補(bǔ)體C3及C5在纖維化中的作用研究進(jìn)展①

許 洪 張宏波 陳建林

(中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心，長沙410011)

補(bǔ)體(Complement，C)是存在于人和動(dòng)物血清與組織液中的一組不耐熱、經(jīng)活化后具有酶活性、可介導(dǎo)免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)的蛋白質(zhì)。補(bǔ)體系統(tǒng)(Complement system)被激活后，介導(dǎo)一系列的細(xì)胞反應(yīng)，如細(xì)胞溶解、調(diào)理吞噬(抗原抗體結(jié)合)、炎癥反應(yīng)、清除免疫復(fù)合物等。

眾所周知，補(bǔ)體系統(tǒng)在各種慢性疾病的發(fā)病機(jī)制中起到了重要作用，如自身免疫性疾病、動(dòng)脈粥樣硬化以及糖尿病的血管并發(fā)癥等[1-3]。近些年來，補(bǔ)體在慢性炎癥疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的作用越來越引起了人們的重視，研究人員在研究補(bǔ)體與慢性炎癥疾病的纖維化結(jié)局的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)體系統(tǒng)的激活可能直接或間接參與了纖維化的發(fā)生與發(fā)展。本文將就補(bǔ)體C3 和 C5在纖維化發(fā)展中的作用研究進(jìn)展作一綜述。

1 補(bǔ)體系統(tǒng)激活

補(bǔ)體系統(tǒng)主要由固有成分、調(diào)節(jié)蛋白及受體等30余種糖蛋白組成。補(bǔ)體固有成分以非活化形式存在體液中，通過旁路途徑、凝集素途徑(MBL途徑)、經(jīng)典途徑先后被激活[4]。三條途徑起始物各異，但相互交叉并具有共同的末端通路。經(jīng)典途徑的激活始于C1q與免疫復(fù)合物的Fc段結(jié)合[5]，依賴特異性抗體的產(chǎn)生，故在感染后期或恢復(fù)期發(fā)揮作用。旁路途徑則由細(xì)菌、真菌或病毒感染細(xì)胞等直接為自發(fā)產(chǎn)生的C3b提供反應(yīng)表面啟動(dòng)激活[6]，無需抗體存在，故在抗體產(chǎn)生前的感染早期或初次感染發(fā)揮作用。凝集素途徑也無需抗體參與即可激活補(bǔ)體，其激活物質(zhì)非常廣泛，主要是MBL或纖維膠原素直接識(shí)別病原微生物表面的N氨基半乳糖或甘露糖[7]，除識(shí)別機(jī)制不同于經(jīng)典途徑外，其后續(xù)活化途徑基本相同，對(duì)經(jīng)典途徑和旁路途徑具有交叉促進(jìn)作用[4，8]。

三條補(bǔ)體激活途徑在C3這一環(huán)節(jié)匯合進(jìn)入共有的末端通路，形成C5轉(zhuǎn)化酶，激活C5裂解成C5a和C5b。C5b結(jié)合于細(xì)胞表面，依次與C6、C7、C8和12～15個(gè)C9分子結(jié)合形成C5b6789n，即膜攻擊復(fù)合物(MAC)[4]，介導(dǎo)細(xì)胞溶解效應(yīng)[9]。同時(shí)，補(bǔ)體活化過程中產(chǎn)生多種裂解片段，通過相應(yīng)的受體介導(dǎo)多種生物學(xué)功能[10，11]，如C3b、C4b等片段參與調(diào)理作用來抵御全身性的細(xì)菌感染和真菌感染；C5a、C3a和C4a等片段參與炎癥介質(zhì)作用；C3b等通過與循環(huán)免疫復(fù)合物結(jié)合參與清除免疫復(fù)合物。

2 補(bǔ)體與纖維化的關(guān)系

纖維化(Fibrosis)是指各種病因引起細(xì)胞發(fā)生炎癥及壞死等變化，進(jìn)而刺激損傷部位纖維母細(xì)胞的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的積聚，導(dǎo)致纖維結(jié)締組織異常沉積的病理過程。纖維化多由炎癥遷延不愈，反復(fù)持續(xù)造成組織器官損傷而來。補(bǔ)體是炎癥反應(yīng)發(fā)生與發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。激活補(bǔ)體系統(tǒng)形成膜攻擊復(fù)合物C5b-9，破壞被感染的細(xì)胞是炎癥反應(yīng)的特點(diǎn)。

