流式細(xì)胞術(shù)最新進展及臨床應(yīng)用①

程小艷 武會娟

(北京市理化分析測試中心，北京市基因測序與功能分析工程技術(shù)中心，北京 100094)

流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry，F(xiàn)CM)，臨床上也被稱為流式細(xì)胞分析，是利用流式細(xì)胞儀同時對單個細(xì)胞的多個參數(shù)進行定性/定量(相對/絕對)分析的生物醫(yī)學(xué)分析技術(shù),檢測速度快、通量高、靈敏度高、采集數(shù)據(jù)量大、節(jié)約樣本及成本，在臨床上已經(jīng)廣泛應(yīng)用于血液學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、精子學(xué)等檢驗領(lǐng)域，是未來臨床檢驗不可替代的檢測方法之一。

傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)，也被稱為熒光流式細(xì)胞術(shù)，是基于熒光標(biāo)記及熒光發(fā)射光譜檢測的一門綜合性技術(shù)，定量方式多為定性分析，檢測參數(shù)類型單一、數(shù)目有限，數(shù)據(jù)分析復(fù)雜且缺乏標(biāo)準(zhǔn)化分析流程，不同檢測中心間數(shù)據(jù)重現(xiàn)性差，這些都限制了它在臨床檢驗中進一步的推廣及應(yīng)用。近年來，為克服以上問題，流式細(xì)胞術(shù)不斷突破與創(chuàng)新，從定性檢測發(fā)展為定量檢測；從單參數(shù)分析、雙參數(shù)分析發(fā)展成為多參數(shù)分析；從檢測細(xì)胞表面抗原到胞內(nèi)抗原及分泌到胞外的抗原；從檢測蛋白表達(dá)水平發(fā)展為檢測蛋白定位、蛋白功能及蛋白翻譯后修飾等；從一維定量檢測發(fā)展為二維定量定位分析，從體外檢測發(fā)展為體內(nèi)檢測等；這些突破使得流式細(xì)胞術(shù)可以實現(xiàn)從單細(xì)胞水平去認(rèn)識細(xì)胞在生理或病理狀態(tài)下的免疫表型、分子表型甚至各種復(fù)雜的信號通路變化等，因此將更為廣泛應(yīng)用于臨床檢測。

1 定量流式細(xì)胞術(shù)

定量流式細(xì)胞術(shù)(Quantitative flow cytometry,QFCM)，即通過流式細(xì)胞儀定量檢測細(xì)胞或微球上熒光素的中值熒光強度(Median fluorescent intensity，MFI)或每個細(xì)胞結(jié)合的抗體單位(Antibodies bound to per cell,ABC)來對生物分子進行相對或絕對定量的流式細(xì)胞技術(shù)。定量流式細(xì)胞術(shù)已被證明是一種功能強大的臨床檢驗技術(shù)，但由于MFI缺乏標(biāo)準(zhǔn)化度量方法，容易引起不同檢測中心檢測結(jié)果重現(xiàn)性差，導(dǎo)致診斷和治療決策的不確定性及不可靠性，限制了其在臨床的推廣應(yīng)用，因此，標(biāo)準(zhǔn)化MFI測量為流式細(xì)胞術(shù)實現(xiàn)精確定量分析，在臨床廣泛應(yīng)用的必經(jīng)之路。目前，在臨床應(yīng)用過程中，為提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性及重現(xiàn)性，定量流式細(xì)胞術(shù)必須做到以下幾點：①樣本及試劑處理嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，每一次檢測必須設(shè)置質(zhì)控管；②流式細(xì)胞儀維護及校準(zhǔn)。每一次檢測前進行儀器校準(zhǔn)；③檢測流程標(biāo)準(zhǔn)化及規(guī)范化；④數(shù)據(jù)分析自動化。流式檢測數(shù)據(jù)量龐大，分析難度大，經(jīng)驗性強，人工分析存在主觀性和低保真度等特點。實現(xiàn)機器操控及數(shù)據(jù)分析的標(biāo)準(zhǔn)化、自動化將會大大提高檢測數(shù)據(jù)的再現(xiàn)性及可靠性。

