復(fù)方苦參注射液質(zhì)量控制方法研究進(jìn)展

1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥制藥工程學(xué)院，天津 300193； 2.浙江大學(xué)藥物信息學(xué)研究所，浙江 杭州 310058； 3.山西振東制藥股份有限公司，山西 長治 047100

復(fù)方苦參注射液(Compound Kushen Injection, CKI)是由苦參、白土苓兩味藥材經(jīng)滲漉、煎煮、醇沉等一系列精制工藝而制成的中藥注射劑，收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)[1]。CKI具有清熱利濕、涼血解毒、散結(jié)止痛之功效[2]。常用的質(zhì)量分析方法包括薄層掃描法、高效液相色譜法和毛細(xì)管電泳法等，檢測指標(biāo)多為苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿、槐定堿和氧化槐果堿等生物堿類化合物，主要來源于苦參藥材，另有來源于白土苓的大澤米苷，報(bào)道較少。本文對文獻(xiàn)報(bào)道的CKI質(zhì)量控制技術(shù)進(jìn)行調(diào)研，分析各方法的優(yōu)勢與不足，以期為建立該品種更為完善的質(zhì)量控制體系提供參考。

1 復(fù)方苦參注射液質(zhì)量控制方法

1.1 酸堿滴定法 酸堿滴定法是利用酸堿反應(yīng)并通過滴定操作測定物質(zhì)含量的一種分析方法，是一種經(jīng)典含量測定技術(shù)，但由于某些物質(zhì)溶解度較差，在水中進(jìn)行酸堿滴定受到一定限制，常需要采用各種非水溶劑作為介質(zhì)進(jìn)行滴定[3]。CKI的部頒標(biāo)準(zhǔn)采用酸堿滴定法測定苦參總堿的含量。步驟如下：精密吸取本品0.5 mL，置于100 mL具塞錐形瓶中，置水浴上蒸干后，加濃氨試液0.35 mL使溶解，然后加氯仿20 mL，密塞，搖勻，室溫放置過夜，置水浴上蒸干，殘?jiān)又行砸掖?對甲基紅指示劑顯中性)5 mL使溶解，蒸干，殘?jiān)右颐? mL使溶解。精密加硫酸滴定液(0.01 mol·L-1)10 mL，搖勻，置水浴上加熱使殘?jiān)耆芙獠⒊M乙醚，放冷。加新沸過的冷水20 mL與甲基紅指示劑2滴，用氫氧化鈉滴定液(0.02 mol·L-1)滴定至橙黃色，結(jié)束滴定。每1 mL的硫酸滴定液(0.01 mol·L-1)相當(dāng)于4.976 mg的苦參堿(C16H24N2O)[4]。這種方法測定苦參總堿的含量，可彌補(bǔ)單個(gè)生物堿含量測定的不足，但是操作煩瑣、專屬性差、成本高、時(shí)間長，對操作人員的技術(shù)要求也較高，限制了該方法的廣泛應(yīng)用。

1.2 薄層色譜法 薄層色譜法系將適宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或鋁基片上，形成均勻薄層。待點(diǎn)樣、展開后，根據(jù)比移值與適宜的對照物按同法所得的色譜圖的比移值作對比，用以進(jìn)行藥品的鑒別、雜質(zhì)檢查或含量測定的方法。宋茹等[5]采用用薄層掃描法對CKI中苦參堿進(jìn)行了含量測定，以甲苯-丙酮-乙醇-氨水(10∶10∶1∶0.1)為展開劑，在CS -9000 飛點(diǎn)薄層掃描儀上以反射式鋸齒掃描方式(λ=515 nm)進(jìn)行測定，結(jié)果表明：樣品含量在2.16～7.56 μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，決定系數(shù)為0.9992，平均回收率達(dá)到99.0 %，RSD為0.61%(n=6)。該法簡便快速、重現(xiàn)性滿意，但是需要專用設(shè)備，耗時(shí)也較長，不適合大量樣本的采集和分析。

1.3 氣相色譜法(GC) GC的分析原理是使混合物各組分在固定相和流動(dòng)相之間進(jìn)行分配，當(dāng)流動(dòng)相中所含的物質(zhì)經(jīng)過固定相時(shí)，就會(huì)與固定相發(fā)生相互作用。由于各組分性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的不同，相互作用的大小、強(qiáng)弱有差異，因此在同一推動(dòng)力作用下，不同組分在固定相中滯留時(shí)間有一定差別，從而按移動(dòng)速度大小次序依次從固定相中流出。

