蛋白質組學的研究現(xiàn)狀及其在2型糖尿病中的應用*

張智慧，閆朝麗

（內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 內分泌科，內蒙古 呼和浩特 010059）

2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus, T2DM）是一種慢性全身性代謝性疾病，由環(huán)境因素和遺傳因素共同引起。其主要病因是胰島素分泌缺陷和胰島素抵抗（insulin resistance, IR）。2013年全國調查中T2DM患病率為10.4%，男性（11.1%）多于女性（9.6%）[1]。然而，隨著血清蛋白組學研究的深入，使得一些與疾病特定狀態(tài)相關的生物標志分子被發(fā)現(xiàn)，這為解釋疾病發(fā)生、發(fā)展機制，預防和診斷T2DM及糖尿病相關藥物的開發(fā)提供了思路。本文就蛋白質組學方法學、T2DM與炎癥因子及脂代謝相關因子機制與關系作一綜述。

1 蛋白質組學概述

生命的各項活動都離不開蛋白質，蛋白質是機體各項功能的執(zhí)行者。蛋白質組學是從1個細胞或組織的蛋白質整體活動角度來研究生命現(xiàn)象。通過比較分析病理及正常個體間的蛋白質組，找到一些與疾病相關的特異性蛋白和標志蛋白。其不僅可作為疾病診斷的血清學依據(jù)，而且為新藥的設計提供參考分子靶點[2]。

1.1 血清蛋白質組學的技術方法

蛋白質組研究主要分為兩步，首先從樣品中分離出蛋白質，然后鑒定被分離的蛋白質。其兩大關鍵核心技術是：雙向凝膠電泳技術和質譜鑒定技術[3-5]。同時由于技術的局限性，近年來也出現(xiàn)多維液相色譜和蛋白質芯片等，以下就相關技術作一闡述。

1.1.1 雙相凝膠電泳（two-dimensional gel electrophoresis,2-DE） 2-DE被認為是目前蛋白質組學中不可替代的核心技術。首先分辨率很高，可分離1 000多種蛋白質；其次敏感性高，可檢測到納克級水平蛋白質；再次通量高，在同一條件同一細胞組織中同時分析多種蛋白。2-DE的第一向進行等電聚焦，蛋白質沿pH梯度分離至各自的等電點；第二向沿垂直的方向進行分子量的分離，從而直觀地分析細胞內蛋白質組分的等電點、相對分子量和表達豐度的相對量等信息。

1.1.2 多維液相色譜（multidimensional liquid chromatography tandem, MDLC） MDLC能夠檢測出在2-DE前處理中丟失的蛋白，使其獲得的蛋白質更完整，但分離能力還不是很高。其中高效液相色譜和毛細血管電泳（capillary electrophoresis, CE）作為2-DE互補的血清蛋白質和多肽的分離分析新手段得到迅速發(fā)展，成為生物大分子快速分離鑒定的有力工具。反相液相色譜作為多維色譜分離中最后一維的分離模式，這是由于其分離效率高、分析速度快、流動相組分及質譜匹配等優(yōu)點。而離子交換色譜、親和色譜等與CE模式可作為各種復雜樣品的預分離模式。在蛋白組學的研究中，多維液相分離系統(tǒng)將會是2-DE的有益補充。

1.1.3 生物質譜 蛋白組學中最為重要的鑒定技術即生物質譜。其基本原理是將樣品分子離子化，通過離子鍵質荷比記錄，從而將得到的質譜圖與已知質譜數(shù)據(jù)庫比樣對照，確定待測化合物的屬性。盡管質譜技術分離分析能力強大，但卻難以區(qū)分2種同源性極高的蛋白，只能分離氣體狀態(tài)的帶電分子。其中電子噴霧電離質譜測量法和基質輔助激光解吸電離/飛行時間質譜測量法最為常用。

1.1.4 蛋白質芯片 蛋白質芯片是一種蛋白質分析技術，是基因芯片的補充。其在同一時間向以蛋白質或多肽為材料分析整個蛋白質組。蛋白質芯片和質譜分析技術目前被聯(lián)合用來研究差異表達的蛋白質，即通過不同的蛋白樣品和同一蛋白質芯片相互作用，洗掉未結合的蛋白質，再利用質譜技術分析鑒定。對于低分子量、低豐度，以及疏水的蛋白質血清及組織粗樣品的直接檢測最為適用。

2 蛋白質組學在T2DM中的應用

2.1 T2DM急性時相期蛋白

近年來，部分學者認為T2DM可能與炎癥相關，認為T2DM是一種低度炎癥及自然免疫性的慢性疾病[6]。C反應蛋白（C-reactive protein, CRP）、α2-巨球蛋白（α2-macroglobulin, α2-M）是T2DM臨床上較為敏感的標志物。

