野生瑤山亞種樹鼩實驗室馴養(yǎng)繁殖研究

黃正團，蘇傲蕾，袁小芳，曹穎穎

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥科學(xué)實驗中心，廣西 南寧 530200；2.廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530023）

樹鼩實驗動物化種群的培育與利用是近年來實驗動物研究領(lǐng)域的熱點。我國樹鼩的實驗室馴化、飼養(yǎng)和繁殖最早見于1981年吳小閑等[1]的文獻報道。從中國知網(wǎng)檢索到的16篇與樹鼩馴化繁殖密切相關(guān)的文獻都是基于云南滇西亞種樹鼩（Tupaia belangeri chinensis）開展的相關(guān)研究，而關(guān)于瑤山亞種樹鼩（Tupaia belangeri yaoshanensis）的實驗室馴養(yǎng)繁殖方面的研究目前還沒有相關(guān)的文獻報道。瑤山亞種樹鼩與中緬樹鼩其他亞種的外形有較大的差異，其體型是我國6個中緬樹鼩亞種中最大的[2-3]，并且其生物學(xué)特性如乳酸脫氫酶（LDH）同功酶等與其他亞種存在較大的差異[4]。筆者開展了野生瑤山亞種樹鼩的實驗室飼養(yǎng)馴化試驗，對實驗室飼養(yǎng)條件下瑤山亞種樹鼩的馴養(yǎng)繁殖關(guān)鍵技術(shù)進行了研究，以期為更好地推進瑤山亞種樹鼩飼養(yǎng)培育提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 野生瑤山亞種樹鼩馴化飼養(yǎng)

1.1.1 樹鼩來源：野生瑤山亞種樹鼩來源于模式產(chǎn)地廣西金秀大瑤山，于2013年10月—2016年12月捕獲，主要在秋冬季節(jié)獵捕。

1.1.2 樹鼩實驗室馴化飼養(yǎng)籠：不銹鋼樹鼩籠（380 mm×260 mm×300 mm）， 每籠后面帶有 PVC休息箱（200 mm×100 mm×140 mm）。

1.1.3 實驗室飼養(yǎng)環(huán)境：普通開放環(huán)境動物房，裝有空調(diào)和排風扇，房間有備用除濕機。成年瑤山樹鼩飼養(yǎng)室內(nèi)溫度控制在15～25℃，室內(nèi)濕度控制在45%～70%。晴天時可將窗口打開，但應(yīng)確保紗窗關(guān)閉；陰天時則采用風機進行間斷性通風，晚上關(guān)閉。每天用150 W日光燈人工光照12 h（7:30—19:30）。室內(nèi)禁止發(fā)出任何人為的響動，開門、關(guān)門必須最大限度地減少噪音。飼養(yǎng)員在室內(nèi)應(yīng)將手機設(shè)置為振動模式，并且禁止接聽和撥打電話。注意觀察記錄樹鼩飼養(yǎng)房內(nèi)的溫度、濕度、通風情況、氨濃度變化及飼養(yǎng)密度等。

1.1.4 馴化飼養(yǎng)

1.1.4.1 飼養(yǎng)人員防護：野生瑤山樹鼩存在病原微生物攜帶的不確定性，為了保證飼養(yǎng)人員的安全，必須做好個人防護工作。進入工作區(qū)前必須穿戴好防護裝備，包括工作服、頭套、口罩、一次性薄膜手套以及深筒水靴。

1.1.4.2 飼養(yǎng)馴化過程：新引入的野生瑤山樹鼩第1周主要飼喂蘋果、梨、蘿卜、西瓜、黃瓜等果蔬，在飼料盒中添加少量飼料；第2周開始逐步增加飼料供給量（每天每只10 g左右）；第3、4周進一步增加飼料供給量；第5周過渡到以飼料為主、果蔬為輔的日常飼養(yǎng)方式。飼養(yǎng)馴化過程中應(yīng)特別注意保持環(huán)境安靜，同時密切觀察野生瑤山樹鼩的健康狀況和采食狀況，出現(xiàn)特殊情況時要及時調(diào)整飼養(yǎng)馴化進度。