江林等[6]建立了填充柱氣相色譜測定苦參及其制劑中的苦參堿類生物堿的方法。該方法采用1 m長的OV-17色譜填充柱，檢測器及汽化室溫度設(shè)為320 ℃，升溫方式為150 ℃→250 ℃(250 ℃，保持3 min)、250 ℃→300 ℃(300 ℃，保持2 min)、升溫速度均為20 ℃·min-1的實(shí)驗(yàn)條件。該方法對由數(shù)種中草藥(含苦參)組成的醇提取液有滿意的精密度(RSD=1.9%,n=11)及回收率(98.3 %)。通過對苦參堿、氧化苦參堿的填充柱色譜行為與毛細(xì)管柱色譜-質(zhì)譜行為對比，得知填充柱色譜峰為苦參總堿。該方法可應(yīng)用于各種苦參制劑中苦參總堿含量的直接測定以及原藥采集和生產(chǎn)過程中的質(zhì)量監(jiān)測，在當(dāng)時(shí)被某生產(chǎn)以苦參為主要制劑成分的企業(yè)所采用并編入企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，成為其原料采集、生產(chǎn)監(jiān)控和成品檢驗(yàn)的主要手段，取得了當(dāng)?shù)丶夹g(shù)監(jiān)督部門的認(rèn)可。該技術(shù)測定的仍是苦參總堿的含量，不能分別測定各種單體生物堿的含量，而且由于苦參生物堿類化合物揮發(fā)性并不理想，未必適合進(jìn)行GC測定。

1.4 毛細(xì)管電泳法(CE) CE技術(shù)兼有電泳和色譜技術(shù)的雙重優(yōu)點(diǎn)，該技術(shù)以毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動(dòng)力，以樣品的多種特性(電荷大小、等電點(diǎn)、極性、親和行為、各組分之間淌度、相分配特性等)為依據(jù)的液相分離分析技術(shù)。饒毅等[7]采用CE法測定了CKI中苦參堿、氧化苦參堿、槐定堿的含量。采用未涂層石英毛細(xì)管(57 cm×50 μm i.d.)作為分離通道，分離電壓為12.5 kV，緩沖體系為：0.2 mol·L-1Tris-40 mmol /L磷酸二氫鈉(pH 5.50)-20%異丙醇，檢測波長設(shè)為200 nm，以氫溴酸東莨菪堿為內(nèi)標(biāo)，緩沖液中添加有機(jī)改性劑可以顯著改善分離。CE已日益廣泛地應(yīng)用于中藥化學(xué)成分的分離和含量測定，該法簡便快速，有較好的重現(xiàn)性，而且分析成本較低，并可減少有毒試劑(包括流動(dòng)相)的使用，可作為許多中藥有效成分的分離和質(zhì)量控制方法。

1.5 高效液相色譜法(HPLC) HPLC法作為一種高效、快速的分離、分析技術(shù)，以其靈敏度高、選擇性好，可分析微量組成甚至痕量樣品等特點(diǎn)，成為醫(yī)藥分析領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛的現(xiàn)代分析技術(shù)之一。王智民等[8]建立了同時(shí)測定CKI中苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿的含量的HPLC方法，所用色譜柱為Alltimaamino色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)、流動(dòng)相為乙腈-3%磷酸溶液-無水乙醇(80∶10∶10)、流速為1.0 mL·min-1、柱溫為30 ℃、檢測波長為220 nm，方法回收率：苦參堿為99.5%(RSD=1.58%)，槐定堿為99.2%(RSD=1.44%)，氧化苦參堿為100.2%(RSD=1.85%)。研究過程中曾嘗試嘗試將注射劑直接稀釋進(jìn)樣，但發(fā)現(xiàn)樣品溶液在上述色譜條件下雜質(zhì)干擾較強(qiáng)，3種生物堿無法得到基線分離。故采用濃氨水將注射劑調(diào)為堿性，使生物堿游離出來后，用氯仿少量多次萃取，揮干氯仿，無水乙醇稀釋進(jìn)樣，苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿均能得到良好分離。