2.1.1 CRP CRP是一種急性期蛋白，由于組織損傷或刺激后在肝臟產(chǎn)生。其以非共價鍵形式結合，形成環(huán)狀五球體。CRP不僅可以與多種自身配體或外來配體結合，被C1q識別，進而激活補體活化的經(jīng)典途徑，成為機體的防御功能的重要組分，而且可以限制由于補體激活后的炎癥反應所帶來的潛在破壞性[7]。LI等[8]研究認為T2DM是易感個體，因各種因素作用致先天性免疫系統(tǒng)被激活，產(chǎn)生多種炎癥反應因子，從而參與IR和代謝綜合征（metabolic syndrome, MS）的發(fā)生、發(fā)展。

譚英[9]通過觀察不同體重指數(shù)（body mass index,BMI）糖尿病患者血清中CRP含量，發(fā)現(xiàn)CRP與BMI、胰島素抵抗指數(shù)（the insulin resistance index,HOMR-IR）呈正相關，與胰島素敏感指數(shù)呈負相關。這表明炎癥反應與肥胖關系密切，同時也說明炎癥反應激活可能參與IR，因為CRP是臨床最有效的炎癥反應標志物。陳春蓮等[10]研究發(fā)現(xiàn)，T2DM患者血清CRP水平高于健康者，進一步證明炎癥參與T2DM的發(fā)生、發(fā)展。

RIAZ等[11]比較糖尿病患者和健康人群血清中差異蛋白質水平的變化，為增加準確性，實驗利用單向電泳和2-DE找到差異蛋白，平行進行質譜分析發(fā)現(xiàn)，與正常人相比，CRP增加872%，因此，RIAZ等[11]認為糖尿病人群中CRP的增加支持糖尿病的發(fā)生與炎癥和肥胖有關這一觀點。

2.1.2 α2-M α2-M作為一種蛋白質在血漿中分子量最大，主要由肝細胞和單核吞噬細胞系統(tǒng)合成。是一種內源性蛋白酶抑制劑，同時也充當細胞因子/生長因子的轉運蛋白與多功能結合蛋白。該蛋白質的分子量為180 kD，但約720 kD分子量的四聚體形式也存在于血清中[12]。

α2-M血漿水平升高代表著生命的生長、發(fā)育及分化，在胚胎發(fā)育、妊娠和兒童期有著重要的意義。大多數(shù)疾病情況下α2-M濃度不發(fā)生變化，成人每天大約可以代謝分解掉10%α2-M。α2-M與蛋白酶結合形成的復合物，由于發(fā)生構象改變被有關細胞受體識別，快速從血循環(huán)中被清除。生理狀態(tài)下，與多種分子或離子結合是α2-M最突出的功能，特別是與多種蛋白水解酶結合從而影響這些酶的活性[13]。而在炎癥和感染等病理情況下，α2-M在機體合成大量增加，同時與過量產(chǎn)生的蛋白水解酶結合并加速其清除，以起到保護組織免于炎癥或免疫損傷的作用。因而，α2-M的作用主要表現(xiàn)為消除組織中內源性和外源性的蛋白酶，與某些蛋白酶抑制因子共同調節(jié)控制蛋白水解活性[14]。

TAKADA等[15]通過質譜分析發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者中的單體α2-M增加，然而其四聚體形式只是略微增加。α2-M不僅是心臟肥大和糖尿病性心肌梗死的早期分子標志，同時也是參與心臟及動脈粥樣硬化的急性期血清生物標志物的蛋白質，而在糖尿病初期就表現(xiàn)為上調。因此，TAKADA等[15]認為在人類血漿中α2-M解離的單體形式可能會成為診斷T2DM的重要生物標志物。

2.2 T2DM的脂代謝紊亂

T2DM與IR關系密切，脂肪組織不僅可貯存能量，而且可分泌某些生理活性物質來影響胰島素的敏感性，影響人體內血糖的調節(jié)，因此脂代謝可能也參與T2DM的發(fā)生、發(fā)展。而載脂蛋白A1（apolipoprotein A1, Apo A1）、叢生蛋白（Clusterin, CLU）和鋅-α-2糖蛋白（Zinc-alpha-2-glycoprotein, ZAG）的研究較為廣泛。

2.2.1 載脂蛋白A1 載脂蛋白作為血漿脂蛋白的組成部分，其不但可轉運脂類物質并穩(wěn)定脂蛋白的結構，甚至可激活脂蛋白代謝酶、促進脂類運輸、調節(jié)酶活性和引導血漿脂蛋白同細胞表面受體結合。Apo A1是高密度脂蛋白（high density lipoprotein, HDL）中的主要載脂蛋白[16]。

