缺血性腦血管病的現(xiàn)代研究進(jìn)展

張業(yè)昊，姚明江，劉建勛

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，中藥藥理北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091)

腦卒中是一種常見(jiàn)的疾病，絕大多數(shù)腦卒中病例是由短暫性或永久性腦血管閉塞引起的缺血性腦血管病(缺血性中風(fēng))，最終導(dǎo)致腦梗死。最終的梗死面積和神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)局取決于多種因素，如缺血的持續(xù)時(shí)間和嚴(yán)重程度、側(cè)支系統(tǒng)的存在和足夠的全身血壓、梗死的病因和定位、患者年齡、性別等。因此，缺血性中風(fēng)是一種高度復(fù)雜和異質(zhì)性的疾病。中風(fēng)的長(zhǎng)期表現(xiàn)可以包括抑郁癥、中風(fēng)后疲勞、痙攣狀態(tài)和全身功能喪失，最終導(dǎo)致血管性認(rèn)知障礙。雖然中風(fēng)是一種復(fù)雜的疾病，但一些常見(jiàn)的特征可以用實(shí)驗(yàn)性中風(fēng)來(lái)模擬。缺血性中風(fēng)的一個(gè)重要組成部分是不斷變化的腦損傷，這是由半影的概念所解釋的。在幾分鐘內(nèi)，血液供應(yīng)在基線水平下降15%～20%時(shí)，會(huì)導(dǎo)致梗死核心不可逆轉(zhuǎn)地受損，并伴有快速壞死性細(xì)胞死亡。在周圍的腦組織中，血流量減少的幅度減小，導(dǎo)致神經(jīng)元功能喪失，同時(shí)維持結(jié)構(gòu)完整性。如果沒(méi)有血流恢復(fù)，這個(gè)所謂的有風(fēng)險(xiǎn)的組織將被納入梗死核心。電活動(dòng)喪失和不可逆神經(jīng)元去極化之間的腦灌注范圍，被稱為半暗帶[1]。在臨床試驗(yàn)中，已經(jīng)研究了許多策略來(lái)改善缺血性中風(fēng)的腦部搶救和恢復(fù)，包括抗氧化策略、神經(jīng)元保護(hù)策略，甚至是抗炎策略。盡管進(jìn)行了大量的臨床試驗(yàn)，但由于潛在的不同原因，這些缺血性卒中治療藥物大多數(shù)都失敗了，包括所研究患者的變異性和復(fù)雜性、脫靶效應(yīng)、效力不足或臨床前模型不足。盡管一些藥物已經(jīng)顯示出初步的希望，而其他藥物仍處于臨床試驗(yàn)階段。因此，探究缺血性中風(fēng)的病理機(jī)制及尋找有效的藥物，是目前亟需解決的問(wèn)題。

1 缺血性中風(fēng)與代謝組學(xué)的關(guān)系

代謝組學(xué)是基于特定生物或細(xì)胞中終產(chǎn)物的定性和定量分析[2]。1970年，Horning等[3]開(kāi)始研究代謝物在人體內(nèi)的代謝譜。1983年，尿樣首次通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)進(jìn)行分析。代謝組學(xué)研究可以通過(guò)揭示代謝網(wǎng)絡(luò)和生物標(biāo)志物，闡明特定的機(jī)制。與單獨(dú)的單一途徑或單一生物標(biāo)志物相比，系統(tǒng)性數(shù)據(jù)更有助于闡明復(fù)雜疾病，如腦缺血的發(fā)病機(jī)制[4]。迄今為止，腦缺血的發(fā)病機(jī)制與能量代謝、興奮性氨基酸毒性、活性氧(reactive oxygen species，ROS)和炎癥反應(yīng)有關(guān)。這些過(guò)程涉及多種代謝物，其定性和定量表達(dá)是代謝組學(xué)的重點(diǎn)。

