大鼠腎衰模型造模方法及比較研究進(jìn)展

李佳璐，劉俊亭，袁慧雅*

(1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院，沈陽(yáng) 110122； 2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，沈陽(yáng) 110122)

我國(guó)是腎病大國(guó)，腎病已經(jīng)逐漸成為人類健康的新殺手，其發(fā)病率、患病率逐年升高。根據(jù)病情進(jìn)展速度，腎衰可分為急性腎衰(acute renal failure, ARF)和慢性腎衰(chronic renal failure,CRF)兩種。急性腎衰，是以患者腎功能在數(shù)小時(shí)至幾天之內(nèi)發(fā)生急劇變化，導(dǎo)致腎排出氮質(zhì)代謝廢物的能力及維持體內(nèi)水、電解質(zhì)穩(wěn)定功能的喪失為特征的急性腎臟病變。慢性腎衰，主要表現(xiàn)為長(zhǎng)時(shí)間，進(jìn)行性的腎單位損傷，繼而引發(fā)腎排泄功能發(fā)生障礙，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)環(huán)境改變出現(xiàn)氮質(zhì)代謝物潴留，最終使機(jī)體代謝異常。根據(jù)美國(guó)的K/DOQI指南(Kidney Disease Outcome Quality Initiative 腎臟病預(yù)后質(zhì)量指南)指出：CRF的4期，人群的發(fā)病率分別為3.0%、4.3%、0.2%、0.1%[1]。

研究腎病的發(fā)病機(jī)制，開發(fā)出安全有效的藥物一直是臨床腎病領(lǐng)域中重要的課題。藥物的臨床前的研究主要以受試藥物的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)形式出現(xiàn)，即建立動(dòng)物模型，然后進(jìn)行發(fā)病機(jī)理或干預(yù)(藥學(xué))試驗(yàn)研究。多年來，腎病研究者以大鼠作為研究對(duì)象，逐步開發(fā)出若干典型的適用于不同腎病種類研究需求的動(dòng)物模型，現(xiàn)總結(jié)如下。

1 慢性腎功能衰竭

臨床上，根據(jù)病史，腎功能檢查以及相關(guān)臨床表現(xiàn)等可以診斷慢性腎衰。目前國(guó)際公認(rèn)的分期是依據(jù)腎臟病預(yù)后質(zhì)量倡議(K/DOQI)所制定的，共分為5期。根據(jù)慢性腎衰竭的病程進(jìn)展，可分為：腎功能代償期，腎功能失代償期，腎功能衰竭期和尿毒癥期。慢性腎衰竭的發(fā)病機(jī)制，目前認(rèn)為有以下幾個(gè)原因：(1)腎單位高灌注，高濾過；(2)腎單位高代謝；(3)腎組織上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的作用；(4)細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子促纖維化的作用；(5)其他。通過模擬臨床上的常見發(fā)病機(jī)制，可以制備出符合臨床需要的大鼠腎衰實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

1.1 大鼠CRF常用造模方法簡(jiǎn)述

建立符合科研設(shè)計(jì)需求的CRF動(dòng)物模型，對(duì)研究的開展具有重要的意義。大鼠CRF常用造模方法可分為物理法和化學(xué)法。在造模與后續(xù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程中，操作者應(yīng)嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的“3R”原則，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給予人道的關(guān)懷。

1.1.1 物理法

(1)大鼠腎大部分切除法(約5/6)：成年雄性 SD 大鼠，結(jié)扎左側(cè)腎上下級(jí)腎組織各約 1/3, 復(fù)位腎, 縫合。一周后同樣方式切除整個(gè)右腎, 兩次手術(shù)共切除5/6的 腎[2]。進(jìn)而測(cè)定腎大部切除后大鼠尾靜脈血的尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血肌酐(serum creatinine，Scr)的值。