2 多色流式細(xì)胞術(shù)

多色流式細(xì)胞術(shù)(Multicolor flow cytometry,MFC)是指利用超過三種的熒光素實現(xiàn)多個參數(shù)同時檢測的流式細(xì)胞技術(shù)。近年來，隨著流式細(xì)胞儀硬件(激光管、濾光片等)、軟件(數(shù)據(jù)分析等)的不斷改進，熒光素的不斷開發(fā)及應(yīng)用，臨床診斷領(lǐng)域的不斷發(fā)展及需求，MFC應(yīng)運而生。大部分臨床檢驗中心的流式細(xì)胞儀具備2～3個激光器，可以同時檢測9～10色熒光，甚至出現(xiàn)了5激光20參數(shù)同時檢測的流式細(xì)胞儀。多色流式細(xì)胞術(shù)可以快速準(zhǔn)確高靈敏的檢測細(xì)胞內(nèi)多個指標(biāo)，實現(xiàn)從復(fù)雜樣本中識別罕見細(xì)胞群，為疾病診斷、藥物開發(fā)等提供了強大的工具，是流式細(xì)胞術(shù)未來發(fā)展的主要趨勢，也是流式細(xì)胞術(shù)在臨床應(yīng)用的主要方向。但由于結(jié)果分析的復(fù)雜性，MFC目前在臨床應(yīng)用中還主要是作為探索或輔助手段。例如，吳江等[1]利用多色流式細(xì)胞術(shù)分析急性 HIV 感染者外周血γδT細(xì)胞的表型，探索哪一種γδT 細(xì)胞在急性 HIV 感染及疾病進展中發(fā)揮重要作用。流式細(xì)胞術(shù)評分系統(tǒng)經(jīng)常被整合到疾病診斷和預(yù)后評分系統(tǒng)中，輔助精細(xì)評分。例如，基于CD79b(或CD22)、CD23、CD5、FMC7及SmIg檢測的流式細(xì)胞術(shù)免疫分型評分參與輔助診斷慢性淋巴細(xì)胞白血病[2]；利用MFC檢測骨髓祖細(xì)胞側(cè)向角散射光、CD117表達(dá)以及單核細(xì)胞CD13表達(dá)等參數(shù)建立的流式檢測積分系統(tǒng)可以補充目前的骨髓增生異常綜合征國際預(yù)后評分系統(tǒng)(IPSS-R)，實現(xiàn)更為精確的預(yù)后評估[3]；利用MFC檢測分析來自骨髓的造血細(xì)胞的免疫分型可以輔助慢性髓細(xì)胞白血病的診斷、預(yù)后和治療[4]；利用MFC檢測白血病細(xì)胞表面分化抗原可以輔助白血病分型診斷及白血病微小殘留物診斷[5]；基于GPI錨連蛋白缺失檢測的MFC可以輔助陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥診斷；基于多種分子標(biāo)記物[血小板特異性膜糖蛋白(GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb-Ⅸ-Ⅴ、GPⅠa/Ⅱa等)、血小板顆粒膜糖蛋白(CD62P、CD63、CD107a、CD107b等)]、Ca2+流及RNA含量等檢測的MFC可以輔助血小板功能分析等[6]。

3 磷酸化流式細(xì)胞術(shù)