反相離子對色譜法是把離子對試劑加入到含水流動(dòng)相中，被分析的組分離子在流動(dòng)相中與離子對試劑的反離子生成不帶電荷的中性離子，從而增加溶質(zhì)與非極性固定相的作用，使分配系數(shù)增加，改善分離效果。反相離子對色譜法無需衍生或使用特殊色譜柱，具有反相色譜法操作簡便和分離柱效高等固有優(yōu)點(diǎn)。張蕾等[9]建立了同時(shí)測定CKI中氧化苦參堿和苦參堿含量的方法，方法采用離子對RP-HPLC法，實(shí)驗(yàn)條件為Hypersil ODS2色譜柱(200 mm×4.6 mm, 5 μm)、流動(dòng)相為甲醇-乙腈-水-磷酸(10∶ 30∶65∶0.05)，含33m mol·L-1的SDS)、流速為1.0 mL·min-1、檢測波長設(shè)為210 nm、柱溫為室溫。實(shí)驗(yàn)考察了酸度和離子對試劑種類對組分色譜行為的影響，結(jié)果表明，庚烷磺酸鈉的分離效果較好，但該試劑價(jià)格昂貴，因而選用了價(jià)格相對較低的十二烷基硫酸鈉，結(jié)果顯示氧化苦參堿、苦參堿分別在17.44～174 .4 μg· mL-1(r=0 .9996,n=6)和1.96～39.20 μg· mL-1(r=0 .9997,n=6)范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，平均回收率分別為100.4%(RSD=2.1 %,n=9)和99 .7 %(RSD=1.4 %,n=9)。陳晨等[10]建立反相離子對色譜同時(shí)測定CKI中苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿和氧化苦參堿含量的方法，該方法采用Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm, 5.0 μm)色譜柱、流動(dòng)相為0.04%磷酸-10 mol·L-1戊烷磺酸鈉水溶液和乙腈、線性梯度洗脫、流速為1.2 mL·min-1、柱溫30℃、檢測波長 210 nm的實(shí)驗(yàn)條件，實(shí)驗(yàn)分別嘗試了在流動(dòng)相中加醋酸、氨水、三乙胺、磷酸鹽、十二烷基磺酸鈉、戊烷磺酸鈉等添加劑，結(jié)果十二烷基磺酸鈉和戊烷磺酸鈉離子對試劑均能明顯改善4個(gè)生物堿峰的峰形，而戊烷磺酸鈉能使4個(gè)生物堿實(shí)現(xiàn)良好分離，最終選擇以戊烷磺酸鈉離子對試劑為添加劑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿和氧化苦參堿質(zhì)量濃度分別在18.92～946.0 mg·L-1，4.052～202.6 mg·L-1，9.293～464.6 mg·L-1，34.73～1736 mg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均為0.9999；重復(fù)性試驗(yàn)中4個(gè)生物堿的RSD均小于2.1%；平均加樣回收率分別達(dá)到98.2%，96.4%，96.9%，97.1%。

HPLC方法為CKI質(zhì)量控制的經(jīng)典方法，該方法可將各種生物堿進(jìn)行有效分離后進(jìn)行準(zhǔn)確測定，一般也作為標(biāo)準(zhǔn)方法使用。但生物堿類化合物在樣品中以分子態(tài)和離子態(tài)兩種形式共存，必須通過嚴(yán)格控制pH值或加入對離子的方式，維持其分子態(tài)，從而可在色譜柱上保留，因此測定過程較為復(fù)雜，分析工作效率不夠理想。

1.6 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS) HPLC-MS是以液相色譜作為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜為檢測系統(tǒng)的一種分析技術(shù)，它集HPLC的高分離能力和MS的高靈敏度、高選擇性于一體，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)液相檢測器的不足，尤其適用于在紫外區(qū)域無特征吸收，或含量較低的化合物的分析測定。劉倩等[11]建立了含苦參的復(fù)方制劑HPLC-MS鑒定方法。其中，液相色譜采用梯度洗脫，質(zhì)譜用正離子模式檢測。主要的實(shí)驗(yàn)條件如下：色譜柱：Hypersil BDS(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：A：0.1氨水，B：甲醇；梯度洗脫：0 min：A：B(80∶20)，30 min：A：B(80∶20)，50 min：A：B(40∶60)，流速設(shè)為0.5 mL·min-1，共從CKI中分離鑒定了11種化學(xué)成分，其中苦參堿、氧化苦參堿、槐定堿、氧化槐果堿均為苦參堿型生物堿，此外尚有金雀花堿型、無葉豆堿型、羽扇豆堿型生物堿以及大量的同分異構(gòu)體。在上述色譜條件下，采用苦參堿、氧化苦參堿、槐定堿、氧化槐果堿標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行確證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4種標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖和質(zhì)譜圖同上述復(fù)方苦參堿注射液中對應(yīng)成分在保留時(shí)間，準(zhǔn)分子離子和碎片離子吻合，驗(yàn)證了上述結(jié)果的準(zhǔn)確性。

HPLC-MS法集色譜分離及質(zhì)譜定性檢測能力于一體，對于復(fù)雜混合物具有良好的分離和表征能力，可以簡便快速的獲得各化合物的分子結(jié)構(gòu)信息，進(jìn)行定性分析。本法簡便，快速，可用于中藥復(fù)方化學(xué)成分的分析。但儀器價(jià)格昂貴，分析成本較高，不適于大批量樣品的日常分析檢測。