(2)腎動(dòng)脈分支的部分結(jié)扎方法：成年雄性SD大鼠。在手術(shù)顯微鏡下分離腎動(dòng)脈，保留左腎數(shù)支動(dòng)脈中的一支，結(jié)扎左腎其余動(dòng)脈分支，造成相當(dāng)于2/3腎梗死，一周后切除右腎[3]。隨后測(cè)定大鼠尾靜脈血的BUN、Scr的值。

(3)冷凍加切除法：成年雄性SD大鼠。作背左側(cè)切開，分離暴露左腎。預(yù)先浸入液氮瓶的冷刀一次在動(dòng)物左腎上下極及外側(cè)前后四個(gè)部位冷凍，每次冷凍40 s后復(fù)位腎。2周后行二期手術(shù)，切除右腎。待模型穩(wěn)定后，行血液生化測(cè)定[4]。

1.1.2 化學(xué)法

(1)腺嘌呤模型：雄性SD大鼠，以腺嘌呤250 mg/(kg.d)灌胃，每周收集24 h尿液，每2周尾靜脈取血進(jìn)行生化測(cè)定[5]。

(2)阿霉素模型：SD雄性大鼠，一次性陰莖內(nèi)靜脈注射阿霉素6.0 mg/kg，自由攝食飲水，收集24 h尿液[6]。

1.2 大鼠CRF常用造模方法比較

根據(jù)動(dòng)物模型的病理學(xué)特點(diǎn)，評(píng)價(jià)各模型的優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)。同時(shí)對(duì)各模型的應(yīng)用進(jìn)行分析與比較，列出各個(gè)模型所適合的科研領(lǐng)域，期待可以為進(jìn)一步的研究提供一定的參考。

1.2.1 物理法

(1)大鼠腎大部分切除法

模型評(píng)價(jià)：本模型以腎小球肥大，硬化為主要特點(diǎn)，符合腎小球高度濾過致腎衰學(xué)說。優(yōu)點(diǎn)是有較好的實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性，可避免壞死的腎組織保留在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)；可通過改變腎切除的量對(duì)發(fā)生腎衰的時(shí)間進(jìn)行控制，滿足不同實(shí)驗(yàn)的需要。缺點(diǎn)是需兩期手術(shù)，模型制備時(shí)間長(zhǎng)，易出血，誘發(fā)動(dòng)物死亡。

科研應(yīng)用：可用于臨床上CRF治療相關(guān)藥物的研究。(例如，減輕腎組織灌注以及腎高濾過，抑制系膜細(xì)胞增殖，抗氧化作用，降壓等方面的藥物的研究)。中醫(yī)研究方面，通過觀察黑地黃丸對(duì)5/6腎切除CRF大鼠腎功能影響,探討黑地黃丸改善CRF大鼠腎功能的最佳用藥劑量[7]?；虮磉_(dá)方面，報(bào)道了SD大鼠腎衰竭模型BMP-7和TGF-β_1表達(dá)水平分析及藥物干預(yù)效應(yīng)研究[8]。Heiss等對(duì)慢性腎病大鼠骨骼肌缺血的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)遲鈍等問題進(jìn)行了深入研究，為破解相關(guān)致病基因?qū)ふ倚碌姆较騕9]。

(2)腎動(dòng)脈分支的部分結(jié)扎方法

模型評(píng)價(jià)：本方法復(fù)制的模型與大鼠腎大部切除術(shù)相似。優(yōu)點(diǎn)是可明顯地改善手術(shù)的出血情況。缺點(diǎn)是對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器和實(shí)驗(yàn)技術(shù)的要求較高，步驟復(fù)雜。術(shù)后，動(dòng)物模型高血壓顯著，腎病理?yè)p傷嚴(yán)重。采用率不如大鼠腎大部切除術(shù)高。

科研應(yīng)用：適用于藥物治療不同程度CRF時(shí)，藥物劑量，療效的評(píng)價(jià)與基因表達(dá)的研究。如，應(yīng)用于研究PPARγ、NF-κB、TNF-α在慢性缺血性腎病大鼠模型中的表達(dá)及意義[10]。也應(yīng)用于MG-132對(duì)慢性腎衰大鼠治療作用[11]和慢性腎衰竭大鼠主動(dòng)脈NF-κB的表達(dá)變化的一系列初步研究[12]。