1.1.4.3 日常飼養(yǎng)管理：基礎(chǔ)日糧（配合飼料）購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物研究所；飼喂時間及方法為：8：00—10：00 飼喂配合飼料，飼喂量為 25 g/只；14：30—15：00 飼喂果蔬，飼喂量為 40 g/只；15：00—15：30飼喂配合飼料，飼喂量為15 g/只。飼喂量應(yīng)充分滿足瑤山樹鼩正常新陳代謝的需要，切忌浪費，增加不必要的成本。定時、定量給予樹鼩食物，盡量降低樹鼩因飼喂時間和量的不同所造成的應(yīng)激，以保障樹鼩正常的生長、發(fā)育、繁殖。按需供給純凈水，每天按時更換。

1.1.4.4 日常衛(wèi)生管理：盛料槽必須保證清潔、衛(wèi)生、無污染，定期用優(yōu)氯凈液浸泡清洗（2～3次/周）。蘋果用高錳酸鉀液或優(yōu)氯凈液浸泡10 min后清洗干凈，切塊飼喂。每次喂料前將剩余飼料倒出，加入新料（同時做食欲記錄）；蘋果飼喂后若有剩余必須撿出。每天早上清掃糞便后飼喂。最好每天對地面進行1次噴霧消毒，每月對飼養(yǎng)房進行1次徹底消毒。

1.2 野生瑤山亞種樹鼩繁殖

1.2.1 繁殖籠：每個籠架放置8個不銹鋼樹鼩籠（400 mm×550 mm×600 mm）， 每籠右側(cè)帶有 1個PVC 材質(zhì)的休息箱（250 mm×250 mm×180 mm），對待產(chǎn)的母樹鼩，在其巢箱內(nèi)放入高壓滅菌過的稻草，供其做窩產(chǎn)仔并保持溫度。

1.2.2 選種：瑤山亞種種樹鼩選擇體況好，無傷殘，被毛光亮的個體，母樹鼩乳頭大且均勻，公樹鼩睪丸明顯。另外，還要注意不選擇有下列情況的樹鼩作為種用：被毛臟亂、無光澤或脫毛的樹鼩；體況過于消瘦或肥胖的母樹鼩，體重偏離正常范圍（160～210 g）；骨盆腔狹窄的母樹鼩；陰莖過短或隱睪的公樹鼩。

1.2.3 配種：根據(jù)樹鼩籠大小，采用1∶1的公母比例進行交配繁殖。選種后，將公樹鼩和母樹鼩從飼養(yǎng)籠一起轉(zhuǎn)移到繁殖籠中，母樹鼩懷孕后在繁殖籠中待產(chǎn)，移走公樹鼩；2—6月期間，若配對合籠1個月后不懷孕則取出公母樹鼩單獨飼養(yǎng)，清理消毒繁殖籠1周后重新挑選公樹鼩和母樹鼩進行配對，其余月份則是配對合籠2個月后不懷孕重新配種合籠。剛開始配種合籠時要密切觀察有無異常表現(xiàn)，若有異常，則應(yīng)及時采取妥善處理措施。選配不當者及時調(diào)配，對咬傷情況要早發(fā)現(xiàn)、早治療，并向獸醫(yī)報告。

1.2.4 懷孕檢查：公母瑤山樹鼩合籠后，每周按時稱重，若體重連續(xù)2周增加10 g以上，腹部觸診可觸及腹部膨隆，初步判斷為母樹鼩懷孕。體重連續(xù)增加的母樹鼩，用手觸摸檢查2～3次，以確定母樹鼩妊娠，檢查發(fā)現(xiàn)母樹鼩懷孕后公母分籠，留母樹鼩在繁殖籠中待產(chǎn)。

1.2.5 種樹鼩的飼養(yǎng)管理：在樹鼩日常飼養(yǎng)管理的基礎(chǔ)上，配種合籠期間、妊娠期間和哺乳期間，飼喂的基礎(chǔ)飼料和果蔬要根據(jù)樹鼩個體差異酌情增減飼喂量。每日16：30—17：30增加飼喂面包蟲5～10 g/d。做好分娩前準備，樹鼩懷孕期為 45～50 d，分娩前10 d左右應(yīng)將棉布或稻草放入暗盒。