C3a和C5a分別是C3和C5在補(bǔ)體激活途徑中的裂解產(chǎn)物，也稱為過敏毒素和趨化因子，可以趨化和激活巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等，釋放炎性物質(zhì)，造成局部的炎性反應(yīng)[12]，從而導(dǎo)致器官組織的損傷?，F(xiàn)就補(bǔ)體C3、C5及其裂解產(chǎn)物C3a、C5a與各器官組織纖維化的關(guān)系做詳細(xì)綜述。

2.1補(bǔ)體與肝纖維化的關(guān)系 肝臟是補(bǔ)體合成的主要場所，血漿中80%～90%的補(bǔ)體成分在肝細(xì)胞合成，肝臟細(xì)胞表面也表達(dá)大量的補(bǔ)體受體。病毒性肝炎等肝臟疾病可以導(dǎo)致肝臟局部或全面的炎癥反應(yīng)，若炎癥遷延不愈，持續(xù)反復(fù)的損傷肝臟，引起肝細(xì)胞變性壞死，細(xì)胞外基質(zhì)的沉積大于重塑，最終會(huì)形成肝纖維化[13]。但是目前導(dǎo)致肝纖維化的病理機(jī)制尚不明確。近年來，許多研究表明肝臟疾病的纖維化進(jìn)展與補(bǔ)體激活相關(guān)。

肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate cells，HSCs)位于肝竇內(nèi)皮細(xì)胞與肝細(xì)胞之間的竇周間隙內(nèi)，是激活的肌成纖維細(xì)胞和門管區(qū)成纖維細(xì)胞的主要來源，在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展以及恢復(fù)方面有重要作用。肝臟損傷引起的炎癥因子釋放可以激活肝星狀細(xì)胞，引起肝星狀細(xì)胞增殖和分泌富含Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原細(xì)胞外基質(zhì)，參與肝纖維化的形成和肝內(nèi)結(jié)構(gòu)的重建[14]。此外，肝星狀細(xì)胞的表面表達(dá)有C5a的受體，C5a通過與受體結(jié)合也可以激活肝星狀細(xì)胞，參與肝纖維化的形成[15]。

慢性病毒性肝炎是導(dǎo)致肝纖維化的常見疾病，肝炎病毒感染機(jī)體后，可以通過經(jīng)典途徑、旁路途徑、MBL途徑(凝集素途徑)產(chǎn)生補(bǔ)體及膜攻擊復(fù)合物，破壞感染的肝細(xì)胞。大量的肝活檢和血清學(xué)證據(jù)顯示補(bǔ)體C3參與了肝纖維化的形成。Vasei等[16]的研究顯示在慢性乙型肝炎患者的肝組織中發(fā)現(xiàn)C3的沉積。Matthus Vasel等[17]的研究表明在慢性乙型肝炎和其他肝病患者中，血清C3a的水平高于健康對(duì)照組，且對(duì)于其他肝病患者來說，C3a水平與纖維化程度和晚期纖維化的發(fā)生有密切關(guān)系，是很好的反映疾病活動(dòng)度和纖維化發(fā)展的標(biāo)記物，但C3a具體是如何發(fā)揮作用的尚不明確。

而C5可能是通過與肝星狀細(xì)胞的表面的C5a受體結(jié)合介導(dǎo)纖維化產(chǎn)生。Hillebrandt等[18]的研究顯示經(jīng)CCl4處理過的C5缺失的小鼠纖維化程度顯著降低，用C5a受體拮抗劑可以達(dá)到同樣的效果。此外，Hillebrandt等人證明小鼠中C5的突變與肝纖維化有關(guān)，2個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNPs)rs17611和rs2300929被報(bào)道會(huì)增加慢性乙型肝炎患者的纖維化風(fēng)險(xiǎn)[18]，但是這個(gè)結(jié)果不能被更大的多中心確證研究重復(fù)[19]。

慢性丙型肝炎引起的纖維化中，Schmitt等[20]的研究表明降低C5水平能夠減輕炎癥反應(yīng)，減少金屬蛋白酶9(Matrix metalloproteinase-9，MMP-9)活動(dòng)，從而顯著降低肝纖維化和肝硬化程度。