磷酸化流式細(xì)胞術(shù)(Phospho-specific flow cytometry，Phospho-flow)，是指高通量檢測單個細(xì)胞內(nèi)多個磷酸化蛋白的流式細(xì)胞術(shù)。細(xì)胞信號通路中關(guān)鍵因子的磷酸化水平是細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究的重要內(nèi)容，而經(jīng)典的生化方法對信號通路的分析非常有限，因為它不僅只能一次檢測一個蛋白的磷酸化水平，并且獲得的結(jié)果為一群細(xì)胞內(nèi)蛋白磷酸化水平的平均值，這一方面無法實現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)信號網(wǎng)絡(luò)的全面分析，另一方面在面對異質(zhì)細(xì)胞群體時也很難獲得準(zhǔn)確的結(jié)果，而磷酸化流式細(xì)胞術(shù)很好地克服了這些難題，它借助于多種信號分子的磷酸化抗體，在單個細(xì)胞水平上同時分析細(xì)胞內(nèi)多個蛋白因子的磷酸化水平，從而獲得更高水平的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)動力學(xué)，實現(xiàn)單個細(xì)胞內(nèi)信號通路的全面分析。

Phospho-flow已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多個領(lǐng)域，包括抗原或微生物刺激下免疫應(yīng)答過程中的信號通路研究、癌癥及自身免疫性疾病相關(guān)信號通路研究、疾病相關(guān)標(biāo)記物及藥物的高通量篩選等。例如：利用Phospho-flow檢測CD3陽性T細(xì)胞中的核糖體S6蛋白磷酸化水平來進行心臟移植患者mTOR抑制劑依維莫司治療藥物的監(jiān)測[7]；利用Phospho-flow檢測肝移植患者外周血單核細(xì)胞(PBMCs)中p70S6K磷酸化水平來評估西羅莫司藥效學(xué)敏感性[8]；利用Phospho-flow測定主動脈瓣狹窄小鼠模型中的循環(huán)白細(xì)胞和血小板-白細(xì)胞聚集體(PLA)中的Smad2/3磷酸化水平來探究TGF-β1活化在該病發(fā)病中的作用[9]；利用Phospho-flow篩選JAK2抑制劑fedratinib(FED)在急性髓系白血病(AML)患者體內(nèi)的應(yīng)答的生物標(biāo)志物，篩選出STAT5磷酸化水平作為具有高特異性和強陽性預(yù)測值的藥物生物標(biāo)志物等[10]。

4 流式微球分析技術(shù)

流式微球分析技術(shù)(Cytometric bead assay，CBA)，指利用類似于細(xì)胞大小的微球(如聚苯乙烯微球、磁性微球等)作為載體，以流式細(xì)胞儀作為檢測平臺，對液體中可溶性成分進行高通量快速分析的一門新技術(shù)。傳統(tǒng)的CBA技術(shù)的工作原理是將多種捕獲抗體包被在具有不同熒光強度的微球上形成捕獲微球，與待測樣品溶液混合后，微球上包被的抗體就與樣品中對應(yīng)的抗原結(jié)合，再加入熒光素標(biāo)記的檢測抗體，形成類似“三明治”的檢測復(fù)合物，采用流式細(xì)胞儀進行檢測，微球上結(jié)合的待測抗原或抗體分子數(shù)量與其熒光強度呈線性關(guān)系，由此可對待測液體中與微球上包被的抗體分子相對應(yīng)的抗原進行定性或定量分析。CBA是集ELISA和流式細(xì)胞技術(shù)優(yōu)點于一身的液相蛋白分析系統(tǒng)，具有檢測通量大、樣本用量少、速度快、檢出限低等特點，為一個高度靈活的多元分析平臺，已被用于疾病監(jiān)測、藥物開發(fā)、食品安全、環(huán)境監(jiān)測等諸多領(lǐng)域。

