藥物代謝誘導(dǎo)毒性的體外預(yù)測(cè)方法研究進(jìn)展

孫亞奇 ，陸啟榮 ，劉愛梅 ，劉振利 ，王 旭 ，潘源虎 ，袁宗輝

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)1.動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，2.國家獸藥殘留基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部食品獸藥殘留檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070）

現(xiàn)代藥物開發(fā)流程先是確定藥物的作用靶點(diǎn)，然后根據(jù)靶點(diǎn)設(shè)計(jì)出先導(dǎo)化合物，接下來是精心優(yōu)化選擇的先導(dǎo)化合物，在體內(nèi)外進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)、毒理學(xué)和藥效學(xué)測(cè)試，最后是臨床前和臨床研究［1］。數(shù)據(jù)顯示，5000種候選化合物中大概只有1種可以上市。每一種藥物的開發(fā)成本接近26億美元，其中很大一部分歸因于候選化合物的失?。?］。候選藥物失敗的最主要原因?yàn)槎拘院蛧?yán)重的不良反應(yīng)。外源化合物對(duì)人和動(dòng)物體的毒性作用不僅是由本身引起的，還可能是母體化合物代謝為毒性代謝物（包括主要代謝物和微量代謝物）引起的。非爾氨酯（felbamate）的毒性是由其通過醛脫氫酶和谷胱甘肽結(jié)合途徑所產(chǎn)生的活性代謝物引起的，而人體內(nèi)的醛脫氫酶和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶是大鼠的5倍，這就是為什么在臨床前研究中未觀察到非爾氨酯毒性的原因［3］。為增加藥物開發(fā)成功的機(jī)會(huì)，對(duì)藥物及其代謝亞組的整體毒性進(jìn)行預(yù)測(cè)評(píng)估是篩選潛在毒性化合物的必要步驟，且可降低藥物的開發(fā)成本，減少藥物毒性的發(fā)生，從而為開發(fā)出藥理活性好、安全性高和毒性低的藥物提供技術(shù)支持。

1 計(jì)算毒理學(xué)（in silico Toxicology）方法預(yù)測(cè)化合物毒性

動(dòng)物模型在傳統(tǒng)的毒性預(yù)測(cè)中一直發(fā)揮著重要的作用，它可直觀地反映藥物在體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化以及對(duì)動(dòng)物機(jī)體的毒性作用，但動(dòng)物模型價(jià)格昂貴，耗時(shí)，通量低，更重要的是由于種屬差異，從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物獲得的數(shù)據(jù)并不能準(zhǔn)確對(duì)人類進(jìn)行預(yù)測(cè)。近年來，隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的飛速發(fā)展，計(jì)算毒理學(xué)方法應(yīng)運(yùn)而生。計(jì)算毒理學(xué)是基于統(tǒng)計(jì)學(xué)、化學(xué)和生物信息學(xué)等學(xué)科，借助數(shù)學(xué)模型和計(jì)算機(jī)等構(gòu)建計(jì)算毒理學(xué)模型，評(píng)估化學(xué)物質(zhì)的環(huán)境暴露以及對(duì)危害與風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行高效模擬預(yù)測(cè)。它使用計(jì)算資源（即方法、算法、軟件和數(shù)據(jù)等）來組織、分析、建模、模擬和可視化預(yù)測(cè)化合物的毒性［4］。它與計(jì)算藥理學(xué)相互交織，使用計(jì)算工具的信息來分析藥物的有效性和毒性。計(jì)算毒理學(xué)方法現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于新藥研發(fā)的早期篩選階段，用來預(yù)測(cè)先導(dǎo)化合物和候選藥物對(duì)人體產(chǎn)生的代謝毒性。