2.2補(bǔ)體與胰腺纖維化的關(guān)系 慢性胰腺炎是引起胰腺纖維化的主要疾病。一般認(rèn)為，胰腺纖維化是慢性胰腺炎的自然結(jié)局。

慢性胰腺炎導(dǎo)致的纖維化可能是由于胰腺蛋白酶激活導(dǎo)致胰腺自身消化乃至壞死，引起炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)纖維化反應(yīng)，最后壞死組織被纖維組織替代，形成纖維化[21]。Sendler等[22]建立了一個(gè)小鼠慢性胰腺炎模型，這個(gè)模型以蛋白酶激活引起的全身炎癥反應(yīng)、腺泡細(xì)胞壞死為起始表現(xiàn)，研究結(jié)果顯示C5可能被胰蛋白酶水解物激活，直接作用于胰腺星狀細(xì)胞(Pancreatic stellate cells，PSCs)，促進(jìn)纖維化形成。Sendler等[22]用C5a受體拮抗劑抑制C5a受體1(C5aR1)，發(fā)現(xiàn)可以很大程度上減少胰腺壞死后的纖維生成。他們又研究了C5缺陷小鼠的慢性胰腺炎纖維化結(jié)局，發(fā)現(xiàn)C5缺陷小鼠的胰腺纖維化程度明顯降低。PSCs、HSCs以及纖維母細(xì)胞的表達(dá)分析顯示，PSCs和HSCs有很多同源性，例如在細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、生長因子、視黃酸代謝的基因表達(dá)方面有著高度同源性，Erkan等[23]也表示兩者的相似之處多于不同之處。

此外，Hillebrandt等[18]的研究發(fā)現(xiàn)C5的兩個(gè)SNPs rs17611和rs2300929與肝纖維化增加有關(guān)，但是這個(gè)結(jié)果不能被更大的多中心確證研究重復(fù)[15]。Matthias Sendler等人研究了這兩個(gè)SNPs與胰腺炎的關(guān)系，沒有發(fā)現(xiàn)突變的等位基因與慢性胰腺炎的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，但是研究表明SNPs rs17611有升高血清C5水平的趨勢[22]。

2.3補(bǔ)體與肺纖維化的關(guān)系 肺纖維化(Pulmonary fibrosis，PF)是一種主要以成纖維細(xì)胞增殖為病理特征的慢性肺間質(zhì)疾病，其中最常見的是特發(fā)性肺纖維化(Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)。關(guān)于肺纖維化的發(fā)病機(jī)制，現(xiàn)在尚未闡明。Gu等人的研究顯示C3a和C5a可以誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞激活以及上調(diào)C3a和C5a受體的表達(dá)，并且與C3a和C5a受體結(jié)合還可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞分化、α-SMA表達(dá)增多和基質(zhì)合成增多[24]。有研究顯示在IPF和博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化中均可以發(fā)現(xiàn)肺成纖維細(xì)胞分泌的膠原纖維含量增加以及Ⅰ型膠原α1和α2鏈的mRNA表達(dá)增加[25,26]，Gu等人通過C3a和C5a受體拮抗劑抑制補(bǔ)體激活和補(bǔ)體沉積，顯著減少肺中膠原沉積以及Ⅰ型膠原α1和α2鏈mRNA的表達(dá)，從而阻止了纖維化的進(jìn)展[24]。

TGF-β是目前公認(rèn)的促纖維化因子，主要作用是促進(jìn)膠原與細(xì)胞外基質(zhì)形成，同時(shí)抑制膠原酶的降解從而促纖維化形成。TGF-β需要與PDGF受體酪氨酸激酶一起發(fā)揮促纖維化作用[27,28]。Gu等[24]發(fā)現(xiàn)抑制C3a和C5a與其受體結(jié)合可以抑制PDGF mRNA的表達(dá)，從而抑制其與TGF-β的作用。核心蛋白聚糖(Decorin)是一種與膠原纖維相關(guān)的蛋白多糖，主要存在于結(jié)締組織中。核心蛋白聚糖的核心蛋白可以通過與TGF-β結(jié)合抑制TGF-β的作用從而減少纖維化[29]。Gu等[24]通過阻斷C3a和C5a受體，增加核心蛋白聚糖的轉(zhuǎn)錄水平，從而有效抑制TGF-β1的水平，減少纖維化。雖然阻斷C3a和C5a受體可以減少TGF-β誘導(dǎo)的肺纖維化，但Amanda J Fisher等人研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體級(jí)聯(lián)激活途徑和TGF-β相關(guān)的信號(hào)通路促進(jìn)纖維化形成的機(jī)制可能是相同并且平行的， C3a和C5a在上皮增生、纖維化和腫瘤生物學(xué)相關(guān)的miRNA調(diào)節(jié)方面和TGF-β的調(diào)節(jié)作用是相同的[30]。Cipolla等[31]提出， C3、C5參與肺纖維化進(jìn)程受到IL-17的調(diào)控。特發(fā)性肺纖維化患者血清 C3及 C5水平與 IL-17含量正相關(guān)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)IL-17通過降低促衰變因子(Decay accelerating factor,DAF)與補(bǔ)體的結(jié)合繼而劑量依賴性地促進(jìn) C3分泌從而加速肺纖維化進(jìn)程。在博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠模型中，缺乏 IL-17將使肺泡細(xì)胞凋亡及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激得到緩解，并降低呼吸道分泌物中 C3及 C5的含量，因此IL-17基因敲除小鼠肺纖維化程度顯著降低。