1.7 近紅外(Near infrared, NIR)光譜法 目前，對復(fù)方苦參注射液的質(zhì)量控制研究均需要復(fù)雜的樣品預(yù)處理，成本高，時(shí)間長，不太適合CKI生產(chǎn)過程中中間體的快速分析，而注射液生產(chǎn)過程中中間體的快速分析對于產(chǎn)品的過程質(zhì)量控制是非常重要的。在此背景下，NIR光譜分析技術(shù)成為一種新的選擇，該技術(shù)通過選擇適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)計(jì)量學(xué)方法，把校正集樣品的NIR吸收光譜與其成分濃度或性質(zhì)數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)，建立二者之間的定量校正模型。在進(jìn)行未知樣品預(yù)測時(shí)，應(yīng)用已建好的校正模型和未知樣品的吸收光譜，就可定量預(yù)測其成分濃度或性質(zhì)，該技術(shù)具有快速，同時(shí)測量多種理化性質(zhì)、綠色環(huán)保及操作方便等特點(diǎn)。

陳晨等[12]建立了CKI生產(chǎn)過程中兩類中間體(醇沉液和堿沉液)中4 種生物堿含量的快速測定方法，探討中藥制劑中間體質(zhì)量控制的有效途徑。研究分別采用NIR透射和透反射模式采集樣品光譜，比較不同光譜采集方式的建模效果并優(yōu)選出最佳建模參數(shù)，在此基礎(chǔ)上采用偏最小二乘回歸(PL-SR)算法建立NIR光譜與參考值之間的校正模型，并對未知樣品的含量進(jìn)行預(yù)測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，建立的苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿和氧化苦參堿模型性能良好。醇沉液模型的預(yù)測誤差均方根(RMS-EP)分別為：0.131 g·L-1、0.0279 g·L-1、0.170 g·L-1、0.613 g·L-1；堿沉液模型則分別為0.0723 g·L-1、0.0155 g·L-1、0.0768 g·L-1、0.220 g·L-1。該團(tuán)隊(duì)還報(bào)道采用NIR透反射光譜技術(shù)，對CKI滲漉液中多組分的量進(jìn)行快速測定[13]。該方法采用氧化槐果堿、氧化苦參堿的HPLC 測定值，總糖的苯酚-硫酸法測定值及固體總量的烘烤法測定值為對照值，用偏最小二乘法建立近紅外光譜與對照值之間的校正模型，并對未知樣品進(jìn)行定量預(yù)測。結(jié)果表明，校正模型對氧化槐果堿、氧化苦參堿、總糖和固體總量4 種組分的交叉驗(yàn)證均方根誤差(RMSECV)分別為43.5、135.4、1255.7 mg·L-1和150.7 mg· mL-1，經(jīng)外部驗(yàn)證，預(yù)測均方根誤差(RMSEP)分別為32.5、191.7、1 461.9 mg·L-1和164.0 mg· mL-1。證明所建模型具有滿意的擬合效果和預(yù)測能力，目前已用于復(fù)方苦參注射液滲漉過程的快速分析。與傳統(tǒng)測定方法相比，NIR光譜技術(shù)耗時(shí)短，測定結(jié)果準(zhǔn)確，無需樣品預(yù)處理，大大節(jié)約了時(shí)間和成本，尤其適用于大批量樣品的快速分析，且可通過光纖實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)程測定和在線測定，在工業(yè)生產(chǎn)上極具推廣應(yīng)用價(jià)值。

2 結(jié)語

本文簡要介紹了復(fù)方苦參注射液質(zhì)量控制的7種方法，并對其優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行評述。目前復(fù)方苦參注射液的質(zhì)量控制還局限于測定源自苦參藥材的一些生物堿類化合物，而白土苓作為一味原料藥材，其質(zhì)量標(biāo)志物(Q-Marker)并未在最終產(chǎn)品的質(zhì)量控制中得以體現(xiàn)，這復(fù)方苦參注射液質(zhì)控技術(shù)的主要不足之處。復(fù)方苦參注射液生物堿類化合物的含量測定目前主要采用HPLC方法，但仍需要探索采用新型色譜柱和新的樣品預(yù)處理方法，以簡化操作步驟，提高分析效率。CE技術(shù)也可以用于測定CKI 中生物堿類化合物含量，成本低、效率高，是一種新的選擇。NIR光譜技術(shù)作為一種復(fù)方苦參注射液質(zhì)量控制的新型的方法，具有耗時(shí)短、測定結(jié)果準(zhǔn)確、可實(shí)時(shí)在線監(jiān)控等優(yōu)勢，適應(yīng)了工業(yè)分析的需求，大大節(jié)約了時(shí)間和成本，適用于大批量樣品的分析，非常適合于中藥中間體的檢測及復(fù)方苦參注射液的全程質(zhì)量控制。