1.2.6 仔樹鼩的哺乳與管理

表1 野生瑤山亞種樹鼩馴化飼養(yǎng)體重變化（n=30） g

1.2.6.1 仔樹鼩的哺乳：仔樹鼩一般情況下由母樹鼩母乳哺乳，每天早晚2次觀察幼仔情況，若發(fā)現(xiàn)幼仔爬出巢箱，及時將其放回，以防餓死或凍死；若發(fā)現(xiàn)有母樹鼩咬死幼仔，則將被咬死的幼仔及時取出，并立即用清水清洗巢箱，注意動作輕柔，避免驚擾母樹鼩及其他幼仔；若母樹鼩母性不好，連續(xù)咬食幼仔或不哺育幼仔，則取出幼仔進行母樹鼩被動哺乳，配合喂食配方奶。

1.2.6.2 仔樹鼩的管理

①將母樹鼩和仔樹鼩分離飼養(yǎng)。將暗盒前的隔板放下，使母樹鼩不能進入暗盒，即可實現(xiàn)與仔樹鼩的分離。通常情況下，母樹鼩產(chǎn)下仔樹鼩，待其喂飽奶后，飼養(yǎng)人員用棉布包裹仔樹鼩，放在暗盒中，將母樹鼩趕離暗盒并將暗盒前的隔板放下。每天定時將包裹仔樹鼩的棉布取出，將仔樹鼩放回暗盒，打開隔板讓母樹鼩進入暗盒中給仔樹鼩哺乳1次，哺乳時間為15～20 min。哺乳完畢后將母樹鼩趕出暗盒，放下隔板，并將仔樹鼩用棉布再次包裹好。特別注意，若仔樹鼩吃母乳較少則應(yīng)每天飼喂1次。仔樹鼩出生25 d后可以不用再將仔母隔離，可共同飼養(yǎng)。對于母樹鼩母性不好或連續(xù)咬食幼仔的情況，通常采用該種管理模式。

②母樹鼩和仔樹鼩混合飼養(yǎng)。要特別注意不能驚擾樹鼩（不做每天開籠觀察，飼喂打掃動作盡可能快、輕）。但可每隔5 d打開暗盒觀察墊料，若發(fā)現(xiàn)墊料被糞尿污染嚴重，可將仔樹鼩輕輕撥至暗盒一角，更換墊料，但不能觸碰或拿出仔樹鼩。

1.2.6.3 仔樹鼩環(huán)境條件的管理：保證樹鼩幼仔成活的關(guān)鍵因素之一就是要全年保持飼養(yǎng)室溫度在24～27℃，同時應(yīng)注意夜間保溫；重視飼養(yǎng)室的環(huán)境衛(wèi)生，每天定時清潔、消毒籠具，按時更換、洗消喂食槽及飲水瓶；每天定時進入飼養(yǎng)室喂養(yǎng)、觀察，減少工作人員的驚擾，保持飼養(yǎng)室內(nèi)安靜。

1.2.7 離乳及繁殖觀察記錄：一般仔樹鼩出生后40～45 d可以離乳，個別可以延長到50 d。離乳當天仔母分籠，可將母樹鼩返回原籠；同一窩仔樹鼩放在同一個籠中飼養(yǎng)。5～10 d后再將同一籠中的仔樹鼩分籠并編號，進行單籠單只飼養(yǎng)。

給所有樹鼩統(tǒng)一編號，記錄母樹鼩的配種合籠日期、生產(chǎn)日期、每胎產(chǎn)仔數(shù)、哺育情況及時間、離乳成活數(shù)、后代公母數(shù)量及比例等，同時注意觀察其飲食情況、母性好壞等，篩選出適合繁育的種樹鼩，注意在觀察時動作輕柔、安靜，避免驚擾樹鼩。

