交聯(lián)聚異丁烯對小鼠巨噬細(xì)胞的細(xì)胞相容性和免疫相容性

潘邦倫，章華穎，姜麗麗，林翰超，方小娟，姜 力，李 偉，2

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院、生命科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035；2.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325035）

聚異丁烯（polyisobutylene，PIB）及其衍生物已廣泛地應(yīng)用于醫(yī)療器械領(lǐng)域，包括心血管載藥支架涂層和青光眼引流管等。PIB因其較低的滲透性、熱穩(wěn)定性、彈性-可折疊性、氧穩(wěn)定性和較高的粘性系數(shù)，得到越來越多的關(guān)注［1］，基于PIB的創(chuàng)新醫(yī)療器械正在進(jìn)行更深入的臨床試驗(yàn)。巨噬細(xì)胞作為免疫系統(tǒng)的重要組成部分，發(fā)揮著非特異性吞噬清除作用，介導(dǎo)固有免疫應(yīng)答［2］。將醫(yī)療器械植入人體后，會(huì)引發(fā)巨噬細(xì)胞在材料表面黏附聚集。此外，材料的浸出物、降解物會(huì)引起炎癥反應(yīng)，造成纖維組織增生，最終導(dǎo)致植入部位的損傷和器械的老化破裂。因此，評價(jià)醫(yī)療器械對巨噬細(xì)胞的細(xì)胞相容性和免疫相容性，是衡量醫(yī)療器械生物相容性的重要標(biāo)準(zhǔn)之一［3］。目前，對于醫(yī)療器械的免疫相容性評價(jià)，主要包括器械對免疫器官和免疫細(xì)胞的影響，外周白細(xì)胞的計(jì)數(shù)分類變化和對病原微生物的易感性等［3-4］。交聯(lián)PIB（x-polyisobutylene，xPIB）是基于PIB的新一代可植入性醫(yī)療器械，但其對巨噬細(xì)胞的細(xì)胞相容性和免疫相容性尚不明確。因此，本研究根據(jù)GB/T 16886.20-2015［5］和 GB/T 16886.5-2017［6］，主要圍繞xPIB浸提液對RAW264.7細(xì)胞的細(xì)胞相容性和免疫相容性進(jìn)行評價(jià)，探討其在未來臨床應(yīng)用中可能的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、材料、試劑和主要儀器

RAW264.7細(xì)胞（來源于Abelson嚙齒類白血病病毒誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞）購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，用DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2。疏水性丙烯酸酯（陰性對照）和xPIB材料由西安浦勒生物科技有限公司贈(zèng)予，將丙烯酸酯和xPIB材料經(jīng)環(huán)氧乙烷滅菌后，置培養(yǎng)皿中，加入完全培養(yǎng)基〔丙烯酸酯和xPIB為直徑22mm圓形薄片，浸提比（圓片表面積與浸提液體積比）為1250 cm2·L-1〕，37℃浸提24 h，取上清，用0.22 μm濾膜過濾，直接使用或存于4℃冰箱備用［5-6］。Trizol裂解液和DMEM購自美國賽默飛世爾科技公司；胎牛血清購自舜冉（上海）生物公司；一氧化氮（nitric oxide，NO）檢測試劑盒、中性紅染料、MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒、小鼠白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6、IL-12p70和腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；SYBR購自杭州沃森生物技術(shù)有限公司；苯酚購自常熟市鴻盛精細(xì)化工有限公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。Varioskan Flash酶標(biāo)儀和Nano-Drop 2000購自美國賽默飛世爾科技公司；CFX96 TouchTM熒光定量PCR檢測系統(tǒng)和BioRad CFX96 Touch PCR System均購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；5417型低溫離心機(jī)購自艾本德（中國）有限公司。

1.2 MTT法檢測細(xì)胞存活率

參考GB/T16886.5-2017［6］，采用苯酚作為評價(jià)醫(yī)療器械體外細(xì)胞相容性試驗(yàn)的陽性對照，分別用完全培養(yǎng)基、丙烯酸酯（100%浸提液，陰性對照）、苯酚（214 mg·L-1，陽性對照）及xPIB（25%，50%，75%和100%浸提液）處理RAW264.7細(xì)胞24，48，72，96和120 h，棄上清，加10%MTT，培養(yǎng)箱中孵育4 h，加DMSO溶解細(xì)胞，用酶標(biāo)儀在450 nm波長下檢測吸光度（A450nm）值［7］。細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組A450nm-細(xì)胞對照組A450nm）/（陰性對照組A450nm-細(xì)胞對照組A450nm）×100% 。

