生物活性過氧化氫酶對斷奶仔豬生長性能、腸道形態(tài)和消化酶活性的影響

戰(zhàn)曉燕，張似青，田建興 ，穆長青，王連山

（1.上海農林職業(yè)技術學院，上海 201699；2.遼寧威蘭生物技術有限責任公司，遼寧 沈陽 110020；3.遼寧省動物衛(wèi)生監(jiān)督所，遼寧 沈陽 110020）

大量研究證實，飼料中添加高劑量氧化鋅可增加斷奶仔豬采食量，降低仔豬腹瀉，提高其生長性能[1-5]。但氧化鋅的生物學利用率低，日糧添加高鋅導致糞樣中鋅的殘留量過高，造成鋅資源的浪費并嚴重威脅環(huán)境[6-9]。此外，長期添加高劑量氧化鋅可給仔豬帶來些許負面效應如抑制乳仔豬后期生長、被毛凌亂等[10]。隨著目前對土壤環(huán)境的重視，農業(yè)部發(fā)布第2625號公告，來限制豬配合飼料中氧化鋅的添加量。因此，尋求新型添加劑以減少氧化鋅用量迫在眉睫。

過氧化氫酶（Hydrogenperoxidase）又稱觸酶（Catalase，CAT），是一類廣泛存在于動物、植物和微生物體內的末端氧化酶，是在生物演化過程中建立起來的生物防御系統(tǒng)的關鍵酶之一，在動物體內主要有抗氧化、抗應激、抗過敏和保護腸道黏膜的作用[11]，并在食品、醫(yī)藥、紡織、造紙、環(huán)保等行業(yè)具有重要的應用。目前過氧化氫酶在很多領域中都有涉及，但大多不具有生物活性，因此在動物中應用很少。研究表明，具有生物活性的過氧化氫酶可以促進動物采食、改善生長性能、減少動物營養(yǎng)性腹瀉[12-13]，對腸上皮細胞具有預防性保護作用和減輕腸道炎癥反應等[14-15]。

本試驗以28日齡斷奶仔豬為對象，將生物活性過氧化氫酶直接作為添加劑加入到仔豬日糧中，初步探索其對仔豬生長性能的影響，為生物活性過氧化氫酶的推廣應用提供一定的科學依據(jù)，對減少添加高鋅造成的環(huán)境污染具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 試驗材料本試驗所用生物活性過氧化氫酶（酶活為60 U/g）由遼寧威蘭生物技術有限責任公司提供。試驗動物購自于承德灤平康牧養(yǎng)殖公司。

1.2 動物試驗設計采用單因子完全隨機試驗設計，將40頭健康的28日齡三元雜斷奶仔豬按體重一致原則隨機分為4組，每組設2個重復，每個重復5頭豬，A組作為對照組，在基礎日糧中添加2 500 mg/kg氧化鋅，B、C、D組在基礎日糧中分別添加過氧化氫酶60 U/kg、90 U/kg、120 U/kg。試驗預試3 d，正式試驗30 d。試驗設計情況如表1。

表1 試驗設計Table 1Test design

1.3 基礎飼料配方參照美國NRC（1998）仔豬營養(yǎng)需要標準并結合生產實踐配制基礎日糧，具體日糧組成及營養(yǎng)水平見表2。

表2 試驗基礎日糧配方及營養(yǎng)水平Table 2 Test basic dietary formula and nutritional level

1.4 飼養(yǎng)管理試驗豬空腹稱重后，在養(yǎng)殖水平較好的同一棟封閉式豬舍內進行，溫濕度適宜；自由采食和飲水。免疫消毒程序按豬場常規(guī)方法進行。飼養(yǎng)管理參照該品種豬的飼養(yǎng)管理規(guī)程進行。

1.5 樣品采集與處理 在試驗期內每天對豬的采食量、余料量、腹瀉率等數(shù)據(jù)進行收集及記錄。實驗結束時屠宰仔豬，采集十二指腸、空腸、回腸各腸段腸道組織樣品保存于10%福爾馬林溶液進行形態(tài)學檢測。

1.6 指標測定與方法

1.6.1 生長性能測定

1.6.1.1 平均日增重（ADG） 試驗結束后稱重，稱重前禁食12 h，以重復為單位計算每個重復的豬只重量。記錄試驗中途死亡豬只數(shù)并稱重記錄死亡重量。計算公式如下：平均日增重（g/頭/d）=（平均末重-平均初重）/飼養(yǎng)天數(shù)。