此外，還有報(bào)道稱C3aR和C5aR參與到p-AKT、p-Foxol以及其他信號(hào)通路如cAMP-PKA-CREB通路、NF-κB、JAK/STAT5和ERK通路中，介導(dǎo)肺纖維化產(chǎn)生[32]?？梢姡a(bǔ)體 C3及 C5對(duì)肺纖維化的促進(jìn)作用并非孤立的，而是通過上游和下游的信號(hào)分子甚至協(xié)同其他細(xì)胞因子構(gòu)成一個(gè)龐大的信號(hào)系統(tǒng)調(diào)控著疾病的發(fā)生與發(fā)展。

2.4補(bǔ)體與腎纖維化的關(guān)系 腎纖維化是各種慢性腎病進(jìn)展至終末期腎衰的共同病變過程，如多囊性腎病、腎小球腎炎、溶血性尿毒綜合征、腎移植等，有報(bào)道稱補(bǔ)體激活與這些疾病的纖維化結(jié)局有關(guān)[33-36]。腎間質(zhì)肌成纖維細(xì)胞是合成細(xì)胞外基質(zhì)的主要細(xì)胞，在腎纖維化的發(fā)病中起著重要作用。肌成纖維細(xì)胞可能由腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化)和內(nèi)皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化)而來[37,38]。Wan等[39]的研究顯示補(bǔ)體激活可以直接調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的功能從而誘導(dǎo)纖維化生成，C3a可以誘導(dǎo)人腎間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化成合成型，增加Ⅳ型膠原纖維、骨橋蛋白等的合成，MAC的形成可以使管周肌成纖維細(xì)胞積聚增多，促進(jìn)腎纖維化形成。Curci等[40]研究顯示補(bǔ)體C3a和C5a可以激活A(yù)kt的磷酸化從而激活A(yù)kt信號(hào)通路，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)MAC形成，而抑制補(bǔ)體水平可以減少這種內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化以及組織的纖維化。Liu等[41]利用小鼠單側(cè)輸尿管結(jié)扎構(gòu)建小鼠腎纖維化模型，提出巨噬細(xì)胞通過局部分泌C3，引起IL-17A介導(dǎo)的炎癥細(xì)胞浸潤，從而驅(qū)動(dòng)纖維化反應(yīng)。Zhou等[42]研究表明C3可以通過誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，激活腎素-血管緊張素系統(tǒng)，促進(jìn)纖維化。Yiu等[43]對(duì)比了糖尿病腎病患者和非糖尿病腎病患者的腎活檢結(jié)果發(fā)現(xiàn)，前者的腎臟含有更高的 C5a，并且腎小管較腎小球處含量更豐富，但 C5a 受體在兩組中并無差別。進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，C5a 拮抗劑NOX-D21能改善腎小球硬化及小管-間質(zhì)損傷導(dǎo)致的纖維化，這證實(shí)了 C5a 在糖尿病腎病所致的纖維化中起到關(guān)鍵作用。一方面 C5a 活化 PI3K/Akt信號(hào)通路增加 TGF-β的分泌促進(jìn)纖維化進(jìn)程。另一方面，C5a上調(diào)DGAT1、SREBP-1等脂肪合成中的關(guān)鍵分子從而增加機(jī)體三酰甘油水平，脂質(zhì)在腎小管上皮內(nèi)蓄積，引起局部脂肪代謝紊亂，最終導(dǎo)致腎臟纖維化。