近年來，該技術(shù)發(fā)展迅速，在重復(fù)性、檢測通量及靈敏度等方面都取得了較大的突破，如今，CBA技術(shù)可以實現(xiàn)同一樣本中高達(dá)70個蛋白的精確絕對定量，檢測靈敏度可以達(dá)到10-1pg/ml，檢測時間僅需要3.5 h。除此之外，在以下兩方面也有較大的突破：(1)檢測指標(biāo)類型。傳統(tǒng)CBA技術(shù)，主要適用于檢測具有完全免疫原性的大分子物質(zhì)。例如：檢測微量樣本(血液、眼淚、血清、唾液等)中的細(xì)胞因子，血漿中炎癥因子的水平，細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，凋亡相關(guān)蛋白等。例如，Waleed等[11]利用CBA技術(shù)檢測了中東呼吸綜合征冠狀病毒MERS-CoV感染后T輔助(Th)1、Th2和Th17細(xì)胞因子(IFN-γ、IFN-α2、IL-2、IL-4、IL-5、IL-12、IL-13、TNF-α、IL-15和IL-17等)水平；龐盼等[12]利用CBA技術(shù)檢測細(xì)胞因子轉(zhuǎn)化生長因子-β 和白細(xì)胞介素-10在布魯氏菌病(Brucellosis)患者血清中的變化，探究布魯氏菌感染后的免疫調(diào)控機制；近年來，CBA技術(shù)在痕量小分子物質(zhì)(相對分子質(zhì)量<1 kD)，例如中藥小分子成分、真菌毒素、農(nóng)藥殘留等的檢測方面也取得了快速進展[13]。例如，Xiao等[14]開發(fā)了一種基于磁性微球的CBA方法，用于快速及高靈敏度地檢測麥芽中的痕量赭曲霉毒素A，檢測極限低至0.025 μg/kg。Sandra等[15]開發(fā)了同樣基于磁性微球的CBA方法，用于可靠且快速的檢測同一食物樣本中的多種葡萄球菌腸毒素B，為篩選食物中金黃色葡萄球菌和/或腸毒素提供了新的思路與方法。(2)微球類型。傳統(tǒng)CBA技術(shù)常采用普通聚苯乙烯微球，操作工藝復(fù)雜，經(jīng)過洗滌，離心，偶聯(lián)和免疫反應(yīng)等步驟后，微球回收率通常較低，不利于進行多重檢測分析。近年來，磁性微球作為相對新型的固體載體，由于具有以下優(yōu)勢而得到了廣泛推廣及使用。①簡化操作流程?；谄浯判?，磁性微球可使CBA技術(shù)操作流程更加高效、自動化、可并行化及可控；②提高了檢測靈敏度和特異性；③磁分離剪切力較低，不會影響抗原-抗體結(jié)合和洗滌過程中蛋白質(zhì)的構(gòu)象和功能；④可與探針分子結(jié)合等。基于這些突破，借助于流式強大的數(shù)據(jù)分析軟件，CBA技術(shù)可以實現(xiàn)高通量、高靈敏度及高精確度的定量檢測分析,將更為廣泛應(yīng)用于免疫疾病監(jiān)控、腫瘤研究、藥物研發(fā)及藥效評估、疫苗研究、總體免疫功能分析等眾多領(lǐng)域。

5 質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)

傳統(tǒng)的熒光流式細(xì)胞術(shù)是基于熒光發(fā)射光譜的檢測，但熒光基團發(fā)射光譜一般較寬，多參數(shù)檢測時，不同熒光素發(fā)射光譜之間往往會發(fā)生重疊，這會導(dǎo)致兩方面問題：①檢測通量受限；②檢測難度提高。為了保證數(shù)據(jù)精確，多參數(shù)檢測時必須進行熒光補償調(diào)節(jié)，大大增加了檢測的復(fù)雜性，為傳統(tǒng)熒光流式細(xì)胞術(shù)難以攻克的技術(shù)難題，而質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)(Mass Cytometry)恰能很好地解決這一難題。