1.3 Griess法檢測細(xì)胞上清中NO水平

巨噬細(xì)胞受LPS刺激，可激活并分化為炎癥型巨噬細(xì)胞，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致組織損傷［8-9］。因此，本研究分別用完全培養(yǎng)基、丙烯酸酯（100%浸提液，陰性對照）、LPS（10 μg·L-1，陽性對照）和xPIB（100%浸提液）處理細(xì)胞24和48 h，每孔加細(xì)胞上清和標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，依次加入格里斯試劑Ⅰ50 μL和格里斯氏試劑Ⅱ50 μL，用酶標(biāo)儀在540 nm波長下檢測A540nm值［10］，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算實(shí)驗(yàn)組上清中NO濃度。

1.4 中性紅攝取實(shí)驗(yàn)檢測巨噬細(xì)胞吞噬能力

細(xì)胞分組和處理方法同1.3，每孔加中性紅活性染料 300 μL，培養(yǎng)箱中孵育 30 min，棄染料，用PBS洗滌2次，加醋酸醇裂解液裂解細(xì)胞，在4oC冰箱中過夜，用酶標(biāo)儀在540 nm波長下檢測A540nm值［11］。中性紅攝取指數(shù)＝（實(shí)驗(yàn)組A540nm-細(xì)胞對照組A540nm）/（陰性對照組A540nm-細(xì)胞對照組A540nm）。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測細(xì)胞因子mRNA水平

細(xì)胞分組和處理方法同1.3，Trizol法提取細(xì)胞RNA，用NanoDrop 2000檢測RNA濃度和A260nm/A280nm比值，將所有樣品的RNA調(diào)至500 mg·L-1。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行cDNA逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA產(chǎn)物。進(jìn)行RT-qPCR，反應(yīng)體系（共20 μL）為：DEPC水7 μL，SYBR GreenⅠ10 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA模板2 μL。用RT-qPCR儀收集熒光信號。實(shí)時(shí)熒光定量的程序?yàn)?5℃，2 min；40個(gè)循環(huán)收集熒光信號（95℃，10 s；60℃，30 s），擴(kuò)增完成后，建立熔解曲線（95oC，15 s；60℃，1 min；95℃，15 s），采用 2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因mRNA表達(dá)水平。引物（序列見表1）合成委托上海桑尼生物技術(shù)有限公司，內(nèi)參基因選擇GAPDH。

1.6 ELlSA法檢測細(xì)胞上清中的炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的水平

細(xì)胞分組和處理方法同1.3，吸取細(xì)胞上清，按試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測細(xì)胞上清中的IL-1β，IL-6，IL-12p70和TNF-α蛋白水平［12］。

1.7 觀察材料表面黏附細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)目

將已滅菌處理的丙烯酸酯和xPIB晶狀體圓片置12孔板中，將RAW264.7細(xì)胞分別與2種材料孵育24和48 h，用倒置相差顯微鏡，低倍鏡（10×10）下隨機(jī)選取20個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞平均數(shù)，并計(jì)算1 mm2材料表面黏附的細(xì)胞數(shù)目，判斷細(xì)胞黏附情況；并用LPS 10 μg·L-1刺激丙烯酸酯材料表面黏附的RAW264.7細(xì)胞24和48 h，作為巨噬細(xì)胞激活的陽性對照。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 xPlB浸提液對RAW264.7細(xì)胞存活率的影響

與細(xì)胞對照組相比，苯酚214 mg·L-1（陽性對照）處理RAW264.7細(xì)胞24～120 h后，細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.01，圖1）。用丙烯酸酯和4個(gè)濃度的xPIB浸提液分別處理RAW264.7細(xì)胞24～120 h，與細(xì)胞對照組相比，細(xì)胞存活率無顯著變化。

Fig.1 Effect of liquid extracts of x-polyisobutylene（xPlB）on cell survival rate of RAW264.7 cells.RAW264.7 cells were incubated with DMEM medium containing 10%FBS，acrylate（liquid extracts 100%），phenol 214 mg·L-1and xPIB（liquid extracts 25%，50%，75%and 100%）for 24-120 h，respectively.Cell survival rate was measured with MTT method.Cell survival rate（%）=（experimental group A450 nm-cell control group A450 nm）/（negative control A450 nm-cell control group A450 nm）×100%.±s，n=6.＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.2 xPlB浸提液對NO水平的影響