Fashe等［5］使用計(jì)算毒理學(xué)預(yù)測(cè)得到毛果天芥菜堿（lasiocarpine）和倒千里光堿（retrorsine）的C3位置和克氏千里光堿（senkirkin）的C26位最有利于羥基化從而導(dǎo)致其有毒代謝物的產(chǎn)生。Moorthy等［6］以查耳酮為原料，采用環(huán)化法合成了一系列黃酮衍生物，對(duì)合成的化合物使用計(jì)算毒理學(xué)方法預(yù)測(cè)了代謝和毒性。預(yù)測(cè)結(jié)果表明，具有羥基官能團(tuán)的化合物發(fā)生硫酸鹽和O-葡萄糖苷酸結(jié)合反應(yīng)，甲氧基衍生物進(jìn)行去甲基化反應(yīng)。該衍生物活性化合物在致癌、致畸和致敏感等方面均無毒性。Chavan等［7］對(duì)帕博昔布（palbociclib，PAB）進(jìn)行了體內(nèi)體外代謝研究，在體內(nèi)共檢測(cè)到14種代謝物。為確定這些代謝物的毒性潛力，使用TOPKAT和DEREK軟件進(jìn)行了計(jì)算毒理學(xué)毒性預(yù)測(cè)。預(yù)測(cè)結(jié)果表明，所有代謝物（M2，M9和M14除外）均顯示出高毒性。Gonzalez-Marino等［8］研究了新煙堿類殺蟲劑尼替吡喃（nitenpyram，NPY）在紫外線和太陽照射下在水溶液中的光降解，以評(píng)價(jià)其在環(huán)境中的穩(wěn)定性及轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的毒性。在計(jì)算毒理學(xué)毒性評(píng)價(jià)中發(fā)現(xiàn)，其中大多數(shù)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物具有高于NPY的急性毒性。Rudik等［9］創(chuàng)建了web應(yīng)用程序MetaTox（http：//way2drug.com/mg），用于預(yù)測(cè)代謝物的毒性，可對(duì)生成的每一種代謝物進(jìn)行急性毒性（基于GUSAR軟件預(yù)測(cè)）、特殊毒性和不良反應(yīng)（基于PASS軟件預(yù)測(cè)）的評(píng)估，預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率高達(dá)90%。

在過去的幾十年中，定量構(gòu)效關(guān)系（quantitative structure-activity relationship，QSAR）模型已被用于計(jì)算毒理學(xué)預(yù)測(cè)化合物結(jié)構(gòu)與藥效、毒性之間的關(guān)系。它的最大特點(diǎn)是可利用已知化合物的結(jié)構(gòu)和信息建立構(gòu)效關(guān)系模型，然后通過此模型預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)類似化合物的藥效和毒性。該法由于它的高通量性可極大地提高藥物篩選效率，降低藥物研發(fā)成本，縮短實(shí)驗(yàn)周期，減少動(dòng)物模型的使用。

蔣慧等［10］采用QSAR方法預(yù)測(cè)獸藥喹烯酮（quinocetone，QCT）及其代謝物的毒性。首先，通過查閱文獻(xiàn)建立喹烯酮代謝基團(tuán)，然后利用計(jì)算機(jī)輔助藥物分子設(shè)計(jì)方法對(duì)其毒理活性進(jìn)行比較分析。用ADMET Predictor 6.5預(yù)測(cè)原形及代謝物代謝組群的毒性。最后，將預(yù)測(cè)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，探討動(dòng)物體內(nèi)喹烯酮毒理活性的關(guān)鍵物質(zhì)。預(yù)測(cè)結(jié)果表明，代謝組群中6種化合物（QCT，4-DQCT，1-DQCT，QCT-M10，QCT-M12和QCT-M15）具有生殖毒性，而另14種化合物則否，預(yù)測(cè)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，說明該方法在預(yù)測(cè)代謝物毒性方面具有可行性，可以為喹烯酮后續(xù)代謝毒理學(xué)研究提供技術(shù)支持。Dmitriev等［11］基于早期對(duì)藥物代謝預(yù)測(cè)的經(jīng)驗(yàn)以及對(duì)嚙齒類動(dòng)物急性毒性的研究，采用QSAR方法建立了一種將代謝物預(yù)測(cè)與整體毒性評(píng)估相結(jié)合的計(jì)算方法。該法考慮了母體化合物及其毒性最強(qiáng)的代謝物的特性，從而找到了預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)與已發(fā)表數(shù)據(jù)之間的最佳對(duì)應(yīng)關(guān)系。然后以抗癲癇藥物非爾氨酯為例，驗(yàn)證了該法的可行性。Liu等［12］利用統(tǒng)計(jì)算法建立基于分子結(jié)構(gòu)訓(xùn)練數(shù)據(jù)集及其相關(guān)性質(zhì)或毒性數(shù)據(jù)的QSAR模型。首先，通過數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)檢索確定了與臨床肝損傷相關(guān)的植物性藥物及其主要植物化學(xué)成分。然后，用計(jì)算毒理學(xué)QSAR對(duì)植物化學(xué)物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的肝毒性（如肝轉(zhuǎn)氨酶升高）進(jìn)行了預(yù)測(cè)并與文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行了比較，預(yù)測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