1.3 樹鼩飼養(yǎng)籠的清洗消毒

飼養(yǎng)人員每個月逐一對飼養(yǎng)籠至少進行1次徹底的清洗消毒，在整個過程中飼養(yǎng)人員必須穿戴好工作服、帽子、口罩、橡膠手套、深筒水靴以及防水衣。將瑤山樹鼩轉(zhuǎn)移至清洗消毒好的飼養(yǎng)籠，工作人員相互配合將飼養(yǎng)籠取下并轉(zhuǎn)移至清洗消毒室。對飼養(yǎng)籠進行無死角清洗。清洗完畢后將飼養(yǎng)籠放入消毒池浸泡30 min以上。84消毒液按2%濃度配比后浸泡飼養(yǎng)籠，過氧乙酸液按0.5%濃度配比后浸泡飼養(yǎng)籠。飼養(yǎng)籠浸泡后再次用清水徹底清洗。最后將飼養(yǎng)籠放至儲存間備用。飼養(yǎng)架于房間內(nèi)用抹布擦洗干凈后用三氯異氰尿酸按1∶1 000～1∶2 000 的濃度進行噴霧消毒。

2 結(jié)果與分析

2.1 馴化飼養(yǎng)結(jié)果

2.1.1 野生瑤山亞種樹鼩實驗室飼養(yǎng)的成活情況：筆者于2014—2016年在廣西金秀大瑤山捕獲野生瑤山亞種樹鼩181只，有6只由于捕捉或運輸途中受傷，到實驗室很快死亡；剩余的175只經(jīng)過1個多月的馴化飼養(yǎng)成活168只，其中，雄性79只、雌性89只。野生瑤山亞種樹鼩成活率達到96%，經(jīng)過馴化飼養(yǎng)后的野生瑤山亞種樹鼩體重變化平穩(wěn)，基本不再出現(xiàn)死亡。

2.1.2 野生瑤山亞種樹鼩馴化飼養(yǎng)體重變化：由表1和圖1可知，在引進的半個月內(nèi)，野生瑤山亞種樹鼩體重增長快，平均增重達到50 g左右；至1個月時，體重增長達到上限。結(jié)果表明，相對于野外，實驗室飼養(yǎng)提供的食物、環(huán)境能滿足瑤山亞種樹鼩的需求。經(jīng)過4個月實驗室飼養(yǎng)馴化，野生樹鼩逐漸適應(yīng)實驗室喂食及飼養(yǎng)條件，整體體重基本趨于平穩(wěn)，在可以接受的范圍內(nèi)稍有下降10 g左右。

圖1 野生瑤山亞種樹鼩馴化飼養(yǎng)體重變化曲線

表2 2016年瑤山亞種樹鼩生產(chǎn)情況

2.2 繁殖飼養(yǎng)結(jié)果

2.2.1 懷孕后母樹鼩體重和采食情況變化：分析了12窩懷孕母樹鼩的體重變化，結(jié)果表明，體重最多增加65.8 g，最少增加25.9 g，平均增加49.3 g。懷孕前2周，樹鼩體重變化不大，從懷孕第3周起，樹鼩體重呈現(xiàn)明顯增加趨勢，到生產(chǎn)前2周，體重增加更為顯著。至分娩前最后一次稱重，最高體重215.3 g，最低體重168.7 g，平均體重189.7 g。孕期母樹鼩食量變化不大，從懷孕第3周開始，孕期母樹鼩食量逐漸增加，產(chǎn)前母樹鼩食量下降。

2.2.2 受孕和生產(chǎn)情況：2016年瑤山種樹鼩配對合籠共53次，母樹鼩受孕13次，配種受孕率為24.53%，中途流產(chǎn)1只，未見死胎，順利分娩12胎。由表2可知，試驗期間共產(chǎn)仔42只，每只雌樹鼩受孕1～3次，每窩產(chǎn)仔3～5只，平均3.5只；出生存活數(shù)為39只，出生存活率為92.86%，離乳存活數(shù)為18只，離乳存活率為42.86%。樹鼩懷孕期為39～63 d，平均46.5 d，分娩時間不固定。結(jié)果表明，瑤山亞種樹鼩全年都可以配種繁殖，沒有明顯的季節(jié)影響，但以4—6月繁殖最為集中，1年可以繁殖3胎。