(3)冷凍加切除法

模型評(píng)價(jià)：本模型的病理組織改變?yōu)槟I小球肥大，玻璃樣變性及硬化，系膜基質(zhì)增生肥厚。優(yōu)點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便，無出血風(fēng)險(xiǎn)，彌補(bǔ)了腎大部切除法的不足。缺點(diǎn)是對(duì)設(shè)備要求高，難以實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)化。

科研應(yīng)用：適用于臨床上對(duì)CRF藥物治療以及篩選方面的研究。但由于設(shè)備的限制，應(yīng)用較少，且冷凍法多用于腎臟腫瘤的治療?？蓱?yīng)用此模型研究苯那普利、氯沙坦在冷凍致慢性腎衰模型的療效比較[13]。

1.2.2 化學(xué)法

(1)腺嘌呤模型

模型評(píng)價(jià)：本模型的病理組織改變以腎小管破壞為主要特征，小管上皮細(xì)胞水腫，壞死，并伴發(fā)梗阻，導(dǎo)致腎單位大量喪失?？勺鳛檠芯磕I功能衰竭以及腎纖維化的良好模型。本模型制作方法簡(jiǎn)單，造模周期短，實(shí)驗(yàn)可控性強(qiáng)。

科研應(yīng)用：可用于評(píng)價(jià)腎小管功能恢復(fù)藥物的療效。中醫(yī)方面，研究發(fā)現(xiàn)真五湯(ZWT)提取物對(duì)腺嘌呤所致大鼠慢性腎功能衰竭的改善作用[14]。應(yīng)用此模型考察扶正泄?jié)犸媽?duì)腺嘌呤致大鼠慢性腎衰竭腎功能影響[15]。基因表達(dá)方面，用于研究蟲草多糖對(duì)腺嘌呤誘導(dǎo)的慢性腎衰模型大鼠TGF-β1、MCP-1及mRNA表達(dá)的影響[16]。

(2)阿霉素模型

模型評(píng)價(jià)：阿霉素可損害腎近曲小管上皮細(xì)胞，使其脫離，并與管腔內(nèi)的蛋白質(zhì)和其他細(xì)胞成分融合成管型，堵塞管腔，使腎內(nèi)壓增高，產(chǎn)生損傷。

優(yōu)點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)便易行，可操作性高。

科研應(yīng)用：此類模型對(duì)于篩選擴(kuò)張腎小管，降低腎小管壓力，改善蛋白尿等方面的藥物療效具有重要的指導(dǎo)作用。可用于研究有關(guān)骨髓間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞(MSCs)與氯沙坦對(duì)于阿霉素型腎病模型的治療效果的相關(guān)研究療效[17]。

2 急性腎衰模型

急性腎衰ARF是由各種病因引起的腎功能快速下降而出現(xiàn)的臨床綜合征。根據(jù)病因發(fā)生的解剖部位可以分為：腎前性，腎性，腎后性。腎前性ARF指因各種原因引起腎實(shí)質(zhì)血流灌注減少，導(dǎo)致GFR降低和腎小球?yàn)V過減少，約占ARF的55%。腎性ARF指出現(xiàn)腎實(shí)質(zhì)損傷，以腎缺血和腎毒性藥物或毒素導(dǎo)致的急性腎小管壞死(ATN)最為常見，其他還包括急性間質(zhì)性腎炎(AIN)，腎小球疾病和腎血管疾病等，約占ARF的40%。腎后性ARF系尿路感染所致，梗阻可發(fā)生在從腎盂到尿道的尿路中任何部位，約占ARF的5%。在過去的半個(gè)世紀(jì)中急性腎功能衰竭被認(rèn)為是由腎缺血引起的血液動(dòng)力學(xué)疾病，而這一觀點(diǎn)的建立正是源于動(dòng)物模型的發(fā)現(xiàn)[18]。