常用于腦缺血代謝組學(xué)研究的動(dòng)物包括大鼠、小鼠、沙鼠、兔、狗、貓、猴和豬，其中，大鼠最常使用。迄今為止的研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腦缺血后的代謝產(chǎn)物主要分為以下5類：氨基酸、核酸、神經(jīng)遞質(zhì)、脂質(zhì)和有機(jī)酸。樣品包括血漿、血清、皮層、海馬、紋狀體、丘腦、中腦、白質(zhì)、松果體和嗅球。在這些組織中，血漿、血清、腦脊液、皮層、海馬和紋狀體得到較好的研究，而其余的樣本研究較少。氨基酸類是最常被發(fā)現(xiàn)的變化的代謝產(chǎn)物，研究發(fā)現(xiàn)，興奮性氨基酸(excitatory amino acid,EAA)，包括谷氨酸和天門冬氨酸在缺血/再灌注后的1 h內(nèi)明顯增加[5-6]。Wang等[7]在缺血/再灌注后24 h觀察到血清和腦脊液中谷氨酸水平增加，而其他氨基酸如丙氨酸，動(dòng)態(tài)降低然后增加。腦脊液中甘氨酸和絲氨酸的水平在缺血后6 h內(nèi)持續(xù)下降。然而，并非所有的實(shí)驗(yàn)都表明缺血/再灌注后EAA增加。目前研究已發(fā)現(xiàn)20多種在腦缺血模型中發(fā)生變化的核酸代謝產(chǎn)物，Irie等[8]使用LC-MS和基質(zhì)輔助激光解吸/電離-MS(MALDI-MS)技術(shù)，檢測(cè)再灌注后大鼠皮質(zhì)、海馬和紋狀體中的20種核酸，并將結(jié)果與正常半球進(jìn)行比較。在皮層和紋狀體中，大部分核酸水平發(fā)生明顯變化，而海馬中的水平保持不變。大多數(shù)核酸在再灌注后的很長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)不斷減少。已經(jīng)提出了兩種理論來(lái)解釋這些下降：首先，在缺血早期，EAA的強(qiáng)大合成過(guò)程迅速耗盡了核酸庫(kù)；其次，參與戊糖磷酸途徑的核糖-5-磷酸脫氫酶的活性在局部缺血時(shí)降低，從而降低總核酸水平[9]。

在早期腦缺血研究中，研究人員通常會(huì)制備全腦組織勻漿，這些研究的結(jié)果顯示了全腦代謝物的平均水平。然而，在不同腦區(qū)個(gè)別代謝物的表達(dá)是不同的。例如，Macrì等[10]發(fā)現(xiàn)，海馬體中丙氨酸水平降低，但在皮質(zhì)中保持穩(wěn)定。因此，在腦缺血代謝組學(xué)研究中，樣本應(yīng)限制在特定的腦區(qū)，以確保識(shí)別的生物標(biāo)記物的準(zhǔn)確性。

2 缺血性中風(fēng)與microRNA的關(guān)系

miRNA是小的非蛋白質(zhì)編碼RNA，其包括通過(guò)進(jìn)化高度保守的20～24個(gè)核苷酸。它們是轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)劑，靶向mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′-UTRs)，抑制各自mRNA的翻譯或降解[11]。miRNA已牽涉多種細(xì)胞過(guò)程和疾病，如神經(jīng)元發(fā)育、分化、突觸可塑性、增殖、代謝、凋亡、神經(jīng)變性疾病和腫瘤的調(diào)控。miRNA幾乎在大腦功能的各個(gè)方面發(fā)揮重要作用，包括神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)發(fā)育和導(dǎo)致突觸可塑性變化的細(xì)胞反應(yīng)。它們還涉及神經(jīng)變性和神經(jīng)疾病，對(duì)缺氧和局部缺血的應(yīng)答以及缺血預(yù)處理誘導(dǎo)的缺血耐受。在最近的研究中，已經(jīng)在臨床試驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分別篩查miRNA表達(dá)譜，這些研究表明，miRNA已經(jīng)成為缺血性中風(fēng)生物學(xué)中的關(guān)鍵介質(zhì)。

2.1 microRNA與缺血性興奮性毒性缺血性中風(fēng)主要通過(guò)興奮性中毒損傷腦組織，腦缺血后，突觸間的谷氨酸大量釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)中的主要興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。在缺血性中風(fēng)后，miR-107的過(guò)表達(dá)，導(dǎo)致抑制谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1(glutamate transporter 1，GLT-1)表達(dá)和谷氨酸蓄積增加，這決定了興奮性毒性的程度[12]。GLT-1缺血后的下調(diào)與谷氨酸的積累密切相關(guān)，提示谷氨酸積累和神經(jīng)元興奮性中毒可通過(guò)GLT-1表達(dá)來(lái)控制[13]。在短暫的前腦缺血后，增加miR-29a保護(hù)星形膠質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)而保護(hù)神經(jīng)元。miR-29a導(dǎo)致PUMA(上調(diào)凋亡調(diào)節(jié)劑p53)水平下降，從而抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1，導(dǎo)致氧化應(yīng)激減弱和神經(jīng)元存活[14]。通過(guò)抑制谷氨酸受體2(glutamate receptor 2，GluR2)和天冬氨酸(N Methyl D Aspartate，NMDA)亞基NR2B的水平，miR-223的過(guò)度表達(dá)，減弱了海馬神經(jīng)元中NMDA誘導(dǎo)的鈣內(nèi)流，并且保護(hù)缺血性腦免受興奮性中毒神經(jīng)元細(xì)胞死亡[15]。據(jù)報(bào)道，NR2A是miR-125b的靶標(biāo)，miR-125b負(fù)向調(diào)節(jié)NR2A的表達(dá)[16]。被NR2B激活的NMDA受體導(dǎo)致興奮性中毒和細(xì)胞凋亡，而含有NR2A的NMDA受體的激活，會(huì)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，并促進(jìn)神經(jīng)元對(duì)抗興奮性毒性介導(dǎo)的神經(jīng)元損傷。受NMDA受體亞單位影響的突觸可塑性發(fā)生改變，這是一種破壞性的影響，中風(fēng)損傷后可塑性能促進(jìn)成體腦復(fù)蘇[17, 18]。