與細(xì)胞對照組相比，用 LPS 10 μg·L-1刺激RAW264.7細(xì)胞24和48 h后，細(xì)胞上清中NO水平顯著升高（P＜0.01，圖2），而用丙烯酸酯100%浸提液和xPIB100%浸提液刺激細(xì)胞24和48 h后，上清中NO水平無顯著變化。

Fig.2 Effect of liquid extracts of xPlB on concentration of nitric oxide（NO）in culture medium of RAW264.7 cells.RAW264.7 cells were treated with DMEM medium containing 10%FBS，acrylate（liquid extracts 100%），lipopolysaccharide（LPS）10 μg·L-1and xPIB（liquid extracts 100%）for 24 and 48 h，respectively.NO concentration in supernatant was measured by Griess assay.±s，n=6.＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.3 xPlB浸提液對RAW264.7細(xì)胞吞噬能力的影響

與細(xì)胞對照組相比，丙烯酸酯100%浸提液處理RAW264.7細(xì)胞24和48 h后，RAW264.7吞噬中性紅顆粒的能力無明顯變化；而用LPS 10 μg·L-1刺激細(xì)胞24和48 h后，吞噬能力顯著增強(qiáng)（P＜0.01，圖3）；用xPIB100%浸提液處理細(xì)胞24和48 h后，吞噬中性紅顆粒的能力無顯著變化。

Fig.3 Effect of liquid extracts of xPlB on phagocytic capacity of RAW264.7 cells.See Fig.2 for the cell treatment.Phagocytic capacity of RAW264.7 was measured by neutral red uptake test.Index=（experimental group A540 nm-cell control group A540 nm）/（negative control A540 nm-cell control group A540 nm）.±s，n=6.＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.4 xPlB浸提液對細(xì)胞因子、CD80、CD86和iNOS mRNA水平的影響

與細(xì)胞對照組相比，丙烯酸酯100%浸提液處理RAW264.7細(xì)胞24和48 h后，IL-1β，IL-6，IL-12b，TNF-α，CD80，CD86和iNOS的mRNA水平均無顯著差異。但用LPS 10 μg·L-1刺激細(xì)胞24和48 h后，上述7項(xiàng)指標(biāo)mRNA水平均顯著升高（P＜0.01，圖4）；用xPIB100%浸提液處理細(xì)胞24和48 h后，細(xì)胞因子的變化趨勢與丙烯酸酯相同。

2.5 xPlB浸提液對細(xì)胞因子水平的影響

與細(xì)胞對照組相比，用丙烯酸酯100%浸提液和xPIB 100%浸提液處理RAW264.7細(xì)胞24和48 h，細(xì)胞IL-1β，IL-6，IL-12p70和TNF-α水平均無顯著差異；用LPS 10 μg·L-1刺激24和48 h后，細(xì)胞上述4項(xiàng)指標(biāo)顯著升高（P＜0.01，圖5）。

Fig.5 Effect of liquid extracts of xPlB on protein levels of cytokines of RAW264.7 cells measured by ELlSA.See Fig.2 for the cell treatment.±s，n=6.＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.6 xPlB表面黏附的RAW264.7細(xì)胞數(shù)目和形態(tài)

Fig.4 Effect of liquid extracts of xPlB on mRNA levels of cytokines and surface markers in RAW264.7 cells measured by RT-qPCR.See Fig.2 for the cell treatment.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

將RAW264.7細(xì)胞與丙烯酸酯和xPIB共孵育24 h，發(fā)現(xiàn)丙烯酸酯表面的細(xì)胞數(shù)目是xPIB組的3.99倍（P＜0.01，圖6）；共孵育48 h，丙烯酸酯表面的細(xì)胞數(shù)目是xPIB組的2.47倍（P＜0.01，圖6）。

Fig.6 Number of RAW264.7 cells on surface of xPlB.RAW264.7 cells were inoculated on the surface of acrylate and xPIB for 24 and 48 h，respectively.The number of RAW264.7 cells in the area of 1 mm2was counted by phase contrast microscope.±s，n=20.＊＊P＜0.01，compared with acrylate group.