2.2.3 哺乳期觀察結(jié)果：幼仔出生平均體重為（12.15±1.56）g，剛出生的小樹鼩全身無毛，閉眼，皮膚呈粉紅色半透明狀，可見大部分內(nèi)臟器官，僅會蠕動；出生后5～6 d皮膚變黑，有皺紋；8～13 d長出黃褐色絨毛；22～25 d可睜眼；27～30 d可爬到巢箱外找尋食物；35～40 d可離開母樹鼩獨立生活，此時可斷奶，分籠飼養(yǎng)。幼仔離乳時體重最高為82.6 g，最低為51.0 g，平均體重為68.7 g。

3 討論

樹鼩比犬、鼠等動物與人的親緣關(guān)系更接近，樹鼩的解剖、生理、腦神經(jīng)和視覺神經(jīng)與人相似。Park 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，人類 p53（與 HBV 感染相關(guān)）與樹鼩p53的氨基酸序列同源性和核酸序列同源性分別為93.4%和91.7%，而與小鼠p53的同源性則分別為73.7%和77.2%。研究表明，樹鼩更適合在生物醫(yī)學(xué)研究中做人類的“替身”，對人類許多疾病比較易感，能自發(fā)地或經(jīng)人工誘導(dǎo)建立人類疾病的動物模型，特別是對乙型肝炎、丙型肝炎這類宿主范圍狹窄的人類疾病，樹鼩表現(xiàn)出很好的模型特質(zhì)，因此，受到廣大生命科學(xué)工作者的重視。

實驗動物是生物醫(yī)學(xué)研究的實驗材料。使用實驗動物進行各項生命科學(xué)研究的最關(guān)鍵問題就是能夠?qū)崿F(xiàn)動物實驗結(jié)果的可靠性、重復(fù)性、規(guī)律性，可以精確統(tǒng)計分析試驗結(jié)果，得出正確的結(jié)論。樹鼩實驗動物化是實現(xiàn)應(yīng)用樹鼩開展實驗獲得可靠結(jié)果的保障，樹鼩的馴化繁殖是樹鼩實驗動物化的基礎(chǔ)性工作。云南地區(qū)較早開展人工馴養(yǎng)繁殖樹鼩工作，在樹鼩實驗動物化培育領(lǐng)域取得了較大的進展[6]。國內(nèi)相關(guān)研究單位培育研究的對象主要是滇西亞種樹鼩，而筆者所在的研究單位是以瑤山亞種樹鼩為研究對象。不同樹鼩亞種資源因為遺傳組成多樣性以及生物學(xué)特性不同，可以滿足人類不同科研活動的需要，而實驗動物資源是實驗動物學(xué)科為相關(guān)學(xué)科提供支撐的核心內(nèi)容[7]，因此，對野生瑤山亞種樹鼩進行馴化及規(guī)?；斯し敝?，培育符合實驗動物要求的瑤山亞種樹鼩，可以進一步豐富實驗動物資源。

筆者從2014年開始進行野生瑤山亞種樹鼩的馴化培育研究，綜合前期及該研究結(jié)果表明，瑤山樹鼩實驗室馴化飼養(yǎng)是成功的，解決了野生瑤山亞種樹鼩馴化飼養(yǎng)技術(shù)關(guān)鍵問題；實驗室繁殖工作取得一定的突破，但結(jié)果尚不理想，主要問題是配種受孕率低 （24.53%）和離乳成活率低（42.86%）。文獻報道的滇西亞種配種受孕率達到 80% 以 上[8]，離乳成活率達到 94.6%[9]，因此，實驗室條件下瑤山亞種樹鼩繁殖方面存在的相關(guān)問題仍有待深入研究。