Mass Cytometry是利用金屬元素標(biāo)記抗體取代了熒光素標(biāo)記抗體，利用質(zhì)譜檢測取代熒光發(fā)射光譜檢測的新興流式細(xì)胞術(shù)。與熒光流式細(xì)胞技術(shù)相比，質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)主要有兩點不同： 第一， 抗體標(biāo)記系統(tǒng)不同。前者使用熒光素作為抗體標(biāo)記物，后者則使用金屬元素作為標(biāo)記物；理想的標(biāo)記物需要滿足四個特點：①生物樣本中含量低；②無放射性；③易于標(biāo)記及檢測；④種類多。金屬元素，在細(xì)胞中含量極低，且與細(xì)胞的非特異性結(jié)合少，檢測背景低；目前已發(fā)現(xiàn)的金屬元素種類超過100種，已用于抗體標(biāo)記的金屬元素超過30種，例如鈀、鋱、鈥等。因此，金屬元素相較于熒光素具有更多優(yōu)勢，成為細(xì)胞標(biāo)記物極佳的選擇。第二，檢測系統(tǒng)不同。前者檢測系統(tǒng)為激光器和光電倍增管，而后者使用電感耦合等離子體質(zhì)譜技術(shù)ICP-MS作為檢測手段。ICP-MS技術(shù)，相較于傳統(tǒng)分析技術(shù)如火焰法、石墨爐法、電感耦合等離子體發(fā)射光譜，檢出限最低、動態(tài)線性范圍最寬(ng/L～mg/L)、干擾最少、分析精密度高、分析速度快(1～3 min/樣本)，可以同時測定多種元素，分辨率高，相鄰檢測通道間的干擾小于0.3%， 靈敏度及穩(wěn)定性也較高，同一樣品不同時間檢測結(jié)果間的變異系數(shù)值小于3%。綜上，質(zhì)譜流式技術(shù)一方面將檢測通道數(shù)量提高至幾十甚至上百個；另一方面規(guī)避了通道間信號的干擾，省略了繁雜的補償調(diào)節(jié)，節(jié)約了樣本和試劑，簡化了實驗設(shè)計及操作流程， 提升了數(shù)據(jù)可靠性。因此，質(zhì)譜流式技術(shù)，將成為流式細(xì)胞分析，尤其是多參數(shù)分析的重要發(fā)展方向，不僅開啟了流式細(xì)胞技術(shù)的“后熒光時代”，也標(biāo)志著流式細(xì)胞技術(shù)進入了一個全新的高通量時代。它將實現(xiàn)更為精確全面的免疫分型及細(xì)胞內(nèi)信號網(wǎng)絡(luò)分析等，在免疫細(xì)胞分型、腫瘤研究等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。例如，Korin等[16]在Nature Protocols雜志上發(fā)表了利用質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠腦室免疫細(xì)胞群的方法，并詳細(xì)描述了操作流程，包括腦灌注、腦組織提取及其單細(xì)胞懸液制備，利用金屬標(biāo)記的抗體進行細(xì)胞染色，使用質(zhì)譜細(xì)胞儀讀取數(shù)據(jù)等步驟。整個操作過程僅需要不到5 h(不包括數(shù)據(jù)分析)，并且指出該方法不僅可以在正常和病理條件下監(jiān)測大腦免疫群體的變化，還可以推廣至脊髓免疫細(xì)胞分析等[16]。Schulz等[17]利用質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)檢測乳腺癌組織中的3種mRNA靶標(biāo)分子和16種蛋白質(zhì)，并指出這種多重檢測方法將允許靈活的從患者樣本中提取可用于診斷或治療的目的信息，可以實現(xiàn)更為詳細(xì)的腫瘤生物學(xué)樣本研究，并將作為一種全面的基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析的工具。

6 成像流式細(xì)胞術(shù)

流式細(xì)胞術(shù)的以上進展都停留在“量”這一個維度，研究者獲得的細(xì)胞信息非常有限，對細(xì)胞的了解只基于檢測散點圖上的一個點，而不是真實的細(xì)胞圖像，無法獲得細(xì)胞形態(tài)學(xué)、檢測指標(biāo)的亞細(xì)胞定位等信息，無法更加立體完整地鑒別細(xì)胞。成像流式細(xì)胞術(shù)(Imaging flow cytometry,IFC)攻克了這一技術(shù)瓶頸。