2.2 microRNA與缺血性氧化應(yīng)激氧化應(yīng)激是由體內(nèi)的活性氧/氮物質(zhì)增加，以及抗氧化應(yīng)激防御系統(tǒng)的減少引起的。缺血期間腦內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量活性氧和自由基，形成的原因主要有興奮性毒性谷氨酸的高刺激、鈣超載、線粒體功能障礙、神經(jīng)元一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)的激活，以及炎癥細(xì)胞的遷移產(chǎn)生的過(guò)氧化物陰離子。氧化損傷是缺血性中風(fēng)期間腦損傷和神經(jīng)元細(xì)胞死亡的基本機(jī)制。由于高氧環(huán)境，大量過(guò)氧化脂質(zhì)和低抗氧化劑的產(chǎn)生，大腦最終受到進(jìn)一步損傷。

核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2,Nrf2)/血紅素加氧酶-1(haem oxygenase 1，HO-1)通路是抵抗局部缺血/再灌注引起的氧化應(yīng)激的重要細(xì)胞防御機(jī)制。已有的研究顯示，miRNA參與Nrf2水平的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。研究表明，miR-424降低了丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平、ROS，消除了H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷，從而起到神經(jīng)保護(hù)作用，以抵抗缺血性氧化損傷[19]。評(píng)估m(xù)iR-93在腦缺血損傷中的作用表明，miR-93直接與Nrf2基因預(yù)測(cè)的3′-UTR靶位點(diǎn)結(jié)合，然后減弱Nrf2和HO-1的表達(dá)[20]，另外Nrf2的增加導(dǎo)致SOD上調(diào)[21]。在腦缺血期間，環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase 2，COX-2)可以產(chǎn)生ROS，COX-2是miR-101的靶標(biāo)基因[16]。在正常情況下，COX-2低表達(dá)，而研究表明，腦缺血易于誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞中的COX-2高表達(dá)[22]，而腦缺血中miR-101表達(dá)下調(diào)。此外，還發(fā)現(xiàn)miR-146a抑制COX-2在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的表達(dá)[23]。因此，miRNA可被認(rèn)為是拮抗缺血性中風(fēng)氧化應(yīng)激的有價(jià)值的治療手段。

缺血性卒中后，miRNA功能的失調(diào)、改變，對(duì)參與缺血過(guò)程的下游靶基因有深遠(yuǎn)的影響。單個(gè)miRNA主要通過(guò)抑制和激活許多下游mRNA靶點(diǎn)，來(lái)發(fā)揮其細(xì)胞功能。miRNA表達(dá)的變化與缺血后致病過(guò)程，如興奮性中毒、炎癥、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡之間，都有緊密的聯(lián)系。miRNA譜提供的證據(jù)表明，它們的改變可能有益于缺血性卒中診斷，并且是潛在的治療靶點(diǎn)。此外，miRNAs調(diào)節(jié)眾多靶基因的能力清楚地表明它們?cè)谌毖灾酗L(fēng)治療中的重要性。