1.6.1.2 平均日采食量（ADFI） 飼養(yǎng)試驗開始后，記錄每天的投料量和每天的剩料量，通過計算投料量和剩料量的差值，得到耗料量。發(fā)生死淘豬時及時結料并稱質量。計算公式如下：平均日采食量（g/頭/d）=（投料量-余料量）/（豬數(shù)×飼喂天數(shù)）。

1.6.1.3 料重比（F/G） 料重比計算公式為：料重比=試驗期總耗料重/試驗期總增重。

1.6.1.4 腹瀉率 腹瀉率計算公式為：腹瀉率（%）-［試驗全期腹瀉頭次/（試驗頭數(shù)×試驗天數(shù)）］×100%。

1.6.2 腸道形態(tài)檢測 將10%福爾馬林中固定后的十二指腸、空腸、回腸組織用蘇木精-伊紅染色法染色，熒光顯微鏡選擇典型視野拍攝圖片，并用Leica Qwin圖像分析系統(tǒng)進行觀察分析，每張切片測量絨毛高度（VH）和隱窩深度（CD），并計算VH/CD。每個樣本觀察兩個非連續(xù)切片，從不同的視野中選取10根完整的絨毛進行長度測量，并測定相應的隱窩深度，絨毛高度量取是從其頂端至根部，隱窩深度量取是從相鄰2根絨毛根部至基底部。

1.6.3 消化酶活性的測定 將仔豬屠宰，開腹后立即結扎十二指腸、空腸、回腸，從十二指腸、空腸、回腸采集部分食糜樣于液氮中速凍保存，-20℃?zhèn)溆?，用于測定蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的活性。

1.7 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)以均值±標準差表示，SPSS 22.0軟件進行ANOVA方差分析及Duncan’s法多重比較，P＜0.05差異顯著，P＜0.01差異極顯著。

2 結果和分析

2.1 過氧化氫酶對斷奶仔豬生長性能和腹瀉率的影響 由表3可見，與對照組相比，90 U/kg和120 U/kg過氧化氫酶組日增重極顯著提高（P＜0.01）；90 U/kg過氧化氫酶組日采食量極顯著提高（P＜0.01），但與60 U/kg和120 U/kg過氧化氫酶組無顯著差異（P＞0.05）；90 U/kg和120 U/kg過氧化氫酶組料重比分別降低2.67%和4.00%，差異顯著（P＜0.05，P＜0.01）；添加過氧化氫酶組對腹瀉率均無顯著影響（P＞0.05）。

表3 過氧化氫酶對斷奶仔豬生長性能和腹瀉率的影響Table 3Effect of catalase on growth performance and diarrhea rate of weaning piglets

表4 過氧化氫酶對斷奶仔豬腸道形態(tài)的影響Table 4 Effect of catalase on intestinal morphology of weaning piglets

2.2 過氧化氫酶對斷奶仔豬腸道形態(tài)的影響由表4可知，與對照組相比，60 U/kg過氧化氫酶組十二指腸VH顯著降低（P＜0.05）；三水平過氧化氫酶組空腸VH均極顯著提高（P＜0.01）；三水平過氧化氫酶對回腸VH均無顯著影響（P＞0.05）。與對照組相比，90 U/kg和120 U/kg過氧化氫酶組十二指腸CD分別降低13.34%和16.21%，差異極顯著（P＜0.01）；60 U/kg和120 U/kg過氧化氫酶組空腸CD明顯降低（P＜0.01）；60 U/kg過氧化氫酶組回腸CD提高不顯著（P＞0.05），90 U/kg和120 U/kg過氧化氫酶組十二指腸CD則極顯著降低（P＜0.01）。與對照組相比，90 U/kg和120 U/kg過氧化氫酶組十二指腸和回腸的VH/CD均極顯著提高（P＜0.01）；三水平過氧化氫酶對空腸VH/CD均有極顯著影響（P＜0.01）。

表5 過氧化氫酶對斷奶仔豬消化酶活性的影響Table 5Effect of catalase on digestive enzyme activity in weaning piglets

2.3 過氧化氫酶對斷奶仔豬消化酶酶活的影響由表5可知，與對照組相比，三水平過氧化氫酶組十二指腸、空腸和回腸的蛋白酶活性均極顯著提高（P＜0.01）；90 U/kg過氧化氫酶組十二指腸淀粉酶活性極顯著提高（P＜0.01）；90 U/kg過氧化氫酶組空腸淀粉酶活性提高了8.64%，差異顯著（P＜0.05）；三水平過氧化氫酶組回腸的淀粉酶活性均極顯著提高（P＜0.01）。60 U/kg過氧化氫酶組十二指腸脂肪酶活性極顯著提高（P＜0.01）；60 U/kg和120 U/kg過氧化氫酶組回腸脂肪酶活性顯著降低（P＜0.05）。由此推斷，在斷奶日糧中添加過氧化氫酶，可提高消化酶活性。