2.1 ARF常用造模方法簡(jiǎn)述

近年來，通過臨床上對(duì)不同ARF患者的追蹤研究，ARF的病因謎團(tuán)被不斷地揭開，也推動(dòng)了多種大鼠急性腎衰模型方法的建立。

2.1.1 物理法

(1)一側(cè)腎缺血/再灌注加對(duì)側(cè)腎切除：雄性SD大鼠，切除右腎。同時(shí)阻斷左側(cè)腎動(dòng)脈45 min,再灌注24 h，建立大鼠缺血性急性腎衰竭的動(dòng)物模型。測(cè)定各組大鼠腎組織和血漿SOD活性、MDA含量及腎組織中NO的含量[19]。

(2)部分結(jié)扎腹主動(dòng)脈模型：雄性SD大鼠，摘除右腎，左輸尿管內(nèi)插入PE-10導(dǎo)管，部分結(jié)扎腹主動(dòng)脈,60 min后解除結(jié)扎線，按實(shí)驗(yàn)預(yù)訂時(shí)間分別采血作血液生化測(cè)定[20]。

2.1.2 化學(xué)法

(1)甘油型：SD雄性大鼠，禁水24 h，給予50%甘油生理鹽水10 mg/kg。雙后肢注射，構(gòu)建模型，定時(shí)采血，進(jìn)行尿素氮的測(cè)定[21]。

(2)油酸型：選用Wistar雄鼠，通過左腎動(dòng)脈注射油酸(0.15 mL/kg)，定時(shí)采血作生化測(cè)定[22]。

(3)氯化汞型：選用成年大鼠，一次性腹腔注射順鉑，采血測(cè)定血液生化指標(biāo)[23]。

(4)氨基糖苷類型：選用Wistar雄鼠，腹腔注射慶大霉素140 mg/kg(也可選用卡那霉素),連續(xù)注射7 d。建立慶大霉素模型[24]。

(5)蛇毒誘導(dǎo)：成年雄性SD大鼠，在大鼠的尾部消毒后,從尾靜脈注射五步蛇毒，根據(jù)體質(zhì)量計(jì)算出注射劑量,采血作血液生化測(cè)定[25]。

(6)氟化鈉誘導(dǎo)：成年大鼠，經(jīng)口按135 mg/kg體重的劑量一次性灌服氟化鈉，作相關(guān)尿液生化指標(biāo)測(cè)定[26]。

(7)順鉑誘導(dǎo)：陳小波等[27]報(bào)道雄性SD大鼠戊巴比妥鈉麻醉，以順鉑(CP)6 mg/kg單次尾靜脈注射，從而制備腎毒性 ARF動(dòng)物模型。

2.2 大鼠ARF常用造模方法對(duì)比

同樣地按上述方法，對(duì)大鼠ARF模型也進(jìn)行相應(yīng)的比較分析。

2.2.1 物理法

(1)一側(cè)腎缺血/再灌注加對(duì)側(cè)腎切除

模型評(píng)價(jià)：本模型采用外科手術(shù)的方法使模型動(dòng)物腎血供受阻，引發(fā)腎功能損傷，細(xì)胞缺血缺氧，最終造成腎小管上皮細(xì)胞損傷,誘發(fā)急性腎衰。結(jié)果導(dǎo)致模型大鼠腎組織中SOD 含量下降，MDA含量顯著上升。

科研應(yīng)用：該模型常用于研究臨床上ARF的發(fā)病機(jī)制以及氧自由基清除劑對(duì)ARF防治作用方面的探究。應(yīng)用本模型，通過使用對(duì)比增強(qiáng)超聲，來評(píng)估急性腎充血大鼠模型中的腎灌注損傷[28]。孫倩倩應(yīng)用次模型探究了EPO后處理抗大鼠腎缺血再灌注損傷作用及機(jī)制研究[29]。

