浸泡在GUS基因顯色液中，于室溫下放置3～6 h后，用無水乙醇脫除背景色，如果有GUS基因表達(dá)活性，組織就會(huì)出現(xiàn)藍(lán)色反應(yīng)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因煙草全株均出現(xiàn)明顯的藍(lán)色反應(yīng)，而非轉(zhuǎn)基因幼苗則呈淡淡的黃色，轉(zhuǎn)基因煙草GUS活性定性檢測(cè)結(jié)果見圖6。以上結(jié)果表明，本研究克隆的BnALS基因上游序列具有較強(qiáng)的組成型表達(dá)活性， 能驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因在煙草幼苗各個(gè)器官中的表達(dá)。

3 討論

與其他真核生物一樣，植物啟動(dòng)子區(qū)域最具特征的就是TATA box序列，這是RNA聚合酶Ⅱ識(shí)別的位點(diǎn)，也是一些反式作用因子與DNA相互作用的位點(diǎn)之一。TATA box與轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)之間的堿基長(zhǎng)度是轉(zhuǎn)錄精確起始的必需因素，植物啟動(dòng)子的TATA box多在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游(32±7) bp處[12]。TATA box通過與轉(zhuǎn)錄因子TFⅡD的識(shí)別結(jié)合而發(fā)揮功能，決定RNA聚合酶起始轉(zhuǎn)錄的位點(diǎn)，以及介導(dǎo)前轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的形成并起始轉(zhuǎn)錄；起始因子(initiator，簡(jiǎn)稱Inr)是基因啟動(dòng)子核心結(jié)構(gòu)的第2種類型，與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)重疊[13]。Inr元件并無十分嚴(yán)格的同源順序，其中最關(guān)鍵的核苷酸是處于+1位置的A和+3位置的T。Inr在功能上與TATA框類似，常通過與TFIID的結(jié)合決定轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的位置起始轉(zhuǎn)錄，并能介導(dǎo)上游至少一部分激活因子的調(diào)控作用；CAAT box是Shirsat等于1989年在豌豆legA基因啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)的1個(gè)增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的元件，一般位于-75 bp附近，其保守序列為GGC/TCAATCT[14]。CAAT box控制著轉(zhuǎn)錄起始的頻率，其對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的激活作用存在雙向性，且作用距離不固定；GC box通常位于-90 bp附近，保守序列為GGGCGG，可有多個(gè)拷貝，并能以任何方向存在而不影響其功能。Kuwahara等研究發(fā)現(xiàn)，GC box需要與另一特異的轉(zhuǎn)錄因子(SP1)結(jié)合才能促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄[15]。植物啟動(dòng)子的順式元件除了CAAT box和GC box以外，不同來源的啟動(dòng)子通常還具有種屬特異的或者僅局限于某種基因家族特有的調(diào)節(jié)序列。

本試驗(yàn)根據(jù)油菜BnALS基因上游序列設(shè)計(jì)特異性引物，通過PCR擴(kuò)增獲得的ALS基因上游的1 048個(gè)堿基序列中包含多個(gè)TATA box和CAAT-box啟動(dòng)子核心序列，僅在正義鏈上就檢測(cè)到11處TATA box序列和3個(gè)CAAT-box，這些啟動(dòng)子的核心序列可能決定了轉(zhuǎn)錄的起始、方向和轉(zhuǎn)錄效率。根據(jù)植物基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)通常與上游TATA-box 的距離為(32±7) bp，以及轉(zhuǎn)錄起始?jí)A基多為A堿基的規(guī)律，推測(cè)本試驗(yàn)克隆的啟動(dòng)子起始位點(diǎn)可能是位于1 026 bp或 1 028 bp 處的A堿基。此外，BnALS基因上游區(qū)域還含有其他多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，主要有激素響應(yīng)元件、脫落酸響應(yīng)元件ABRE-motif、甲基茉莉酸響應(yīng)元件CGTCA-motif和生長(zhǎng)素等激素響應(yīng)元件TGA-element，說明ALS基因在激素響應(yīng)過程中可能起作用。此外，還有非生物脅迫響應(yīng)元件HSE和MBS，因此可見，ALS基因也可能參與干旱或熱激反應(yīng)的應(yīng)答。另外，還發(fā)現(xiàn)有多個(gè)光響應(yīng)元件，暗示ALS基因的表達(dá)可能還受到光的調(diào)控。

人們研究啟動(dòng)子的目的主要是為了弄清一些結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)與調(diào)控模式，除此以外，啟動(dòng)子在植物基因工程研究領(lǐng)域也有重要的應(yīng)用價(jià)值。啟動(dòng)子對(duì)外源基因的表達(dá)水平影響很大，是基因工程表達(dá)載體的重要元件。目前在植物基因工程中應(yīng)用最多的啟動(dòng)子是來自花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動(dòng)子和農(nóng)桿菌胭脂堿合酶基因的nos啟動(dòng)子[16]。這2個(gè)組成型表達(dá)的啟動(dòng)子常用于雙子葉植物基因工程，而在單子葉植物中應(yīng)用較多的是來自玉米的Ubi1啟動(dòng)子[17]和水稻的Act1啟動(dòng)子[18]。人們不斷開發(fā)研究新啟動(dòng)子應(yīng)用于植物的基因工程，目的是為了在植物中更高效地表達(dá)目的基因。重復(fù)使用同一種組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)2個(gè)或2個(gè)以上的外源基因表達(dá)可能會(huì)引起基因沉默或者發(fā)生共抑制[19]。另外，將從病毒基因組中克隆的啟動(dòng)子序列應(yīng)用到植物基因工程中，可能會(huì)引起人們對(duì)轉(zhuǎn)基因植物生物安全性的擔(dān)憂，因此，從植物本身克隆活性強(qiáng)的組成型啟動(dòng)子也就成了植物基因工程研究的一個(gè)重要方面。Shirasawa-Seo等從擬南芥中克隆了色氨酸合成酶亞基(PTSB1)和植物光敏色素B基因的啟動(dòng)子(PPHYB)，替代CaMV35S的組成型啟動(dòng)子，二者分別與GUS基因融合表達(dá)，活性甚至高于35S啟動(dòng)子，驅(qū)動(dòng)NPTⅡ基因表達(dá)，具有相同的效果，可以認(rèn)為擬南芥的PTSB1和PPHYB啟動(dòng)子是植物來源的可替代35S啟動(dòng)子的強(qiáng)組成型啟動(dòng)子[20]。本試驗(yàn)克隆到了BnALS基因啟動(dòng)子序列，通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)了啟動(dòng)子元件組成，并構(gòu)建了與GUS基因融合的植物表達(dá)載體，通過轉(zhuǎn)基因煙草的瞬間表達(dá)分析，初步結(jié)果顯示，所克隆的啟動(dòng)子序列能驅(qū)動(dòng)GUS基因在煙草幼苗多個(gè)器官中表達(dá)，表明該序列具有較強(qiáng)的組成型啟動(dòng)子的表達(dá)活性。