計(jì)算毒理學(xué)在預(yù)測(cè)藥物代謝毒性上，可顯著地降低成本，節(jié)省時(shí)間，從而降低藥物開發(fā)后期的損耗率?？蓱?yīng)用于新藥研發(fā)的早期篩選階段，用于化學(xué)物的毒性預(yù)測(cè)及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估優(yōu)先級(jí)分級(jí)。但計(jì)算毒理學(xué)模型的建立高度依賴于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，而現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的不一致性可能導(dǎo)致預(yù)測(cè)模型的不準(zhǔn)確性［13］。另外，計(jì)算毒理學(xué)模型的不準(zhǔn)確性還可能由于所收集的多種數(shù)據(jù)的實(shí)驗(yàn)條件不同、數(shù)據(jù)集不平衡所造成［14］。

2 肝樣細(xì)胞模型預(yù)測(cè)化合物毒性

近年來，許多新興的體外技術(shù)發(fā)展迅速，他們被用來做代謝誘導(dǎo)的毒性研究具有高通量、快速、價(jià)廉的優(yōu)點(diǎn)［15］。傳統(tǒng)體外毒性預(yù)測(cè)模型包括分離的肝切片［16］、原發(fā)性肝細(xì)胞［17］、轉(zhuǎn)化的肝癌細(xì)胞系、表達(dá)P450的永生化肝細(xì)胞［18］以及人肝微粒體（human liver microsome，HLM）和分離重組細(xì)胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）亞型。肝細(xì)胞和肝切片與體內(nèi)系統(tǒng)最為相似，低溫保存的原代肝細(xì)胞保持了原有結(jié)構(gòu)和大多數(shù)體內(nèi)功能，已廣泛用于體外藥物檢測(cè)，被認(rèn)為是藥物篩選的金標(biāo)準(zhǔn)［19］。原發(fā)性肝細(xì)胞含有大量的藥物代謝酶，但難以培養(yǎng)和維持代謝酶的生理水平，價(jià)格昂貴。普通肝細(xì)胞易于培養(yǎng)，但缺乏代謝化合物的能力。

3 高通量芯片模型預(yù)測(cè)化合物毒性

為適應(yīng)當(dāng)今世界新藥研發(fā)的速度，尤其需要開發(fā)一種高通量、高效率的代謝毒性模型。廣大科研人員基于這一理念，研發(fā)出了一系列具有芯片模型篩選特性的體外代謝致毒預(yù)測(cè)模型。Yu等［20］開發(fā)了數(shù)據(jù)分析毒理學(xué)芯片（DataChip）和代謝酶毒理學(xué)芯片（MetaChip）技術(shù)，它們將代謝和基于細(xì)胞的篩選聯(lián)系起來。DataChip是一種功能化微柱芯片，支持Hep3B人肝癌細(xì)胞的三維微陣列。MetaChip是一種含有在人肝中發(fā)現(xiàn)的固定化代謝酶的微孔芯片。為驗(yàn)證在芯片上原位生成化合物代謝物和快速評(píng)估其毒性的概念，將22個(gè)模型化合物分配到MetaChip中，并與DataChip夾在一起。芯片平臺(tái)獲得的半數(shù)抑制濃度（inhibitory concentration 50，IC50）與大鼠半數(shù)致死量（lethal does 50，LD50）、人Cmax和藥物性肝損傷類別相比較，預(yù)測(cè)體內(nèi)藥物不良反應(yīng)。該平臺(tái)在IC50和Cmax的最佳截?cái)帱c(diǎn)處具有100%敏感性、86%特異性和93%總體預(yù)測(cè)能力。因此，DataChip/MetaChip平臺(tái)可作為常規(guī)體外多孔平臺(tái)的高通量、早期、微尺度替代品，為藥物開發(fā)早期代謝誘導(dǎo)毒性提供快速、價(jià)廉的評(píng)估。