腎臟的缺血再灌注損傷是公認(rèn)的導(dǎo)致腎纖維化的原因。補(bǔ)體激活和內(nèi)皮細(xì)胞激活是腎移植后缺血再灌注損傷的特點(diǎn)。缺血再灌注損傷始于血管表面的內(nèi)皮細(xì)胞損傷，實(shí)驗(yàn)表明，補(bǔ)體C5a通過與內(nèi)皮細(xì)胞表面的C5a受體結(jié)合，介導(dǎo)P選擇素表達(dá)，釋放活性氧，進(jìn)一步加重內(nèi)皮損傷以及炎癥細(xì)胞遷移[44]。Boor等[45]構(gòu)建了一個(gè)單側(cè)輸尿管梗阻的小鼠模型，顯示敲除C5基因的小鼠以及使用C5a受體拮抗劑的小鼠的腎纖維化均顯著減少，說明C5通過C5a受體的作用介導(dǎo)纖維化產(chǎn)生。類似的，Naheed Choudhry等人建立了一個(gè)慢性腎盂腎炎的小鼠模型，發(fā)現(xiàn)C5a通過與C5a受體1(C5aR1)結(jié)合可以增加腎小管上皮細(xì)胞的菌落數(shù)和炎癥反應(yīng)，損傷吞噬細(xì)胞的吞噬功能從而導(dǎo)致慢性炎癥和腎纖維化[46]。Bao等[47]將Crry(-/-)C3(-/-)的小鼠腎臟移植給敲除了C3a受體或C5a受體的小鼠，發(fā)現(xiàn)敲除了C3a受體的小鼠的炎癥反應(yīng)和腎纖維化均顯著減少，說明是通過C3a受體介導(dǎo)的炎癥損傷作用而不是C3a的直接促纖維化作用導(dǎo)致了腎纖維化。Danobeitia等[48]的研究還發(fā)現(xiàn)通過在缺血再灌注損傷前靜脈內(nèi)給予補(bǔ)體抑制劑，可以防止C5a的釋放以及C3b的沉積，從而保護(hù)腎臟免于炎癥損傷和繼發(fā)的纖維化產(chǎn)生。Thorenz等[49]發(fā)現(xiàn)，在IRI引起的腎纖維化小鼠模型中，C5aR1(-/-)和C5aR2(-/-)小鼠產(chǎn)生較少的炎癥并顯示出比野生型小鼠更好的腎灌注。特別是C5aR2(-/-)小鼠的腎小管和毛細(xì)血管再生增強(qiáng)，腎纖維化較少，提示C5aR1與C5aR2與IRI引起的腎纖維化有關(guān)。

總之，MAC的形成可通過誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞的凋亡對(duì)腎臟造成直接損傷，而C3a和C5a促進(jìn)炎癥細(xì)胞的招募和促炎因子、趨化因子、活性氧的釋放，增強(qiáng)免疫反應(yīng)，進(jìn)一步加速腎小管細(xì)胞的壞死和凋亡。激活的內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞以及損傷的腎小管上皮細(xì)胞通過釋放促纖維化因子如TGF-β等與補(bǔ)體C3a或C5a結(jié)合，并進(jìn)一步結(jié)合到C3a或C5a受體上，激活成纖維細(xì)胞，使膠原沉積，形成纖維化。

3 總結(jié)

損傷、免疫反應(yīng)和組織修復(fù)之間的相互作用仍然是當(dāng)下熱門的研究。目前認(rèn)為補(bǔ)體系統(tǒng)在導(dǎo)致器官組織損傷的機(jī)制中起著決定性的作用，但引起纖維化的潛在機(jī)制尚未了解透徹。大量的研究表明，補(bǔ)體、補(bǔ)體受體與纖維化的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，補(bǔ)體激活的產(chǎn)物如MAC(C5b-9)和過敏毒素C3a、C5a等在加重炎癥反應(yīng)、趨化招募中性粒細(xì)胞或單核細(xì)胞導(dǎo)致組織損傷以及促纖維化反應(yīng)方面有著至關(guān)重要的作用。

在全世界范圍內(nèi)，纖維化是很多疾病致死致殘的主要原因。積極的干預(yù)治療可逆轉(zhuǎn)早期纖維化，若纖維化持續(xù)進(jìn)展，則可導(dǎo)致器官結(jié)構(gòu)破壞、功能減退甚至衰竭，對(duì)人類健康生命造成嚴(yán)重威脅。同時(shí)，纖維化也是影響世界范圍內(nèi)器官移植結(jié)局的重要原因。因此，研究清楚補(bǔ)體介導(dǎo)的纖維化的分子機(jī)制以及補(bǔ)體與HSCs、PSCs等介導(dǎo)纖維化細(xì)胞之間的關(guān)系，有助于為減少炎癥損傷和組織纖維化提供新的治療方向。同時(shí)，通過研究靶向抑制纖維化的藥物，也可以最大化地利用有限的捐獻(xiàn)器官以及改善世界各地的器官移植結(jié)局，造福人類。