IFC集成了流式細(xì)胞術(shù)及數(shù)字顯微技術(shù)，不僅可以獲得細(xì)胞群的統(tǒng)計數(shù)據(jù)信息，還可以實現(xiàn)單個細(xì)胞高分辨率的數(shù)字成像，實現(xiàn)目的細(xì)胞的可視化，獲得細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化、胞內(nèi)分子分布變化、細(xì)胞間信號傳導(dǎo)變化、細(xì)胞狀態(tài)變化等數(shù)據(jù)信息，實現(xiàn)了全面多維度分析鑒別細(xì)胞，為復(fù)雜細(xì)胞表型檢測、罕見細(xì)胞(例如腫瘤循環(huán)細(xì)胞)和過渡狀態(tài)的細(xì)胞(例如有絲分裂階段細(xì)胞)識別、疾病診斷、新標(biāo)志物挖掘、個性化醫(yī)療及藥物開發(fā)提供了新的可能性。同時IFC繼承了兩種技術(shù)在過去十年中的發(fā)展成果，在儀器硬件及分析軟件方面均發(fā)展迅速，取得了重大進展。Merck & Millipore公司已推出了新一代高速細(xì)胞成像系統(tǒng)ImageStreamX MarkⅡ，可以在數(shù)分鐘內(nèi)捕獲數(shù)十萬個單個細(xì)胞的多通道數(shù)字圖像，數(shù)據(jù)分析采用IDEAS?軟件，利用所采集的細(xì)胞圖像對熒光(強度及位置)及細(xì)胞形態(tài)參數(shù)(包括形狀、強度、紋理等)等上千種量化參數(shù)進行高通量分析，借此形成每個細(xì)胞的形態(tài)輪廓，然后比較細(xì)胞之間的相似性(或相關(guān)性)，用以定義細(xì)胞亞群或鑒定疾病特異性表型。同時，基于機器學(xué)習(xí)的開放式高通量IFC數(shù)據(jù)分析程序已經(jīng)面市，基于深度學(xué)習(xí)(Deep learning)的快速圖像處理程序也在不斷開發(fā)，并在鑒定結(jié)腸癌細(xì)胞、重建細(xì)胞周期和疾病進展等方面已經(jīng)取得了成功，美國食品和藥物管理局(FDA)也于2017年批準(zhǔn)了第一個臨床深度學(xué)習(xí)應(yīng)用程序，因此未來IFC數(shù)據(jù)分析將更加快速、準(zhǔn)確[17，18]。