肝中各種藥物代謝酶（drug metabolic enzymes，DME）的差異表達(dá)可能導(dǎo)致個(gè)體藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的變化，從而導(dǎo)致藥物在個(gè)體間的毒性差異。Kwon等［21］開發(fā)出“轉(zhuǎn)染酶和代謝芯片”（TeamChip）技術(shù)，它可預(yù)測(cè)代謝誘導(dǎo)的藥物毒性。TeamChip是通過將含有藥物代謝酶的微孔芯片打印到含有微型三維細(xì)胞微陣列的微柱芯片上制備的。使用該芯片的用戶能選擇單個(gè)或多人的代謝酶基因（如CYP3A4，CYP2D6，CYP2C9，CYP1A2，CYP2E1和UGT1A4）在THLE-2細(xì)胞微陣列表達(dá)。為鑒定與藥物解毒有關(guān)的特定酶，作者在單個(gè)微陣列上以組合方式創(chuàng)建了84種代謝酶基因表達(dá)的組合。因此，TeamChip平臺(tái)可對(duì)代謝誘導(dǎo)的待測(cè)化合物的毒性進(jìn)行高通量分析。

高通量芯片技術(shù)可對(duì)藥物代謝誘導(dǎo)毒性進(jìn)行快速、高效、準(zhǔn)確的評(píng)估，在新藥早期開發(fā)階段尤為重要。它可部分替代動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用，雖然該模型仍處于研究階段，尚未正式應(yīng)用于臨床，但隨著科技的發(fā)展和技術(shù)的進(jìn)步，高通量芯片模型必將成為未來代謝毒性預(yù)測(cè)的一個(gè)發(fā)展方向。

4 三維細(xì)胞培養(yǎng)預(yù)測(cè)化合物毒性

三維（three dimension）立體細(xì)胞培養(yǎng)是近年來在二維（two dimension）單層細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的更接近于人體真實(shí)細(xì)胞的一種培養(yǎng)方法，常被用于肝毒性檢測(cè)，也可用于藥理與毒理學(xué)的其他領(lǐng)域。由于二維細(xì)胞培養(yǎng)模型缺乏組織和器官的三維結(jié)構(gòu)因而不能充分模擬體內(nèi)細(xì)胞的生長微環(huán)境，不能代表細(xì)胞在體內(nèi)的生理狀態(tài)，因此在反應(yīng)藥物肝毒性上缺乏敏感性。而三維細(xì)胞模型則正好解決了這個(gè)問題。它在體外將具有相似組織結(jié)構(gòu)的三維生物材料（即具有各種化學(xué)性質(zhì)的水凝膠基質(zhì)中的類有機(jī)化合物、微組織、小球和細(xì)胞）與各種細(xì)胞共培養(yǎng)，從而使細(xì)胞可在立體空間結(jié)構(gòu)中遷移和生長。三維細(xì)胞模型可模擬體內(nèi)細(xì)胞微環(huán)境，能使原代肝細(xì)胞維持高水平的特異性基因表達(dá)，通常能表現(xiàn)出更好的細(xì)胞形態(tài)學(xué)和生理學(xué)特征。因此，越來越多的研究轉(zhuǎn)向使用三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)來開展藥物早期毒性篩查。Yu等［22］對(duì)現(xiàn)有的高通量篩選檢測(cè)方法進(jìn)行改進(jìn)，以評(píng)估代謝誘導(dǎo)的化合物毒性，開發(fā)了一個(gè)384孔板平臺(tái)，該平臺(tái)使用三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。將海藻酸鹽和基底凝膠混合物中的人胚腎HEK293細(xì)胞打印在含有代謝酶的384孔板上，用試劑盒測(cè)定HEK293細(xì)胞的活力和膜完整性。結(jié)果表明，測(cè)得的Z’因子和變異系數(shù)分別＞0.6%和＜14%，說明在384孔板上建立的測(cè)定方法可靠性和重現(xiàn)性良好。