3 討論

3.1 過氧化氫酶對斷奶仔豬生長性能的影響傳統(tǒng)養(yǎng)殖生產模式中，仔豬斷奶約在4周齡。隨著飼養(yǎng)水平的提高，現(xiàn)代集約化養(yǎng)殖模式下，通常采用早期斷奶以提高母豬的繁殖性能，節(jié)約母豬飼養(yǎng)成本。但是早期斷奶給仔豬帶來多種應激，如仔豬與母畜的突然分離、轉群帶來的應激、由易消化吸收的動物蛋白向較難消化的植物蛋白過渡等。諸多應激使仔豬在短時間內減少釆食，甚至拒絕釆食。Brooks等[16]研究表明早期斷奶后24 h內僅有50%仔豬釆食，而在48 h后仍約有10%仔豬未進食。這可造成仔豬能量大量透支。仔豬在斷奶時體內的能量僅可以維持3 d，而由斷奶應激造成的能量損失約需要8～14 d方能恢復[17]。而斷奶仔豬的生長性能決定肥育豬的上市時間。因此，減少斷奶應激保證仔豬的正常生長顯得至關重要。

本試驗中所用生物活性過氧化氫酶屬于抗氧化酶的一種，具有體內抗氧化、清除自由基的作用，可以減少因仔豬斷奶導致的氧化應激產生的自由基對腸道上皮細胞的損傷，維護腸道健康完整，從而達到提高營養(yǎng)物質消化率的作用。方銳等[18]研究發(fā)現(xiàn)添加過氧化氫酶可以提高斷奶仔豬生產性能，降低仔豬料肉比，與添加氧化鋅對比無差異。而本試驗結果顯示與2 500 mg/kg氧化鋅相比，90 U/kg CAT極顯著提高斷奶仔豬日采食量和日增重（P＜0.01），同時對降低料重比也有明顯改善作用（P＜0.05），以此推斷一定劑量的生物活性過氧化氫酶（CAT）可以改善斷奶仔豬生長性能。

3.2 過氧化氫酶對斷奶仔豬腹瀉率的影響仔豬腹瀉主要有生理性腹瀉和病理性腹瀉兩種。生理性腹瀉主要是仔豬斷奶期間，面臨來自營養(yǎng)、心理和環(huán)境三個方面的應激，其中營養(yǎng)應激最為嚴重，不僅造成了斷奶后仔豬腸絨毛變短、隱窩變深、腸細胞凋亡，還會影響到仔豬的內分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和行為狀態(tài)等，同時也會造成仔豬腸道酶系活性和吸收功能的降低，導致仔豬嚴重營養(yǎng)不良[19-20]。病理性腹瀉主要是因仔豬腸道尚未建立穩(wěn)定的微生態(tài)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)，自身抵抗力較低，對外界刺激敏感，易受各種病原微生物的侵襲而導致病理性腹瀉。其中，大腸桿菌和輪狀病毒是最常見的病原微生物，次者為沙門氏菌、志賀氏菌等。

本試驗結果顯示，與2 500 mg/kg氧化鋅相比，3種添加劑量的水平過氧化氫酶對腹瀉率均無顯著差異（P＞0.05），表明生物活性過氧化氫酶同高劑量的氧化鋅一樣，具有高效的抗腹瀉作用，可以預防仔豬營養(yǎng)性腹瀉。經(jīng)大量研究證實，仔豬日糧中抗原及其它不良成分所引起的致敏反應才是引起仔豬斷奶腹瀉的罪魁禍首，而病原性微生物感染不是引起斷奶仔豬腹瀉的原發(fā)性病因，只是仔豬腸道發(fā)生損傷的繼發(fā)癥[21-22]。研究證明，早期的斷奶過程中機體氧化還原平衡系統(tǒng)被打破，自由基產生增加，抗氧化能力下降，導致氧化應激的產生[23]。氧自由基引發(fā)的脂質過氧化反應，導致細胞與組織的氧化損傷[24]，直接導致腸道上皮細胞受損，從而引起和加劇了斷奶仔豬腹瀉。生物活性過氧化氫酶具有對腸黏膜氧化應激造成的炎性損傷有保護作用，明顯抑制炎癥所導致的腸黏膜細胞的凋亡[25]，這可能是生物活性過氧化氫酶（CAT）具有抗腹瀉作用的主要原因。