近年來，雖然目前IFC的應(yīng)用主要集中在科學(xué)研究領(lǐng)域，但在臨床診斷中也十分有潛力，不僅適合對非黏附或分離細(xì)胞進行成像分析，在血液等體液樣本成像分析上更具優(yōu)勢，因為這些樣本的結(jié)構(gòu)在制備切片過程中會因為涂抹而變形。適用的臨床應(yīng)用領(lǐng)域包括：(1)復(fù)雜疾病診斷。復(fù)雜疾病的診斷需要基于多個維度信息，例如，傳統(tǒng)的急性白血病診斷分型需要結(jié)合分析基于光學(xué)顯微鏡的形態(tài)學(xué)檢測數(shù)據(jù)、基于流式細(xì)胞術(shù)的表型檢測數(shù)據(jù)以及基于熒光原位雜交的染色體核型分析等遺傳信息檢測數(shù)據(jù)，而成像流式細(xì)胞術(shù)可以集三種分析于一體，為白血病的診斷評估提供了新的思路，并且只需較少的生物標(biāo)志物，極大地簡化實驗室樣品制備過程，甚至可采用更為理想的無需染色和預(yù)處理的血液樣品，這將有助于保持樣品的完整“原生性”。Erber實驗室利用成像流式細(xì)胞術(shù)實現(xiàn)了懸浮細(xì)胞的表型分析及熒光原位雜交，評估了PML小體、核磷蛋白的亞細(xì)胞定位、 NPM1基因C末端區(qū)域(外顯子12)內(nèi)的突變等在急性髓細(xì)胞性白血病(AML)診斷和預(yù)后評估中的應(yīng)用價值[19]；(2)輻射劑量檢測。當(dāng)物理劑量測定方法不存在或受到質(zhì)疑時，基于生物計量學(xué)的輻射損傷標(biāo)記物分析技術(shù)顯得更加有效。例如通過雙著絲粒(和環(huán))染色體畸變檢測(DCA)法定量中期細(xì)胞分裂相雙著絲粒染色體數(shù)目等。但傳統(tǒng)生物計量學(xué)技術(shù)需要借助于顯微鏡，樣本制備耗時、檢測通量有限，數(shù)據(jù)分析繁瑣，而IFC可以高通量自動成像和分析血液樣本中輻射損傷標(biāo)記物，檢測流程及分析流程均可以生成標(biāo)準(zhǔn)性模板，批量完成檢測及數(shù)據(jù)分析，因此，在大規(guī)模放射性/核事件中，IFC可以取代傳統(tǒng)基于顯微鏡的生物劑量學(xué)分析技術(shù)，用于高通量輻射劑量分析[20]。(3)紅細(xì)胞生成。紅細(xì)胞生成障礙會引發(fā)多種疾病，例如遺傳性貧血，過度增殖性疾病和骨髓增生異常綜合征等，開發(fā)一種可靠的方法來描述稀有促紅細(xì)胞生成中間體，才能更好地了解紅細(xì)胞生成過程。單獨利用傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)或者顯微鏡成像技術(shù)都面臨諸多挑戰(zhàn)，包括紅細(xì)胞中間體免疫表型標(biāo)記物十分有限，中間體細(xì)胞數(shù)目稀少并伴隨形態(tài)學(xué)變化，細(xì)胞器丟失等，而由于IFC可以整合兩種技術(shù)，實現(xiàn)同時檢測細(xì)胞免疫表型及細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征，用于描繪與經(jīng)典組織學(xué)分類相關(guān)的成紅細(xì)胞。McGrath等[21]利用IFC將鼠骨髓中的紅細(xì)胞分成7個亞群，包括4種成紅細(xì)胞(親堿性幼紅細(xì)胞、嗜堿性幼紅細(xì)胞、嗜多色性幼紅細(xì)胞、正染色幼紅細(xì)胞)，含有消除核的白細(xì)胞，去核網(wǎng)狀細(xì)胞和成熟紅細(xì)胞。

7 體內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)

體內(nèi)流式細(xì)胞儀(In vivo flow cytometer，IVFC)是一種簡單的共聚焦顯微鏡，基于熒光的IVFC的基本原理與傳統(tǒng)的流式細(xì)胞儀相似，不同之處在于它利用活體中的天然血管代替?zhèn)鹘y(tǒng)流式細(xì)胞儀中的單一流動鞘。 當(dāng)熒光標(biāo)記的細(xì)胞通過聚焦在血管上的激光束狹縫時，它可以被激發(fā)發(fā)出熒光，熒光信號可以被PMT檢測到，從而實現(xiàn)實時監(jiān)測活體動物模型中的熒光標(biāo)記細(xì)胞，成為生物醫(yī)學(xué)研究的一種強大的技術(shù)，并具有以下優(yōu)點：(1)無創(chuàng)。IVFC對體內(nèi)流動細(xì)胞的干擾小。(2)長時間監(jiān)測。IVFC無需采血，可以實現(xiàn)體內(nèi)血流中細(xì)胞的原位檢測，而由于作為生物醫(yī)學(xué)研究中經(jīng)典的實驗動物模型的小鼠，血液量約為2 ml。只允許采集3～10次血液來進行傳統(tǒng)的流式細(xì)胞儀測量，因此，IVFC更適合進行長時間的延時觀察，可以實現(xiàn)細(xì)胞群能夠連續(xù)和長時間的追蹤，從而檢測其在血液循環(huán)中的動態(tài)變化。(3)更為敏感的監(jiān)測異常信號。研究發(fā)現(xiàn)，在監(jiān)測癌癥轉(zhuǎn)移時，用IVFC標(biāo)記綠色熒光蛋白的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測效率比常規(guī)流式細(xì)胞術(shù)高1.8倍[21]。