對于種樹鼩的選擇，筆者的經(jīng)驗是要選擇母性好的母樹鼩與繁殖性能正常且性情溫順的公樹鼩建立繁育基礎(chǔ)種群，以公母1∶1的比例進行配種交配繁育；在實際繁育工作中觀察到，母樹鼩母性好壞差異很大，母性好的樹鼩會產(chǎn)仔于巢箱內(nèi)，并及時喂乳，較少發(fā)生咬食幼仔情況；母性差的則會產(chǎn)仔于巢外或產(chǎn)后不哺乳，甚至?xí)蛞烙鬃?，嚴重影響繁育結(jié)果。因此，要挑選母性好的種母樹鼩進入瑤山亞種樹鼩繁育基礎(chǔ)種群，母性差的不進入繁育基礎(chǔ)種群。對于瑤山亞種樹鼩繁殖力，目前得到的配對合籠的母樹鼩受孕率較低，分析影響母樹鼩繁殖率的因素主要是環(huán)境和營養(yǎng)。俞發(fā)榮等[10]研究表明，環(huán)境壓力能損傷睪丸組織結(jié)構(gòu)，抑制樹鼩睪酮形成；馬玉華等[11]研究發(fā)現(xiàn)，采用30～100 lx光照強度可使母樹鼩的懷孕率高達91.67%。周化愚等[12]研究表明，樹鼩飼料蛋白水平達到24%時能顯著提高母樹鼩受孕率。筆者下一步將研究改進優(yōu)化瑤山樹鼩的飼養(yǎng)環(huán)境條件，提供科學(xué)全面的營養(yǎng)供給，以提高瑤山亞種樹鼩的繁殖力。

仔樹鼩被母樹鼩咬食或拒絕哺乳，分析其原因可能是：優(yōu)勝劣汰的選擇，若母樹鼩產(chǎn)仔后乳汁不能哺乳所有的幼仔，其會咬死先天體弱的幼仔（通常不會吃掉幼仔），以保證其他幼仔的正常母乳供應(yīng)；母樹鼩母性不好；沒有喂食足量的食物，母樹鼩因饑餓咬食幼仔。筆者對母性不好、拒絕哺乳的母樹鼩曾嘗試用仔樹鼩被動哺乳聯(lián)合人工配方奶哺乳，方法是將幼仔放入自制巢箱內(nèi)，每天2次捕抓母樹鼩行被動哺乳，母乳不足則加喂配方奶，結(jié)果幼仔在十幾天內(nèi)逐漸消瘦直至全部死亡。分析該種飼養(yǎng)哺乳方式存在如下問題：①樹鼩母乳成分脂肪含量高達26.01%[13]，配方奶與母乳成分明顯不同，不能完全滿足幼仔生長發(fā)育的營養(yǎng)需要，導(dǎo)致仔樹鼩人工哺乳失敗。②自制巢箱不能滿足幼仔生長的環(huán)境需求，容易潮濕污染，不容易判斷幼仔是否食飽。放置木質(zhì)產(chǎn)仔箱是保證幼仔成活的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[8]。③耗時、費力，容易驚擾母樹鼩及幼仔?，幧絹喎N母樹鼩主動哺乳符合動物的天性，且省時、省力、經(jīng)濟，母乳能滿足幼仔生長發(fā)育的需要，而且母乳喂養(yǎng)可以使幼仔獲得足夠的安全感。在該研究中，離乳成活的18只仔樹鼩都是采用母樹鼩主動哺乳的方法，這樣省去了被動哺乳聯(lián)合人工配方奶哺乳投入的大量人力和物力，也提高了瑤山亞種仔樹鼩離乳成活率。

當前，野生瑤山亞種樹鼩的實驗室馴養(yǎng)繁殖中仍存在母樹鼩配種受孕率低和仔樹鼩存活率低兩大問題，因此，還需要進行進一步的深入研究。今后將重點開展以下兩方面的工作，一是優(yōu)化實驗室環(huán)境和營養(yǎng)條件，分析母樹鼩食仔和拒絕哺乳的原因，提高樹鼩的離乳存活率；從產(chǎn)前準備以及孕期、產(chǎn)后飲食等方面完善馴養(yǎng)方案，以提高母乳喂養(yǎng)的成活率。