牛多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗的實驗室制備及小鼠攻毒試驗分析

赫鳴睿

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

牛莢膜A型多殺性巴氏桿菌是引起牛呼吸道疾病的主要病原菌之一[1]，患病牛表現(xiàn)出纖維素性肺炎，呼吸困難，個別病例伴有血便等其他消化道癥狀[2]，能引起犢牛很高的死亡率，該病已呈世界性流行和分布[3]。近年來，由該菌感染引起的牛肺炎在世界多個地區(qū)規(guī)?；鲋蓄l繁發(fā)生，造成犢牛大批死亡嚴(yán)重影響?zhàn)B牛業(yè)的發(fā)展[4-5]，在中國關(guān)于牛A型多殺性巴氏桿菌病疫苗的研究很少。滅活疫苗在生產(chǎn)使用方面更加安全穩(wěn)定，而且制作成本低具有良好的保護(hù)效果[6]。如今，在中國獸藥市場上，牛A型多殺性巴氏桿菌疫苗的生產(chǎn)仍處于空白狀態(tài)。因此，有必要開發(fā)一種針對牛A型多殺性巴氏桿菌病的疫苗[7]。

1 試驗材料

牛A型多殺性巴氏桿菌WC1654株、LD01株分離于五常市和林甸縣某牛場肺炎發(fā)病犢牛，菌株分離后進(jìn)行凍干保存。試驗動物購自北京威通利華動物有限公司，選用體重在18～22 g昆明系小白鼠且雌雄各半。無菌綿羊血、蜂膠佐劑由本實驗室保存，革蘭氏染色液（批號：20180426）購自安徽省巢湖市弘慈醫(yī)療器械有限公司。腦心浸液（批號：20170603）和營養(yǎng)瓊脂（批號：20160802）購自青島海博生物科技有限公司，生化試管（批號：170509）購自杭州濱河微生物試劑有限公司。

2 試驗方法

2.1 菌液制備及鏡檢多殺性巴氏桿菌WC1654株、LD01株分別接種于含有5%綿羊血的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的，然后置于37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行觀察。挑取在含有5%羊血的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的單個菌落，均勻涂布于載玻片上酒精燈干燥固定，進(jìn)行革蘭氏染色及顯微鏡檢查。多殺性巴氏桿菌WC1654株、LD01株的單個菌落分別接種到腦心浸液肉湯中放入空氣浴搖床中37℃進(jìn)行增菌培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h作細(xì)菌種子液。將兩株多殺性巴氏桿菌的種子液按照1：100比例接種到腦心浸液肉湯中進(jìn)行增菌培養(yǎng)24 h作為疫苗制備液。

2.2 細(xì)菌生化鑒定 將菌落純培養(yǎng)物分別接種到肌醇、麥芽糖、甘露糖蔗糖、半乳糖、鼠李糖、果糖、葡萄糖、乳糖、明膠、甘露醇、木糖、糊精、山梨醇、甲基紅、Vp試驗、靛基質(zhì)等生化管中37℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果并記錄。

2.3 多殺性巴氏桿菌毒力基因PCR鑒定 高溫水浴法提取DNA，菌體洗滌：取200 μL菌液于EP管中，再加入等體積磷酸鹽緩沖溶液（PBS）混合，將EP管12 000 r/min離心3 min，棄上清，按以上步驟使用PBS對菌液進(jìn)行洗滌2～3次。菌體高溫加熱：EP管在水浴鍋加熱20 min加熱溫度為100℃。模板DNA提?。杭訜岷笤?2 000 r/min離心15 min，吸上清于-20℃冰箱保存。

PCR反應(yīng)體系：上、下游引物（10 μM）0.5 μL、DNA 1 μL、TaqMasterMix（5 U/μL）12.5 μL，補(bǔ)充去離子水至總體積為25 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火45 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃終延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物加到1%瓊脂糖凝膠孔內(nèi)，電泳儀電壓設(shè)置150 V，接通電泳槽。25 min后取出凝膠，用紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照保存。

表1 引物序列Table 1Peimer sequence

2.4 多殺性巴氏桿菌LD 50的測定 將WC1654株和LD01株菌液分別調(diào)至不同濃度后腹腔注射小鼠，9組小鼠注射劑量均是0.2 mL/只，活菌數(shù)分別為1.0×109、1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101CFU/只，每組10只小鼠，共18組，設(shè)10只小鼠作為對照組每只注射0.9%生理鹽水0.2 mL，在注射后第1 d至第10 d不同時間段對小鼠進(jìn)行觀察。

2.5 疫苗制備使用工作濃度為1.5%甲醛溶液與菌液1：10混勻，將含有終濃度為0.15%甲醛溶液的菌液放于37℃空氣浴搖床中振蕩24 h，將滅活后的菌液分別接種在含5%綿羊血營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和腦心浸液肉湯中，37℃培養(yǎng)48 h檢驗滅活效果。將滅活的WC1654株和LD01株菌液10倍濃縮再1：1混合，將混合菌液與蜂膠佐劑1：1配制成滅活疫苗，放入4℃冰箱保存，疫苗含菌量為4.38×1010CFU/mL。