RIAZ等[11]通過單向電泳和2-DE 2種方法尋找糖尿病患者和健康人群血清中蛋白質的差異，并通過質譜分析比較相關差異蛋白的變化。與健康人群相比糖尿病患者Apo A1下調，同時其認為Apo A1與肥胖相關，因此可作為參與T2DM發(fā)生、發(fā)展的生物標志物[11]。

JIANG等[17]認為，在肥胖、IR及T2DM中，Apo A1降低常伴隨著Apo B升高，Apo B/Apo A1是高血壓、MS和糖尿病的危險因子，Apo B/Apo A1比值適用于糖尿病、肥胖人群的風險評估，具有臨床意義。

2.2.2 CLU CLU別名載脂蛋白J和分泌蛋白40-40。生理狀態(tài)下，主要參與組織修復、脂質轉運、補體抑制及細胞凋亡等生物學過程。病理條件下，CLU被認為是癌癥、神經(jīng)退行性疾病、腎小球腎炎及心肌梗死等多種疾病發(fā)生、發(fā)展過程中的有效因素。

CLU通常被認為主要與HDL相關，尤其富含于HDL 3小分支。HOOFNAGLE等[18]通過同位素稀釋質譜法對HDL、低密度脂蛋白（low density lipoprotein,LDL）、極低密度脂蛋白（very low density lipoprotein,VLDL）、總膽固醇、甘油三酯（Triglyceride, TG）等蛋白質進行研究表明，在HDL較低與TG較高的人群中，CLU水平均較低，這成為發(fā)展為代謝綜合征的主要組成部分。HOOFNAGLE等[18]發(fā)現(xiàn)HDL中的CLU水平與胰島素敏感性呈正相關；與肥胖及脂代謝紊亂呈負相關，相比之下，其他類型的蛋白質與代謝綜合征的這些特征并無相關。因此CLU的損耗表明存在著功能失調的HDL。這一發(fā)現(xiàn)，結合Apo B相關脂蛋白和IR中CLU水平的直接聯(lián)系，增加IR可能將蛋白質從HDL轉變?yōu)閂LDL和LDL的可能性，而脂類代謝的改變繼發(fā)于IR與代謝綜合征HDL中CLU的減低。

2.2.3 ZAG ZAG是新近發(fā)現(xiàn)的一種細胞因子，其促進脂類降解的同時還可以調節(jié)脂類代謝，促進脂肪酸氧化，活化解偶聯(lián)蛋白增加產(chǎn)熱。ZAG還可通過自分泌或旁分泌的方式影響其他脂肪因子的表達，如促進脂聯(lián)素、抑制瘦素在脂肪組織中的表達[19]。故認為與肥胖、IR密切相關。

劉瑞等[20]研究發(fā)現(xiàn)，空腹血清ZAG水平在肥胖、糖耐量受損、T2DM組中較正常對照組減低，提示ZAG可能與糖脂代謝紊亂和肥胖有重要的關系。

RUSSELL等[21]將從人血漿中純化的ZAG，按94種不同劑量腹腔注射雄性NMRI小鼠。結果發(fā)現(xiàn)，ZAG對降低小鼠BMI具有時間和劑量依賴性。體脂分析表明，小鼠BMI減少的主要原因是脂肪含量減少。證實了人體內ZAG與BMI有關。YANG等[22]研究發(fā)現(xiàn)，血漿中HDL、脂聯(lián)素與ZAG呈正相關。BMI、腰臀圍、體脂比、TG、空腹胰島素和HOMR-IR等與ZAG呈負相關。ZAG水平在糖尿病患者中低于糖尿病前期患者，多囊卵巢綜合征女性與健康女性相比ZAG水平減低。

因此，ZAG可能作為一個與肥胖及肥胖相關的IR的生物標志物。SELVA等[23]研究發(fā)現(xiàn)，脂肪組織中ZAG水平與ZAG mRNA水平呈正相關，因此，其認為脂肪組織對ZAG影響重大。

3 現(xiàn)狀與展望

近年來，蛋白組學在腫瘤、心血管等重大疾病血清的研究中被廣泛應用。然而其研究才剛剛起步，因此重復性不理想，一些低豐度蛋白難以鑒定，研究耗時且費用昂貴，研究依舊集中在比較T2DM個體與健康個體的組織和血清等樣品，仍處于對疾病研究初期的摸索階段。隨著蛋白質組學技術的不斷完善，有望獲得在病理狀態(tài)下異常表達的蛋白質標志物。最終可用于全面了解生理和病理狀態(tài)下T2DM蛋白質的質譜變化，篩選出重要診斷依據(jù)。這不僅對更好地理解T2DM的病理、生理有益，同時也有助于發(fā)現(xiàn)疾病的新靶點。