3 缺血性中風(fēng)與炎癥的關(guān)系

炎癥和免疫反應(yīng)已經(jīng)成為卒中發(fā)病和發(fā)展的重要因素。中風(fēng)過(guò)程中的免疫炎癥反應(yīng)開(kāi)始于腦及其血管內(nèi)。腦缺血或直接、間接的腦出血，迅速誘發(fā)原發(fā)性不可逆組織損傷。輔助過(guò)程，如興奮性毒性、氧化應(yīng)激和線粒體紊亂，將這種損傷擴(kuò)大到部分保留的梗死周圍區(qū)域(半暗區(qū))。對(duì)這些事件做出反應(yīng)的第一批免疫細(xì)胞似乎是腦內(nèi)固有的小膠質(zhì)細(xì)胞，隨后是從外周通過(guò)血腦屏障的內(nèi)皮細(xì)胞管壁進(jìn)入大腦的白細(xì)胞[24]。這些白細(xì)胞的進(jìn)入可能是由來(lái)自垂死神經(jīng)元的趨化因子引導(dǎo)的。內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式分子也從死亡細(xì)胞釋放，并且有利于炎性介質(zhì)的上調(diào)[25]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有豐富的神經(jīng)上皮來(lái)源的常駐細(xì)胞，這些細(xì)胞被歸類為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞亞型包括星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和多形核細(xì)胞。最近的研究表明，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞不是簡(jiǎn)單的被動(dòng)支持細(xì)胞，相反，它們積極與神經(jīng)元和類似缺血性腦卒中應(yīng)激條件下其他CNS細(xì)胞相互作用[26]。星形膠質(zhì)細(xì)胞是“神經(jīng)血管單元”的基本要素，神經(jīng)血管單元主要包含內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元、星形細(xì)胞終末足細(xì)胞，甚至周細(xì)胞。在CNS中最多類型的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是星形膠質(zhì)細(xì)胞，其存在于白質(zhì)(例如胼體)和灰質(zhì)(例如皮質(zhì))，并且表征為先天性免疫神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。星形膠質(zhì)細(xì)胞作為先天性神經(jīng)免疫的哨兵，參與調(diào)節(jié)突觸活動(dòng)，調(diào)節(jié)體內(nèi)水平衡以及清除有毒代謝物[27]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血后，星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)過(guò)許多變化，包括快速膨脹、提高的Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)、GFAP的表達(dá)(所有反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生的標(biāo)志)增加[28]。延長(zhǎng)激活后，反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞將形成神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕。除了這些形態(tài)改變，星形膠質(zhì)細(xì)胞積極地通過(guò)產(chǎn)生炎癥介質(zhì)(IL-6、IL-1β)、補(bǔ)體成分和趨化因子(CXCL12、CXCL1、CXCL10、MCP-1)，延續(xù)CNS缺血性免疫應(yīng)答[29]。

因此，缺血后炎癥的發(fā)生，在腦缺血損傷的各個(gè)階段中起重要作用。在缺血性中風(fēng)治療中使用抗炎策略具有一定的前景，并且由于星形膠質(zhì)細(xì)胞是CNS中最豐富的細(xì)胞亞型，它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)和功能上，參與正常腦生理學(xué)和缺血性病理學(xué)反應(yīng)。它們積極與所有類型的腦細(xì)胞進(jìn)行接觸和交流。因此，星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦功能和生理學(xué)中起著重要的支持和調(diào)節(jié)作用。中風(fēng)后，星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)可能加劇急性期的缺血性損害，而梗死周圍區(qū)域的膠質(zhì)瘢痕可能阻礙軸突再生，并隨后減少急性期后的功能結(jié)局。

4 展望

對(duì)于缺血性中風(fēng)的研究，仍然有必要從多角度、多靶點(diǎn)尋找治療手段。一方面，缺血性中風(fēng)主要是一種簡(jiǎn)單且明確的病理狀態(tài)，伴隨著血流中斷和依賴組織的連續(xù)損傷；另一方面，缺血性卒中是一種非常復(fù)雜和異質(zhì)性的疾病，其在臨床表現(xiàn)上除了神經(jīng)系統(tǒng)定位癥狀和體征外，還伴有一系列的神經(jīng)心理癥狀和精神行為異常。嚴(yán)格地說(shuō)，中風(fēng)不是單一的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，而是潛在的系統(tǒng)性問(wèn)題的表現(xiàn)，如動(dòng)脈粥樣硬化、炎癥或感染，這可能在其他器官中引起梗死，例如心臟病的發(fā)作。因此，任何針對(duì)單一環(huán)節(jié)的治療都不足以應(yīng)對(duì)這一系列的問(wèn)題。復(fù)方中藥已在中國(guó)和一些亞洲國(guó)家應(yīng)用了幾千年，過(guò)去幾十年的研究揭示了復(fù)方中藥治療復(fù)雜疾病的優(yōu)勢(shì)[30]，其含有多種具有潛在功能的生物活性成分，包括調(diào)節(jié)能量代謝、抗氧化、抑制炎癥因子釋放、抗血小板聚集等，并對(duì)血栓形成、白蛋白滲漏和肥大細(xì)胞的脫顆粒等都具有一定的抑制作用。未來(lái)探索復(fù)方中藥治療缺血性中風(fēng)，必然顯現(xiàn)出多靶點(diǎn)、多途徑的治療優(yōu)勢(shì)。