2.6 疫苗的安全性檢驗將制備好的疫苗接種在含5%綿羊血營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)7 d，觀察細(xì)菌是否生長。取10只小白鼠，分別皮下多點注射疫苗，1 mL/只；觀察10 d，記錄食欲、精神狀態(tài)、注射部位變化及全身反應(yīng)。

2.7 攻毒保護(hù)試驗試驗組和對照組各取10只分成2個攻毒組，每組40只小鼠，用3倍LD50活菌液WC1654株和3倍LD50活菌液LD01株分別攻毒，攻毒時間為3次免疫結(jié)束后第10天，觀察7 d內(nèi)小鼠的發(fā)病及死亡情況。

3 結(jié)果與分析

表2 小鼠免疫分組Table 2The mice immune group

3.1 疫苗的無菌檢驗及安全性檢驗結(jié)果血液瓊脂培養(yǎng)基無任何微生物生長。小鼠接種10 d后均健活，經(jīng)過蜂膠佐劑疫苗注射的小鼠其注射部位皮膚上無腫塊、無毛發(fā)脫落、無化膿現(xiàn)象，小鼠食欲、尿液、糞便均為正常狀態(tài)。

圖1 多殺性巴氏桿菌WC1654鏡檢結(jié)果Fig.1Pasteurella WC1654 microscopic examination results

3.2 細(xì)菌鏡檢結(jié)果細(xì)菌為兩端鈍圓的革蘭氏陰性短小桿菌，個別菌體可呈近似橢圓形，多單獨或成對存在，不形成芽胞，符合多殺性巴氏桿菌形態(tài)特異性，鏡檢結(jié)果見圖1和圖2。

圖2 多殺性巴氏桿菌LD01鏡檢結(jié)果Fig.2Pasteurella LD01 microscopic examination results

3.3 生化試驗結(jié)果這兩株菌均符合多殺性巴氏桿菌的生化特性，具體結(jié)果見表3。

3.4 PCR檢測結(jié)果LD01株多殺性巴氏桿菌和WC1654株多殺性巴氏桿菌5種毒力基因擴(kuò)增片段與預(yù)期目的片段大小相符，見圖3和圖4。

表3 多殺性巴氏桿菌生化試驗結(jié)果Table 3 Pasteurella biochemical reaction results

圖3 LD01毒力基因PCR電泳結(jié)果Fig.3 Pasteurella LD01 virulence gene electrophoresis results

圖4 WC1654毒力基因PCR電泳結(jié)果Fig.4 Pasteurella WC1654 virulence gene electrophoresis results

3.5 多殺性巴氏桿菌LD 50結(jié)果多殺性巴氏桿菌WC1654株的半數(shù)致死量（LD50）為3.78×107CFU，多殺性巴氏桿菌LD01株的半數(shù)致死量（LD50）為1.31×107CFU。

3.6 攻毒保護(hù)試驗結(jié)果 以WC1654株攻毒后，7 d內(nèi)對照組全部死亡，Group 1在7 d內(nèi)死亡8只小鼠Group 2在7 d內(nèi)死亡6只小鼠Group 3在7 d內(nèi)死亡4只小鼠，以LD01株攻毒后，7 d內(nèi)對照組全部死亡，Group 1在7 d內(nèi)死亡9只小鼠 ，Group 2在7 d內(nèi)死亡7只小鼠Group 3在7 d內(nèi)死亡4只小鼠，Group 3中小鼠存活率都很高，且保護(hù)率均為60%。

圖5 攻毒保護(hù)結(jié)果Fig.5Challenge results

4 討論

據(jù)不完全統(tǒng)計我國畜牧養(yǎng)殖企業(yè)抗生素濫用的現(xiàn)象很多，一些抗生素對動物體免疫功能起到有害影響，還有一些抗生素可產(chǎn)生腎毒性、肝毒性造成機(jī)體損傷，抗生素濫用使得耐藥菌株大量產(chǎn)生，可供選擇治療藥物的空間也變小[8-10]。使細(xì)菌性疾病的藥物防治工作更加棘手。因此研制有效的疫苗來預(yù)防細(xì)菌性疾病，越來越受到重視并被廣泛的采用。滅活疫苗主要由死亡的菌體組成，因此比較安全、穩(wěn)定[11-12]。滅活菌體在體內(nèi)不能擴(kuò)增，這使抗原免疫量有限，所以需多次接種滅活疫苗，才能產(chǎn)生比較牢固的免疫力。我國是養(yǎng)牛大國，傳統(tǒng)不科學(xué)的養(yǎng)牛方式在牛場工作者心中根深蒂固，牛舍建造簡陋、牛群生存環(huán)境差、飼養(yǎng)密度過大、牛排泄物得不到妥善清理及飼料水源不清潔等現(xiàn)象都特別常見，這些情況的出現(xiàn)是影響我國養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展的大問題，在國內(nèi)許多奶牛、肉牛養(yǎng)殖場中，細(xì)菌性疾病混合感染的病例特別常見，根據(jù)這一情況，高效的滅活細(xì)菌疫苗將受到極大關(guān)注。而且滅活疫苗具有制造成本低、制作周期短、安全性高等實際優(yōu)勢和生產(chǎn)優(yōu)勢，所以滅活菌苗更利于投放我國的獸藥市場。