(2)部分結(jié)扎腹主動(dòng)脈模型

模型評(píng)價(jià)：本模型屬于持續(xù)低灌注型ARF。鏡下切片組織處，觀察到腎小管上皮細(xì)胞彌漫性腫脹，有少量腎小管小灶性壞死，管腔內(nèi)可見管型，腎間質(zhì)明顯水腫。缺點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)操作較復(fù)雜，術(shù)中易出血。

科研應(yīng)用：本方法建立的低灌注ARF模型與臨床患者的實(shí)際情況更為相似，可以用于聯(lián)合多臟器，研究多臟器共同影響病情的作用機(jī)制。王建萍應(yīng)用此模型研究了奧美沙坦對(duì)腹主動(dòng)脈結(jié)扎左心室肥厚大鼠腎的保護(hù)作用[30]。

2.2.2 化學(xué)法

(1)甘油型

模型評(píng)價(jià)：甘油具有高滲性，會(huì)導(dǎo)致局部肌肉的變性壞死，引起血管內(nèi)溶血，誘導(dǎo)腎血管收縮，導(dǎo)致腎血流量和腎小球?yàn)V過率二者都下降，引起腎小管的損傷。該模型經(jīng)濟(jì)成本低，方法簡(jiǎn)單，病變較穩(wěn)定，可進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察。

科研應(yīng)用：本模型具有腎缺血和內(nèi)源性毒性物質(zhì)兩種有害物質(zhì)可對(duì)腎造成雙重的損傷。Nagano等[31]對(duì)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)對(duì)甘油誘導(dǎo)的急性腎功能衰竭的預(yù)防進(jìn)行了詳細(xì)的研究。應(yīng)用此模型也研究了腎衰合劑防治大鼠急性腎衰竭的實(shí)驗(yàn)研究[32]。

(2)油酸型

模型評(píng)價(jià)：注射油酸致大鼠腎上皮細(xì)胞發(fā)生腫脹、壞死，間質(zhì)水腫，模型動(dòng)物的血BUN顯著升高，引發(fā)腎內(nèi)血管缺血以及嚴(yán)重的微循環(huán)障礙，使得腎排泄功能衰竭。該實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)便易行。

科研應(yīng)用：此模型模擬的是人類起源于腎微循環(huán)障礙的缺血性ARF方面的研究，有助于更深一步了解急性腎衰發(fā)病時(shí)腎微循環(huán)的變化。吳廣禮等運(yùn)用該種模型對(duì)“樟柳堿，東莨菪堿，山莨菪堿”這三種莨菪藥物對(duì)腎衰的保護(hù)作用進(jìn)行了研究[33]。

(3)氯化汞型

模型評(píng)價(jià)：注射氯化汞后，腎血流量下降，SCr水平升高，BUN水平升高，肌肝清除率降低，肌肝，尿素氮總排出量顯著減少。低劑量汞中毒時(shí)，表現(xiàn)為腎近曲小管直部上皮細(xì)胞的壞死，而大劑量汞中毒時(shí)，近曲小管其他節(jié)段也可發(fā)生壞死。本模型制備方法簡(jiǎn)單，病變較為穩(wěn)定。

科研應(yīng)用：可用于研究由于重金屬Hg中毒時(shí)引起的腎損傷。劉翔等,應(yīng)用此模型研究了骨髓間質(zhì)干細(xì)胞對(duì)大鼠急性腎小管損傷修復(fù)的促進(jìn)作用，觀察了骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)對(duì)氯化汞(HgCl2)導(dǎo)致的急性腎小管損傷有無治療作用，并探討了其可能的機(jī)制[34]。

(4)氨基糖苷類型

模型評(píng)價(jià)：藥物蓄積在腎小管處，導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞的功能發(fā)生紊亂以損傷腎小管。模型動(dòng)物尿中NAG酶及溶菌酶的排泄，明顯增多，血尿素氮和尿蛋白含量增多，發(fā)生急性腎小管壞死。實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單易行，且腎近曲小管上皮細(xì)胞的損傷可隨用藥時(shí)間而加重。