三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)主要包括三明治培養(yǎng)法、球形培養(yǎng)法和各種微流控或多器官生物芯片。

4.1 三明治培養(yǎng)

三明治培養(yǎng)是最常見的一種三維培養(yǎng)法，它可模擬肝細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）（如膠原蛋白、基質(zhì)凝膠、殼聚糖、透明質(zhì)酸和聚電解質(zhì)等）之間的相互作用，使肝細(xì)胞在長期培養(yǎng)中保持肝的特異性功能。即將融合的單層原代肝細(xì)胞置于鼠尾膠原和膠凝的ECM之間來培養(yǎng)制成三明治培養(yǎng)模型［23］。這種模型可減少細(xì)胞骨架變化，降低細(xì)胞扁平度，同時(shí)穩(wěn)定細(xì)胞與細(xì)胞間的接觸。另外，在這種結(jié)構(gòu)中，肝細(xì)胞保留了細(xì)胞極化、膽小管功能網(wǎng)絡(luò)的形成以及相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)等特征和功能［24］。因此，該模型特別適用于肝膽輸運(yùn)和藥物性肝損傷的研究。然而，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長會(huì)導(dǎo)致CYP450活性的下調(diào)。當(dāng)用于廣泛的藥物毒性篩選和代謝物鑒定時(shí)，預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率只有30%～50%［25］?？傊?，三明治培養(yǎng)被廣泛應(yīng)用于肝膽輸運(yùn)的研究，而它們?cè)诜悄懼俜e，尤其是長期肝毒性評(píng)估方面的應(yīng)用有限。

4.2 球形培養(yǎng)

球形培養(yǎng)是在不黏附基質(zhì)的情況下懸浮培養(yǎng)的肝細(xì)胞形成多細(xì)胞球體的一種培養(yǎng)方法。多細(xì)胞球體是在生物反應(yīng)器中攪拌產(chǎn)生的細(xì)胞三維聚集體、懸滴培養(yǎng)物或超低附著表面上的重力聚集體，它能構(gòu)成96孔的高通量篩選模型，且技術(shù)投入少［26］。從肝細(xì)胞系、原代肝細(xì)胞或干細(xì)胞衍生的肝細(xì)胞樣細(xì)胞進(jìn)行三維球形培養(yǎng)，可全面改善細(xì)胞表型和功能。與三明治培養(yǎng)相比，球形培養(yǎng)對(duì)藥物肝毒性具有更高的敏感性。如大鼠橢球體對(duì)雙氯芬酸、半乳糖胺、異煙肼、對(duì)乙酰氨基酚（撲熱息痛）、間二硝基苯和3-硝基苯胺等6種肝毒性藥物敏感。球形培養(yǎng)的細(xì)胞還能保持長期的細(xì)胞活性，維持肝細(xì)胞的極性并有Ⅰ相和Ⅱ相代謝酶的表達(dá)［27］。因此，肝細(xì)胞球可應(yīng)用于分析藥物代謝物，以及研究藥物的長期肝毒性。然而，許多研究缺乏球形培養(yǎng)對(duì)慢性藥物毒性敏感性的系統(tǒng)評(píng)價(jià)。此外，大多數(shù)研究只將球形培養(yǎng)模型與二維肝細(xì)胞培養(yǎng)相比較，而缺乏與活體肝的比較。