顯微鏡觀察細(xì)胞形貌（圖7），在丙烯酸酯表面的細(xì)胞呈圓形，表面光滑，很少出現(xiàn)偽足。用LPS 10 μg·L-1刺激丙烯酸酯表面RAW264.7細(xì)胞24和48 h，細(xì)胞變大，出現(xiàn)偽足，表面粗糙呈細(xì)顆粒狀，胞內(nèi)出現(xiàn)很多小空泡，處于M1活化狀態(tài)。在xPIB表面的細(xì)胞形貌和丙烯酸酯相同，細(xì)胞處于未活化的靜息狀態(tài)（M0）。

Fig.7 Effect of xPlB on RAW264.7 cell morphology（×100）.See Fig.6 for the cell treatment.RAW264.7 cell morphology was observed by phase contrast microscope.Arrows refer to the pseudopodium structure of RAW264.7 cells.

3 討論

醫(yī)療器械的免疫相容性評價(jià)已成為生物相容性評價(jià)的重要部分之一。已有文獻(xiàn)報(bào)道，牙科/骨科所用的合金材料可引起Ⅰ型超敏反應(yīng)，丙烯酸樹脂/丙烯酸鹽可誘發(fā)免疫損傷。此外，低分子有機(jī)物還會(huì)介導(dǎo)T細(xì)胞活化，發(fā)生Ⅳ型超敏反應(yīng)［13-15］，因此評估醫(yī)療器械和生物材料的免疫相容性對于材料的應(yīng)用十分重要。而xPIB作為新型人工晶狀體材料，其生物相容性，尤其是免疫相容性的研究尚不充分。另外，xPIB在進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)時(shí)，存在未交聯(lián)的單分子異丁烯，異丁烯具有弱細(xì)胞毒性和神經(jīng)毒性，影響人工晶狀體的生物相容性；而且在交聯(lián)反應(yīng)過程中，存在金屬離子如鎂離子、鋅離子的滲入。因此，本研究參考 GB/T 16886.20-2015［5］和GB/T 16886.5-2017［6］，采用可模擬體內(nèi)植入的浸提萃取法，檢測xPIB浸提液的細(xì)胞相容性和免疫相容性，并用LPS刺激丙烯酸酯表面的細(xì)胞作為植入-黏附實(shí)驗(yàn)的陽性對照，從而判斷xPIB晶狀體植入人眼后的影響。

本研究分別從功能性實(shí)驗(yàn)（包括免疫細(xì)胞、免疫器官活性以及免疫因子合成分泌等）和非功能性實(shí)驗(yàn)（包括免疫細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征和增殖黏附狀態(tài)等），綜合評價(jià)xPIB對巨噬細(xì)胞的細(xì)胞相溶性和免疫相容性。功能性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，xPIB浸提液未影響細(xì)胞存活率，對細(xì)胞中炎癥因子IL-1β，IL-6，IL-12p70，TNF-α，CD80，CD86和iNOS的表達(dá)亦無明顯影響，未影響巨噬細(xì)胞的吞噬能力，表明在植入器械后，巨噬細(xì)胞依然可發(fā)揮其殺傷或清除病原微生物的功能，降低術(shù)后感染的風(fēng)險(xiǎn)。非功能性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黏附在xPIB表面的RAW264.7細(xì)胞處于未激活的靜息狀態(tài)，呈圓形，無偽足結(jié)構(gòu)。因此推測，將xPIB植入動(dòng)物體內(nèi)，可能不會(huì)引起植入部位發(fā)生炎癥反應(yīng)，同時(shí)減少后囊膜渾濁的發(fā)生率［16］。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，相比于生物相容性優(yōu)越的疏水性丙烯酸酯，xPIB表面黏附的巨噬細(xì)胞數(shù)目顯著減少，處于未活化靜息狀態(tài)，表明xPIB植入人眼后，在晶狀體表面發(fā)生的細(xì)胞聚集、蛋白黏附、纖維增生及鈣化的可能性低于疏水性丙烯酸酯。上述結(jié)果提示，xPIB具有良好的細(xì)胞相溶和免疫相容性，比醫(yī)用丙烯酸酯可能有更廣泛的應(yīng)用前景。

與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)相比，體外細(xì)胞模型缺乏完整的免疫系統(tǒng)，僅能評價(jià)器械對單一細(xì)胞的免疫相容性，存在一定的局限性［17-18］。因此，大多數(shù)毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)需要將醫(yī)療器械材料植入嚙齒動(dòng)物的皮下組織，進(jìn)行相容性研究。但由于條件限制，本研究僅在細(xì)胞水平評價(jià)xPIB對巨噬細(xì)胞的細(xì)胞相溶和免疫相容性，僅提供參考。