3.3 過氧化氫酶對斷奶仔豬腸道形態(tài)的影響據(jù)報道，早期斷奶會誘導仔豬腸上皮細胞過氧化，腸上皮細胞抗氧化酶活性降低，導致腸絨毛-隱窩結構損傷和修復更新受阻，在形態(tài)結構上表現(xiàn)為絨毛萎縮，隱窩加深[26]。豬的腸道形態(tài)尤其是絨毛的長度和隱窩深度，是影響豬腸道健康和生長性能的重要指標。絨毛邊緣可分泌多種消化酶，因此，絨毛越長動物的消化吸收能力越強。隱窩深度決定腸絨毛有絲分裂生成上皮細胞的速度，反映細胞生成率，而隱窩變淺，表明細胞成熟率上升，分泌功能增強。因此，絨毛高度與隱窩深度的比值可綜合反映小腸消化吸收功能狀況。比值下降，黏膜很可能受損，消化吸收能力下降，常會伴隨有腹瀉、生長受阻現(xiàn)象；而比值升高，腸道上皮細胞數(shù)量增加，腸道吸收面積增大，進而提高營養(yǎng)物質的吸收利用率，同時也有利于功能性物質的合成。

Carlson等[27]報道，補飼高劑量氧化鋅能改善腸道形態(tài)，使腸道隱窩變淺，絨毛變長。同時研究發(fā)現(xiàn)，3 000 mg/kg氧化鋅能顯著增加小腸黏膜的絨毛高度[28]。過氧化氫酶作為抗氧化酶，可以修復因斷奶導致的細胞過氧化而造成的絨毛萎縮，隱窩加深。據(jù)報道，過氧化氫酶可以提高腸道絨毛高度，降低隱窩深度，且提高二者的比值[18]。本試驗結果顯示，與2 500 mg/kg氧化鋅相比，90 U/kg和120 U/kg過氧化氫酶組顯著提高空腸絨毛高度、降低十二指腸和回腸隱窩深度，同時絨毛高度與隱窩深度的比值顯著升高（P＜0.01），表明生物活性過氧化氫酶（CAT）對腸道的絨毛長度和隱窩深度有一定的促生長作用，進而促進斷奶仔豬對營養(yǎng)物質的吸收利用，且效果優(yōu)于高劑量的氧化鋅，這與斷奶仔豬在生長性能上表現(xiàn)的結果一致。過氧化氫酶作為抗氧化酶的一種，具有增強腸道上皮細胞抗氧化的功能，從而有助于上皮細胞的增殖分化，促進絨毛-隱窩結構的發(fā)育。

3.4 過氧化氫酶對斷奶仔豬消化酶酶活的影響仔豬在0～4周齡，隨著日齡的增長，仔豬胃、腸、胰及小腸食糜中的消化酶活性幾乎成倍增長[33]。這與哺乳期消化器官組織快速生長發(fā)育有關。然而，斷奶無論發(fā)生在2、3、4、5周齡，組織器官和食糜中各種消化酶活性均降低到斷奶前的1/3水平，經(jīng)過2周恢復之后，除胰脂肪酶外，大多數(shù)消化酶均可恢復甚至超過斷奶前的水平，而胰脂肪酶活性在斷奶后2～3周內無明顯增長或增長很少。研究表明，消化酶這種發(fā)育規(guī)律趨勢與分泌這些酶的組織如小腸、胰臟生長發(fā)育規(guī)律趨勢極其相似[29-32]。這說明早期斷奶引起的胃腸道消化酶活性降低，很可能是合成和分泌這些酶的組織、器官發(fā)育受抑制的緣故。

本試驗結果顯示，與2 500 mg/kg氧化鋅相比，三水平過氧化氫酶組蛋白酶活性均極顯著提高（P＜0.01）；三水平過氧化氫酶組淀粉酶活性具有整體升高的趨勢，其中90 U/kg過氧化氫酶組十二指腸、空腸和回腸的淀粉酶活性差異顯著，分別提高了10.14%、8.64% 和 15.14%（P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01）；60 U/kg過氧化氫酶組十二指腸的脂肪酶活性顯著提高5.00%（P＜0.05）。結果表明，生物活性過氧化氫酶（CAT）可提高斷奶仔豬消化道消化酶活性，使小腸仍具有良好的消化吸收能力，飼糧中的營養(yǎng)物質得到充分的利用，因此有效提高仔豬的生長性能，這也與本試驗結果相符。

4 結論

綜上所述，在日糧中添加具有生物活性的過氧化氫酶可明顯促進腸道絨毛-隱窩結構的發(fā)育，提高消化酶活性，降低腹瀉率，從而改善生長性能。這在實際生產中極具使用價值，可作為減少高劑量氧化鋅使用量的新型添加劑推廣和應用。本試驗條件下，生物活性過氧化氫酶最適宜添加量應為酶活90 U/kg。