科研應(yīng)用：可用于臨床上氨基糖苷類抗生素致ARF的藥物防治方面相關(guān)的研究。應(yīng)用本模型探討急性腎衰大鼠腎組織中長(zhǎng)鏈非編碼RNA linc00152的表達(dá)情況及其對(duì)急性腎衰的影響[35]。也可研究中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)和腎損傷分子(KIM-1)在慶大霉素誘導(dǎo)的急性中毒性腎衰竭模型中的表達(dá)，探討其對(duì)急性腎損傷早期診斷的應(yīng)用價(jià)值[36]。

(5)蛇毒誘導(dǎo)

模型評(píng)價(jià)：靜注毒液后，可造成模型動(dòng)物肌肉的直接損傷，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)大量血紅蛋白尿，使得腎小管發(fā)生阻塞，同時(shí)蛇毒又可激活機(jī)體內(nèi)的X因子和凝血酶，溶解破壞紅細(xì)胞，致血栓形成，從而導(dǎo)致腎的微循環(huán)被破壞。模型簡(jiǎn)便易行，對(duì)于蛇毒中毒的研究有很大意義。

科研應(yīng)用：可利用本模型研究高壓氧輔助抗蛇毒血清治療對(duì)五步蛇中毒大鼠腎保護(hù)作用[37-38]。進(jìn)一步探究蛇毒中毒所致的一系列腎損傷。

(6)氟化鈉誘導(dǎo)

模型評(píng)價(jià)：造模方法簡(jiǎn)單，氟化物對(duì)腎組織的損害程度為α-GST可表現(xiàn)出強(qiáng)烈而持久的改變，而該指標(biāo)對(duì)于臨床上人體氟化物中毒引起的腎近曲小管損傷的早期檢測(cè)和長(zhǎng)期觀察具有重要意義。

科研應(yīng)用：模型有助于制定用于治療人氟中毒致腎衰竭的指導(dǎo)方針，用于模擬臨床上的氟中毒患者。萬曉軍應(yīng)用此模型研究了TGF-β1和AQP2在氟中毒大鼠的表達(dá)及意義[39]。 也可通過本模型研究不同劑量氟對(duì)大鼠骨代謝及肝、腦、腎損傷的影響[40]。

(7)順鉑誘導(dǎo)

模型評(píng)價(jià)：順鉑(CP)在臨床應(yīng)用中對(duì)人體存在一定的毒性，尤其是對(duì)腎具有較大的毒性。鏡下可見腎髓質(zhì)外側(cè)大部分腎小管壞死，小管上皮細(xì)胞壞死，脫落，細(xì)胞核故所，溶解，消失，小管管腔擴(kuò)張，腔內(nèi)有脫落碎屑。優(yōu)點(diǎn)是模型制作方法簡(jiǎn)便，可行性高。

科研應(yīng)用：可用于探索順鉑類藥物的作用機(jī)制，藥物代謝，研究相關(guān)防治措施。Menon等研究發(fā)現(xiàn)兩種阿育吠陀制劑，來緩解順鉑誘發(fā)的急性腎衰竭[41]。也可用于研究促紅素預(yù)防順鉑所致的大鼠急性腎功能衰竭的腎保護(hù)作用[42]。

3 總結(jié)與展望

在疾病的模型研究中，不同模型可以用于滿足不同的研究需求。在實(shí)驗(yàn)初期階段，應(yīng)明確研究目的，結(jié)合適用性和實(shí)用性選取更適合的模型來達(dá)到更好的效果，本文對(duì)模型的選取提供了一定的指導(dǎo)。我國(guó)作為腎病大國(guó)，以動(dòng)物實(shí)驗(yàn)為基石，研究不同類型腎病的發(fā)生機(jī)制，不僅為腎病藥物的研發(fā)和治療方法的開創(chuàng)奠定了基礎(chǔ)，也為未來攻克腎病難題點(diǎn)亮了一盞希望之燈。相信在未來的工作中，一定會(huì)研究出更適合的腎衰模型。