4.3 中空纖維三維生物反應(yīng)器

中空纖維三維生物反應(yīng)器是一種更接近于體內(nèi)肝形態(tài)的體外模型。盡管球形培養(yǎng)由于能在整體上很好地維持肝表型而備受歡迎，但它卻不能提供灌注。然而血流動(dòng)力學(xué)和剪應(yīng)力已被證明對(duì)肝功能有深遠(yuǎn)的影響［28］。因此，為構(gòu)建更接近體內(nèi)肝復(fù)雜形態(tài)的體外模型，用于三維灌注的多室中空纖維膜生物反應(yīng)器技術(shù)被開發(fā)用于額外的體內(nèi)肝支持的大規(guī)模系統(tǒng)（800 mL）。中空纖維生物反應(yīng)器技術(shù)由3個(gè)獨(dú)立且相互交織的毛細(xì)管系統(tǒng)組成，用于動(dòng)靜脈介質(zhì)的灌注、供氧和去二氧化碳。它能在數(shù)周內(nèi)維持肝的表型和功能。當(dāng)生物反應(yīng)器接種肝細(xì)胞時(shí)，這些細(xì)胞在培養(yǎng)過程中自組裝成組織樣結(jié)構(gòu)，包括新膽道和新竇狀內(nèi)皮化結(jié)構(gòu)。該生物反應(yīng)器體積僅有2 mL，對(duì)應(yīng)1.2×108個(gè)細(xì)胞，可用于藥物臨床前檢測(cè)［29］。然而，由于它需要大量的細(xì)胞（大約是單個(gè)球體細(xì)胞數(shù)的8萬倍）阻礙了該平臺(tái)用于中到大規(guī)模毒性研究。

4.4 器官芯片系統(tǒng)（Organ-on-a-Chip）

器官芯片系統(tǒng)是在微流控技術(shù)以及微加工細(xì)胞生物學(xué)的基礎(chǔ)上發(fā)展而來。由于它是通過產(chǎn)生剪切力、生化濃度梯度等物理和化學(xué)刺激，使細(xì)胞能對(duì)這些刺激響應(yīng)自組裝，因此器官芯片系統(tǒng)更能表現(xiàn)出人體的真實(shí)生理功能［30］。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，外源物質(zhì)經(jīng)肝代謝產(chǎn)生的毒素通常對(duì)其他器官也會(huì)造成毒性。為研究這些器官之間的相互代謝作用機(jī)制，常用肝細(xì)胞或組織與其他器官進(jìn)行共同研究。Choucha-Snouber等［31］構(gòu)建了一種肝-腎共培養(yǎng)芯片，該芯片有2個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)腔，一個(gè)含有腎細(xì)胞系（MDCK），另一個(gè)含有肝細(xì)胞系（HepG2或HepaRG）。結(jié)果表明，僅在MDCK細(xì)胞和HepaRG細(xì)胞（非HepG2細(xì)胞）共培養(yǎng)時(shí)，抗癌藥物異環(huán)磷酰胺表現(xiàn)出腎毒性作用，說明其腎毒性作用是通過在HepaRG細(xì)胞中形成細(xì)胞毒性代謝物產(chǎn)生的。Oleaga等［32］設(shè)計(jì)了一種利用心、肌、肝（HepG2/C3A）和神經(jīng)元單位開發(fā)灌注多器官芯片系統(tǒng)。用乙酰氨基酚、丙戊酸、多柔比星和阿托伐他汀4種已知對(duì)心臟、肌肉、肝等有特定作用的藥物來評(píng)價(jià)該模型的有效性。作者進(jìn)一步證明了這些多器官系統(tǒng)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)與體內(nèi)數(shù)據(jù)是一致的，表明該平臺(tái)是研究某些藥物多血管毒性反應(yīng)的可行工具。最近，Miller等［33］提出了一個(gè)代表13個(gè)器官的多器官芯片系統(tǒng)，該系統(tǒng)能分離屏障和非屏障細(xì)胞。而且作者考慮了體內(nèi)器官體積和流速，以使系統(tǒng)能模擬體內(nèi)生理灌注。他們使用5種人類細(xì)胞系描述了該平臺(tái)的性能，發(fā)現(xiàn)它們?cè)?周內(nèi)穩(wěn)定可行。此外，他們還報(bào)道了CYP1A1和CYP3A4在此培養(yǎng)期間的酶活性，但這些多器官系統(tǒng)在表型、穩(wěn)定性或?qū)λ幬锉┞兜拿舾行苑矫媸欠駜?yōu)于單器官培養(yǎng)仍有待證明。