基于這些優(yōu)勢特點，IVFC特別適用于追蹤循環(huán)系統(tǒng)中的特定細(xì)胞，因此已應(yīng)用于許多領(lǐng)域，尤其是涉及血液循環(huán)中細(xì)胞的疾病及生物學(xué)過程，例如癌癥轉(zhuǎn)移，免疫學(xué)、納米粒子檢測、生殖醫(yī)學(xué)及干細(xì)胞治療等。下面重點介紹IVFC在腫瘤轉(zhuǎn)移及免疫學(xué)監(jiān)測方面的應(yīng)用。(1)癌癥轉(zhuǎn)移。由于循環(huán)腫瘤細(xì)胞在癌癥發(fā)展中很早出現(xiàn)，因此CTC的定量已被認(rèn)為是癌癥診斷和預(yù)后中潛在的有力工具，并且研究發(fā)現(xiàn)，CTC集群具有比單個CTC更大的轉(zhuǎn)移潛能，因此監(jiān)測CTC集群對于監(jiān)測腫瘤轉(zhuǎn)移具有重要價值。IVFC被證明可以實現(xiàn)無創(chuàng)地、持續(xù)地監(jiān)測CTC動態(tài)，并可以實現(xiàn)CTC集群計數(shù)，在轉(zhuǎn)移性癌癥的分期、早期檢測和治療反應(yīng)監(jiān)測中都將具有重要價值[22]。(2)免疫學(xué)。免疫系統(tǒng)通過從遠(yuǎn)處，例如淋巴結(jié)、骨髓和脾臟等，募集白細(xì)胞來響應(yīng)局部感染或損傷。從這些淋巴器官釋放的白細(xì)胞通過循環(huán)系統(tǒng)流入目的地，因此，IVFC可以實現(xiàn)量化循環(huán)白細(xì)胞的數(shù)量，提供感染或炎癥反應(yīng)的診斷標(biāo)記，成為非侵入性地監(jiān)測免疫反應(yīng)的理想工具。總之，在過去的十年里，IVFC作為直接在血流中檢測、計數(shù)和表征單個循環(huán)細(xì)胞的獨特方法，發(fā)展十分迅速，已經(jīng)應(yīng)用于許多重要的臨床前研究應(yīng)用[23]。儀器檢測靈敏度、重復(fù)利用能力和易用性等方面的持續(xù)改進，將促進IVFC領(lǐng)域的持續(xù)增長，代表著未來腫瘤學(xué)和免疫學(xué)的重要的新型臨床監(jiān)測工具。

綜上所述，流式細(xì)胞術(shù)飛速發(fā)展，成為無可取代的臨床診斷輔助技術(shù)，尤其在高通量臨床診斷中應(yīng)用前景可觀，但由于缺乏標(biāo)準(zhǔn)化操作流程，數(shù)據(jù)分析繁瑣等問題，仍無法完全取代傳統(tǒng)診斷方法，因此，未來流式細(xì)胞術(shù)只有更加關(guān)注操作標(biāo)準(zhǔn)化、數(shù)據(jù)分析的智能化、批量化等，才能在臨床檢驗診斷中發(fā)揮更大的作用。