綜上，三明治培養(yǎng)可使肝細(xì)胞在長期培養(yǎng)中保持肝的特異性功能，適合應(yīng)用于肝膽輸運(yùn)的研究，但在長期培養(yǎng)時(shí)，由于CYP450活性下調(diào)，并不適合長期肝毒性評(píng)估。球形培養(yǎng)能在整體上很好地維持肝表型，并伴有代謝酶的表達(dá)，可用于分析藥物代謝物，以及研究藥物的長期肝毒性，但不能提供灌注，未考慮血流動(dòng)力學(xué)和剪應(yīng)力的影響。而中空纖維生物反應(yīng)器正好解決了這一問題，它更接近體內(nèi)肝的復(fù)雜形態(tài)，能數(shù)周維持肝的表型和功能，具有代謝活性，可用于藥物臨床前檢測(cè)，但由于它需要大量的細(xì)胞作為支持，因此不適用于大規(guī)模毒性研究。器官芯片系統(tǒng)考慮到人體的復(fù)雜性，將多個(gè)器官連接到單個(gè)芯片上，表現(xiàn)出更真實(shí)的生理功能。它已用來研究各器官組織之間的代謝及相互作用性、某些藥物的多器官毒性反應(yīng)等，但目前仍處于發(fā)展的起步階段，仍需繼續(xù)深入研究。

5 結(jié)語

本文主要介紹了計(jì)算毒理學(xué)、肝樣細(xì)胞模型、高通量芯片模型以及三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)等新型體外代謝毒性預(yù)測(cè)模型。計(jì)算毒理學(xué)基于計(jì)算機(jī)技術(shù)、生物信息學(xué)以及現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)先導(dǎo)化合物和候選藥物對(duì)人體產(chǎn)生的代謝毒性進(jìn)行預(yù)測(cè)，它能縮短研發(fā)周期，降低開發(fā)成本，提高新藥開發(fā)成功率。但由于它高度依賴于現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，因此應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行嚴(yán)格審核和考察，以保證預(yù)測(cè)模型的準(zhǔn)確性。高通量芯片技術(shù)利用生物化學(xué)以及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)對(duì)一系列化合物的生物活性進(jìn)行篩選和檢測(cè)，能快速、高通量地對(duì)代謝毒性進(jìn)行預(yù)測(cè)。當(dāng)然，此模型的建立目前還處于初級(jí)階段，仍需要繼續(xù)進(jìn)行深入研究。三維細(xì)胞模型可模擬體內(nèi)細(xì)胞的生長微環(huán)境，很好地表現(xiàn)出細(xì)胞在體內(nèi)的生理狀態(tài)，尤其是中空纖維三維生物反應(yīng)器以及器官芯片系統(tǒng)技術(shù)的開發(fā)，使得體外預(yù)測(cè)藥物代謝與毒性更加準(zhǔn)確真實(shí)。但在這些平臺(tái)被廣泛應(yīng)用于臨床時(shí)，需要對(duì)這些模型進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)估和驗(yàn)證。尤需要在細(xì)胞活力和穩(wěn)定性、關(guān)鍵代謝以及信號(hào)通路等方面對(duì)平臺(tái)進(jìn)行比較。

基于高通量細(xì)胞培養(yǎng)以及芯片技術(shù)的發(fā)展、檢測(cè)分析自動(dòng)化的進(jìn)步、新型實(shí)驗(yàn)平臺(tái)的建立，開發(fā)一種更為高效、快速、準(zhǔn)確的代謝毒性預(yù)測(cè)模型將為新藥開發(fā)帶來便利。